一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103525950 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525950 A (21)申请号 201310504021.2 (22)申请日 2013.10.23 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 211189 江苏省南京市玄武区四牌楼 2 号 (72)发明人 孟继鸿 余文敏 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 沈振涛 (54) 发明名称 一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 R。

2、T-PCR 引物对及其应用 (57) 摘要 本发明提供的一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对， 包括 ： 上游引物序列 为 ： 5 -TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3 ； 下游引物序 列为 ： 5 -CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3 ； 其中 R 为 A 或 G， M 为 A 或 C。本发明还提供了一种用于鉴 别CVA6和非CVA6肠道病毒的双重一步法引物， 包 括权利要求1所述的RT-PCR引物对以及肠道病毒 通用引物。 应用本发明提供的用于鉴别CVA6和非 CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对， 能够实现一次性 完成 CVA。

3、6 型与非 CVA6 型肠道病毒相关基因的扩 增， 显著提高CVA6型与非CVA6型手足口病的检测 效率， 敏感性好、 特异性高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103525950 A CN 103525950 A 1/1 页 2 1. 一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对， 其特征在于 ： 上游引物序列为 ： 5 -TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3。

4、 ； 下游引物序列为 ： 5 -CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3 ； 其中 R 为 A 或 G， M 为 A 或 C。 2. 一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的双重一步法引物， 其特征在于 ： 包括权利 要求 1 所述的 RT-PCR 引物对以及肠道病毒通用引物。 3. 如权利要求 2 所述的用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的双重一步法引物， 其特征 在于 ： 所述肠道病毒通用引物为 ： 引物 F 序列为 ： 5 -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3 ； 引物 R 序列为 ： 5 -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3。

5、 ； 其中， W 为 A 或 T。 4. 权利要求 1 所述的用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对在 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒检测中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103525950 A 2 1/7 页 3 一种用于鉴别CVA6和非CVA6肠道病毒的RT-PCR引物对及 其应用 技术领域 0001 本发明属于病毒核酸检测领域， 特别涉及一种用于单管二重一步法鉴别手足口病 病原 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对， 还涉及该利用该引物的应用。 背景技术 0002 手足口病 （hand foot and mouth diseas。

6、e， HFMD） 是由肠道病毒引起的急性传染 病， 主要发生于3岁以下儿童， 临床表现为手、 足、 口腔等部位的疱疹。 2012中国疾病控制中 心公布全国共发生手足口病 2198442 例， 死亡 709 人。引起手足口病的肠道病毒有多种， 如 柯萨奇病毒 A 组的 16、 4、 6、 10、 12， 柯萨奇病毒 B 组的 2、 3、 5， 埃可病毒的 4、 19、 30， 以及肠 道病毒 71 型 （Enterovirus71， EV71） 等。在我国， 根据以往的流行病学监视， EV71 和 CVA16 是引起手足口病爆发的主要病原， 在不同年份、 不同地点循环反复出现， 但 2011 年。

7、 9-12 月 其他肠道病毒构成明显增加。Yang F 等对中国不同地区手足口病进行研究， 发现 CVA6（柯 萨奇病毒 A6 型） 和其他肠道病毒感染有增加趋势。Lu QB 等人发现肠道病毒 CVA6 和 CVA10 可能成为中国手足口病新的流行病原。2012 年 8-12 月江西九江市爆发手足口病， 本实验 室在九江共收集到 704 份 （每人一份） 手足口病咽拭子标本和 200 份病人血清， 通过 RT-PCR 检测咽拭子标本， 测序证实 CVA6 感染 512 份。我国 CVA6 引起的手足口病正在逐年增多， 病 情复杂， 而且在我国九江地区已出现爆发流行。由于其他地区的人群缺少 CV。

8、A6 的抗体， 再 加上不同地区的人员流动大， 很可能会向其他地区扩散。CVA6 已逐渐成为引起手足口病爆 发的主要病原之一。 0003 CVA6 感染和其他肠道病毒感染在临床症状上差别较大， CVA6 感染患者分布部位 广， 均出现手足口和臀部密集的大疱状皮疹， 还可伴指甲脱落和指端皮肤表层脱皮， 此外呼 吸道症状、 消化道症状、 肝功能受损较 EV71、 CVA16 型多， 但是心血管和神经系统的损害较 少、 较轻。早期、 快速、 简便、 准确地鉴别 CVA6 型和非 CVA6 型手足口病， 对于积极的临床救 治和疫情防控具有重要意义。 0004 传统的病原学诊断采用细胞培养分离和鉴定病毒。

9、的手段， 耗时且操作复杂， 无法 满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。 分子生物学的进展开拓了肠道病毒的快速诊 断技术， 特别是 PCR 技术， 由于其具有检测材料用量少、 快速、 灵敏度高、 特异性好等特点， 在病毒感染的诊断中发挥越来越重要的作用。 RT-PCR技术已成为手足口病病原体快速诊断 的重要手段， 市场上已有 EV71、 CVA16 和肠道病毒 （EV） 的商业化 PCR 试剂盒， 但特异性诊断 CVA6 的 PCR 试剂盒尚未出现。此外， 只检测一种病原的 RT-PCR， 很容易造成其它病原体的 漏诊 ； 若要同时检测多种病原， 则每个检测都要单独进行， 要使用多个 PCR。

10、 管， 繁琐费时、 试 剂消耗大、 操作步骤多、 容易造成实验失败和 PCR 污染。如能建立一种特异性好、 灵敏度高 的单管二重一步法 RT-PCR， 鉴别 CVA6 型和非 CVA6 型手足口病， 将具有广泛的应用前景。 发明内容 说 明 书 CN 103525950 A 3 2/7 页 4 0005 发明目的 ： 本发明的目的在于提供一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物。 0006 本发明的第二目的在于提供上述引物在单管二重一步法检测CVA6和非CVA6肠道 病毒中的应用。 0007 技术方案 ： 本发明提供的一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病。

11、毒的 RT-PCR 引物 对， 包括 ： 0008 上游引物序列为 ： 5 -TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3 ； 0009 下游引物序列为 ： 5 -CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3 ； 0010 其中 R 为 A 或 G， M 为 A 或 C。 0011 本发明还提供了一种用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的双重一步法引物， 包括 权利要求 1 所述的 RT-PCR 引物对以及肠道病毒通用引物。 0012 其中， 所述肠道病毒通用引物为 ： 0013 引物 F 序列为 ： 5 -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3 ； 0014 引物。

12、 R 序列为 ： 5 -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3 ； 0015 其中， W 为 A 或 T。 0016 本发明还提供了上述用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对在 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒检测中的应用。 0017 本发明还提供了一种包括权利要求 1 所述的用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对的试剂盒。 0018 有益效果 ： 应用本发明提供的用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物 对， 能够实现一次性完成 CVA6 型与非 CVA6 型肠道病毒相关基因的扩增， 显著提。

13、高 CVA6 型 与非 CVA6 型手足口病的检测效率， 敏感性好、 特异性高。 0019 利用本发明提供的用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的双重一步法引物， 可以 对 CVA6 感染患者的临床标本扩增出 CVA6VP1 区域的 685bp 和肠道病毒 5 UTR 基因区域的 306bp 两条目的片段， 而对非 CVA6 的其它肠道病毒感染患者的临床标本只能扩增出肠道病 毒5 UTR基因区域的306bp一条目的片段， 从而能够特异性的一次性鉴别出CVA6和非CVA6 肠道病毒。 0020 具体而言， 本发明相对于现有技术具有以下突出的优势 ： 0021 （1） 本发明提供的用于鉴别。

14、 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的 RT-PCR 引物对完全是人工 设计的简并碱基和序列， 能够扩增出来自不同病人、 不同标本中CVA6或/和EV， 检测灵敏度 高， 特异性好 ； 0022 （2） 本发明提供的用于鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒的双重一步法引物由两对引 物对组成， 反应同时在一个 PCR 管内进行， RNA 逆转录和 DNA 扩增同在一个 PCR 管完成， 快 速简便， 且工作量比一次性普通 RT-PCR 少， 减少各种操作失误发生的可能， 提高检测的成 功率 ； 可早期有效鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒引起的手足口病 ； 0023 （3） 利用该引物。

15、鉴别 CVA6 和非 CVA6 肠道病毒所需耗材和试剂用量显著少于传统 PCR 扩增方法， 成本低廉 ； 同时仅需采用普通 RT-PCR 仪， 无需昂贵设备， 易于推广。 附图说明 说 明 书 CN 103525950 A 4 3/7 页 5 0024 图 1 不同引物和模板的一步法的 RT-PCR 的电泳图。其中， 1-5 为以 CVA6-037 为 模 板 依 次 采 用 引 物 (1108)F+(1124)R、 (1124)F+(1108)R、 (1124)F+(1124)R、 (1124) F+(1030)R、 (1108)F+(1030)R 一步法 RT-PCR ； 6-10 为以肠。

16、道病毒 CVA16 型为模板依次采 用引物 (1108)F+(1124)R、 (1124)F+(1108)R、 (1124)F+(1124)R、 (1124)F+(1030)R、 (1108) F+(1030)R 一步法 RT-PCR ； 11-15 为以肠道病毒 EV71 型为模板依次采用引物 (1108) F+(1124)R、 (1124)F+(1108)R、 (1124)F+(1124)R、 (1124)F+(1030)R、 (1108)F+(1030)R 一步 法 RT-PCR。 0025 图 2 不同引物与肠道病毒通用引物 （EV F+R） 的组合两步法以及不同引物一步法 的 RT-。

17、PCR 的电泳图。其中， 1 为引物 (1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的组合 ； 2 为引物 (1108) F+(1124)R ； 3 为引物 (1124)F+(1108)R 和 EV F+R ； 4 为引物 (1124)F+(1108)R ； 5 为引物 (1124)F+(1124)R 和 EV F+R ； 6 为引物 (1124)F+(1124)R。 0026 图 3 为单管二重一步法 RT-PCR 引物的敏感性检验电泳图。其中， 1-4 分别为以 (1108)F+(1124)R 为引物， 用浓度依次 1、 0.1、 0.01、 0.001TCID50/mL CVA6-0。

18、37 病毒液检测 单管二重一步法 RT-PCR 引物的敏感性 ； 5-8 分别为以 (1108)F+(1124)R 和 EV F+R 为引物， 用浓度依次 1、 0.1、 0.01、 0.001TCID50/mL CVA6-037 病毒液检测单管二重一步法 RT-PCR 引 物的敏感性。 0027 图 4 考察引物 (1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的不同配比的单管二重一步法电泳图。 其中， 1 为 (1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的体积分别 0.25 和 0.125， CVA6-037 病毒的浓度为 0.001TCID50/mL ； 2为(1108)F+(1。

19、124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.25， CVA6-037病毒的 浓度为0.001TCID50/mL ； 3为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.25和0.5， CVA6-037 病毒的浓度为0.001TCID50/mL ； 4为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.125， CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL ； 5为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125 和0.25， CVA6-037病毒的浓度为0.001TCID50/mL ； 6为(1108)F+(1124)R和EV F+。

20、R的体积分 别 0.125 和 0.5， CVA6-037 病毒的浓度为 0.001TCID50/mL ； 7 为 (1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的体积分别0.25和0.125， CVA6-037病毒的浓度为0.0001TCID50/mL ； 8为(1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的体积分别 0.25 和 0.25， CVA6-037 病毒的浓度为 0.0001TCID50/mL ； 9 为 (1108) F+(1124)R 和 EV F+R 的体积分别 0.25 和 0.5， CVA6-037 病毒的浓度为 0.0001TCID50/mL ； 10 为 (。

21、1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的体积分别 0.125 和 0.125， CVA6-037 病毒的浓度为 0.0001TCID50/mL ； 11为(1108)F+(1124)R和EV F+R的体积分别0.125和0.25， CVA6-037病 毒的浓度为 0.0001TCID50/mL ； 12 为 (1108)F+(1124)R 和 EV F+R 的体积分别 0.125 和 0.5， CVA6-037 病毒的浓度为 0.0001TCID50/mL ； 0028 图 5 单管二重一步法不同退火时间的电泳图。其中， 1 为 54 ； 2 为 56 ； 3 为 58 ； 4 为 。

22、60。 0029 图 6 为 CVA6-037 株 7 种不同浓度的病毒培养上清核酸单管二重一步法的敏感性， 即 100、 10、 1、 0.1、 0.01、 0.001、 0.0001TCID50/mL。1-7 依次为浓度为 100、 10、 1、 0.1、 0.01、 0.001、 0.0001TCID50/mL 的 CVA6-037 病毒培养上清。 0030 图 7 为鉴别 CVA6 和非 CVA6 型肠道病毒单管二重一步法 RT-PCR 检测手足口病患 者的临床咽拭子标本的扩增结果。其中， 5、 6、 8、 10、 11 为 CVA6 病毒感染 ； 1、 2、 4 为其他肠道 病毒感染。

23、 ； 3、 7、 9 为阴性标本。 说 明 书 CN 103525950 A 5 4/7 页 6 具体实施方式 0031 以下实施有利于用于说明本发明， 但不用来限制本发明的保护范围。 0032 病毒株来源 ： 本发明涉及到的毒株 EV71-1001、 EV71-1002、 CA16-1001、 CVA6-037、 CVA6-039、 CA16-1004 均来自南京市儿童医院感染科手足口病患儿和江西九江市第三人民 医院急传科手足口病患儿临床标本中分离得到， 并经间接免疫荧光检测、 EV71 和 CVA16 荧 光定量检测核酸等方法鉴定。 0033 咽拭子标本的准备方法如下 ： 0034 采集发。

24、病一周内的患儿咽拭子标本， 用专用采样棉签时， 在咽后壁和两侧扁桃 体部位适度拭抹后将棉签装入 2mL 病毒保存液中， 充分震荡混匀后取 100L 悬液， 采用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN) 提取病毒 RNA。 0035 病毒液标本的采集方法如下 ： 0036 将 EV71、 CVA16 和 CVA6 病毒液接种至单层人恶性胚胎横纹肌瘤 RD 细胞上， 36、 5%vt CO2培养， 逐日观察细胞病变效应 (CPE)， 当 CPE 达 80% 以上后收获病毒， 冻融三次后 12000rpm离心后取140L上清， 采用QIAamp Viral RNA Min。

25、i Kit(QIAGEN)提取病毒RNA， 其中 EV71-1001、 EV71-1002、 CA16-1001、 CVA6-037、 CVA6-039、 CA16-1004 通过微量细胞培 养法计算病毒滴度， 使用 DMEM 培养基将病毒进行梯度稀释， 得到不同体积的病毒液用于单 对引物 RT-PCR 和单管二重一步法 RT-PCR 敏感性检测。 0037 RT-PCR 扩增产物的电泳鉴定方法如下 ： 0038 取 RT-PCR 扩增产物 5L， 加 1L 溴酚蓝上样缓冲液， 混匀， 点样于 20g/L 琼脂糖 凝胶 （含 0.5L/mL 溴化乙锭） ， 以 100bpDNA 分子量 Mar。

26、ker 作为标准分子参照， 在 5V/cm 的 电场强度下于 1 倍的 TAE 电泳缓冲液电泳 40min， 凝胶成像系统紫外线下观察结果并拍照。 0039 肠道病毒通用引物 （UTR 通用引物） 为 ： 0040 引物 F ： 5 -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3 ； SEQ ID No:3 ； 0041 引物 R ： 5 -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3 ； SEQ ID No:4 ； 0042 其中 R 为 A 或 G， W 为 A 或 T。 0043 实施例 1 引物的设计和筛选 0044 为获得特异性 CVA6 引物， 从 Genbank 。

27、下载了肠道病毒所有 67 个血清型的 216 个 基因序列， 用 DNAMAN 软件进行序列比对， 依据所有 CVA6 病毒 VP1 基因保守序列设计出以下 特异性引物 ： 0045 引物 (1108)F ： 5 -TCGAAATGGGGTTAATGAGGCG-3 22bp ； SEQ ID No:1 ； 0046 引物 (1108)R ： 5 -GTGGTTATGCTTGCACGRTCGG-3 22bp ； SEQ ID No:5 ； 0047 引物 (1124)F ： 5 -TGCRGGRYTGGTAGGAGTTGTG-3 22bp ； SEQ ID No:6 ； 0048 引物 (112。

28、4)R ： 5 -CRCCTTCATAATCMGTGGTGG-3 21bp ； SEQ ID No:2 ； 0049 引物 (1030)F ： 5 -TTGGCCCATAGATGTGATGGGC-3 22bp ； SEQ ID No:7 ； 0050 引物 (1030)R ： 5 -TGKCCAARYTTACCAYAWGTTC-3 22bp ； SEQ ID No:8 ； 0051 引物 (1029)F ： 5 -TCAGTGATAGCACAACGCCCGG-3 22bp ； SEQ ID No:9 ； 0052 引物 (1029)R ： 5 -RTTGRGCRGTRGTKGARGAMACC-。

29、3 23bp ； SEQ ID No:10 ； 0053 其中 M 为 A 或 C， R 为 A 或 G， W 为 A 或 T， Y 为 C 或 T。 说 明 书 CN 103525950 A 6 5/7 页 7 0054 通过肠道病毒通用引物不同组合进行 CVA6 病毒一步法 RT-PCR， 通过 CVA6 特异性 引物不同组合进行 CVA6 病毒 RT-PCR， 筛选出扩增效率高的引物 (1108)F+(1124)R、 (1124) F+(1108)R、 (1124)F+(1124)R、 (1124)F+(1030)R、 (1108)F+(1030)R。 0055 再用引物 (1108)F。

30、+(1124)R、 (1124)F+(1108)R、 (1124)F+(1124)R、 (1124) F+(1030)R、 (1108)F+(1030)R 分别以肠道病毒 EV71 和 CVA16 病毒的 RNA 为模板 （见图 1） ， 筛选出对 CVA6 特异性好的 (1108)F+(1124)R、 (1124)F+(1108)R、 (1124)F+(1124)R。 0056 再用三对非常特异性引物 (1108)F+(1124)R、 (1124)F+(1108)R、 (1124)F+(1124) R 与肠道病毒通用引物 （F+R） 配对进行一步法 RT-PCR， 筛选出一对扩增效率高、 特。

31、异性好的 引物 CVA6 (1108)F+(1124)R（见图 2） 。 0057 再用浓度依次为 1、 0.1、 0.01、 0.001 TCID50/mL 的 CVA6-JJ037 检测 CVA6(1108) F+(1124)R 引物的 RT-PCR 的敏感性 （见图 3） 。 0058 实施例 2 单管二重一步法 RT-PCR 扩增条件的考察 0059 本发明进行单管二重一步法 RT-PCR 扩增时， 采用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN) 提取病毒 RNA， 用 One-Step RT-PCR Kit (QIAGEN) 扩增， 扩增体系如下 ： 006。

32、0 0061 1. 两对引物对的体积比的考察 0062 采用 0.01、 0.001TCID50/mL CVA6-037 检测的核酸作为模板， 引物稀释浓度均为 10mol/L， 考察两对引物不同体积配比 （见表 1） ， 确定两对引物的最佳体积 （见图 4） 。 0063 表 1 不同的引物体积配比 说 明 书 CN 103525950 A 7 6/7 页 8 0064 0065 2. 退火温度的考察 0066 然后用 1TCID50/mL CVA6-037 检测， 分别采用 54、 56、 58和 60退火温度， 考察最适合两对引物扩增的退火温度 （见图 5） ， 最后确定反应体系和扩增的。

33、退火温度为 56， 扩增出的目的片段特异性好， 敏感度高。 0067 综上所述， 本发明单管二重一步法 RT-PCR 扩增最佳条件为 ： 0068 （1） 引物 CVA6(1108)F+(1124)R 和肠道病毒通用引物浓度均为 10mol/L， 引物 CVA6(1108)F+(1124)R 的最佳体积为 0.25L， 肠道病毒通用引物的最佳体积为 0.5L ； 0069 （2） 扩增的反应条件为 ： 50逆转录 45min， 95变性 15min， 进入循环 ： 94变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 1min， 共 50 个循环， 末次循环后 72延伸 10min。 0070 3。

34、. 检测限考察 0071 利用上述最佳条件， 考察检测限。 0072 用100、 10、 1、 0.1、 0.01、 0.001、 0.0001TCID50/mL CVA6-037培养上清检测上述候选 二重引物 RT-PCR 的敏感性， 确定选用本发明的二重引物 CVA6(1108)F+(1124)R（见图 6） 。 0073 结果表明本发明方法对 CVA6 的最低检测限为 0.0001TCID50/mL， 对非 CVA6 的最低 检测限为 0.0001TCID50/mL ； 同时对所有的 CVA6 毒株均能扩增出 306bp 与 685pb 两条目的 条带， 而对非 CVA6 毒株均扩增出一。

35、条 306bp 目的条带。 0074 实施例 3 临床应用 0075 使用本发明的方法检测 704 份来源于手足口病患者的咽拭子标本， 标本都采集自 发病一周内的患儿咽拭子标本。 0076 其中， 582 份咽拭子标本经九江市第三人民医院用实时荧光定量 PCR 检测 EV71 和 CVA16， 结果有 70 份标本 CVA16 阳性 （12%） ， 29 份标本 EV71 阳性 （5%） 。 0077 利用实施例 2 确定的 RT-PCR 单管二重一步法条件鉴别 CVA6 和非 CVA6 型肠道病 毒 （部分结果见图 7） ， 检测 704 份标本， CVA6 阳性标本 512 份， 非 CV。

36、A6 标本有 192 份。 0078 从 512 份 CVA6 阳性 PCR 产物中随机选取 92 份对 VP1 基因测序， 结果表明 92 份均 为 CVA6。 0079 随机抽出 25 份非 CVA6 阳性标本通过测序， 并获得结果为 ： 9 份 CA16、 8 份 EV71、 3 份 CA10、 2 份 Echo-6、 2 份 Echo-9 和 1 份 CB4。 0080 以上结果表明本发明方法的特异性达 100%。 0081 结合上述敏感性试验结果， 本发明具有敏感性高、 特异性好、 操作简便、 节省成本 说 明 书 CN 103525950 A 8 7/7 页 9 和时间， 只需要普。

37、通的 PCR 仪就可以操作等明显优势。 说 明 书 CN 103525950 A 9 1/5 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103525950 A 10 2/5 页 11 0003 序 列 表 CN 103525950 A 11 3/5 页 12 0004 序 列 表 CN 103525950 A 12 4/5 页 13 0005 序 列 表 CN 103525950 A 13 5/5 页 14 序 列 表 CN 103525950 A 14 1/3 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103525950 A 15 2/3 页 16 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103525950 A 16 3/3 页 17 图 7 说 明 书 附 图 CN 103525950 A 17 。