一种利用数字PCR检测食品中菌落总数的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103667462 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667462 A (21)申请号 201310613501.2 (22)申请日 2013.11.27 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农业质量标准与检 测技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 陈爱亮 吴英 蒋小玲 吕珍珍 刘金钏 杨曙明 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种利用数字 PCR 检测食品中菌落总。

2、数的方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用数字 PCR 检测食品中 菌落总数的方法。该方法包括如下步骤 ： 1） 富集 待测食品中的细菌， 将富集物与与 DNA 结合物共 同孵育， 获得 PCR 扩增模板 ； 所述 DNA 结合物为不 能穿过完整的细胞膜， 但能与细胞膜受损后暴露 出来的 DNA 结合的物质 ； 2） 配制 PCR 反应体系， 进 行数字 PCR 反应 ； 所述 PCR 反应体系中含有所述 PCR 扩增模板、 细菌通用引物对、 荧光染料、 dNTP 和 DNA 聚合酶 ； 3） 根据反应产生的荧光信号， 计算 所述待测液体食品中的菌落总数。本方法无需对 食品中细菌进行分离。

3、培养， 检测时间缩短至 2-3 小时 ； 同时大大减少了背景 DNA 和基质的干扰， 灵 敏度低至 1 个拷贝 ； 而且该方法无需设置标准曲 线， 根据结果可直接判读样品中的菌落总数， 大大 简化了操作步骤。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 (10)申请公布号 CN 103667462 A CN 103667462 A 1/1 页 2 1. 数字 PCR 方法在检测食品中菌落总数中的应用。 2. 一种利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的方法， 包括如。

4、下步骤 ： （1） 富集待测食品中的细菌， 将富集物与 DNA 结合物共同孵育， 获得 PCR 扩增模板 ； 所述 DNA 结合物为不能穿过完整的细胞膜， 但能与细胞膜受损后暴露出来的 DNA 结合 的物质 ； （2） 配制 PCR 反应体系， 进行数字 PCR 反应 ； 所述 PCR 反应体系中含有步骤 （1） 获得的 PCR 扩增模板、 细菌通用引物对、 荧光染料、 dNTP 和 DNA 聚合酶 ； （3） 根据步骤 （2） 数字 PCR 反应产生的荧光信号， 计算得到所述待测食品中的菌落总 数。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于 ： 所述细菌通用引物对为由序列表中序列1 和序列。

5、 2 所示的两条单链 DNA 分子组成的引物对。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 DNA 结合物为叠氮溴化丙锭或 叠氮溴化乙锭。 5. 根据权利要求 2-4 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述荧光染料为 SybGreen 或 EvaGreen。 6. 根据权利要求 2-5 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 进行所述数字 PCR 反应时的退火温度为 58。 7. 一种利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的试剂盒， 包括如下物质 ： （a） 引物对 ； 所述引物对为由序列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 分子组成 的引。

6、物对 ； （b） DNA 结合物 ； 所述 DNA 结合物为不能穿过完整的细胞膜， 但能与细胞膜受损后暴露 出来的 DNA 结合的物质。 8. 根据权利要求 7 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 DNA 结合物为叠氮溴化丙锭或叠 氮溴化乙锭。 9. 根据权利要求 7 或 8 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒还包括荧光染料 ； 10. 根据权利要求 9 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述荧光染料为 SybGreen 或 EvaGreen。 权 利 要 求 书 CN 103667462 A 2 1/7 页 3 一种利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的方法 技术领域 0001 本发。

7、明属于食品安全领域， 涉及一种检测食品中菌落总数的方法， 特别涉及一种 利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的方法。 背景技术 0002 民以食为天， 食以安为先， 食品安全关系到消费者的身心健康与财产安全。 食品中 的致病微生物是引发食品安全问题的重要原因之一， 而菌落总数是作为食品安全一个很重 要的微生物指标， 检测食品中菌落总数是判断样品是否被人、 畜粪便污染及污染程度的标 志， 可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性， 以及潜伏着食物中毒和流行病的 威胁， 是否对人体健康具有潜在的危险。所以各个国家都针对诸如肉、 蛋、 奶、 饮料等各种 食品中的菌落总数制定了限定标准， 并依法对。

8、各种食品的微生物含量进行抽查检测。例如 我国规定酱油、 巴氏杀菌乳中的菌落总数不能超过 30000cfu/ml， 生鲜乳中不能超过 200 万 cfu/ml。 由于食品基质复杂， 食品中微生物数量较少， 目前对食品中菌落总数的检测方法都 要依赖于细菌培养， 在培养的基础上检测， 因此检测时间需要 1-2 天完成。如目前的国标培 养法需要 48-72 个小时才能完成， 美国进口 3M 菌落总数测试片也需要 48 小时才能确认结 果。对于讲究鲜活的食品来讲， 检测时间过长， 大大影响了食品的供应， 同时也降低了鲜活 食品的质量。因此急需一种快速的食品中菌落总数的检测方法。 0003 数字 PCR 。

9、是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术， 主要采用当前分析化学热 门研究领域的微流控或微滴化方法， 将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微 滴中， 每个反应器的核酸模板数少于或者等于 1 个。这样经过 PCR 循环之后， 有一个核酸分 子模板的反应器就会给出荧光信号， 没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和 反应器的体积， 就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 与传统定量PCR技术不同的是数字PCR 不依赖于扩增曲线的循环阈值 (CT) 进行定量， 不受扩增效率的影响， 也不必采用看家基因 和标准曲线， 具有很好的准确度和重现性， 可以实现绝对定量分析。 在现阶段的低丰度因子 含量。

10、检测中， 定量 PCR、 杂交等方法都因受到背景 DNA 或杂质的干扰， 使得检测灵敏度及精 确性都达不到精细定量的要求 （如定量 PCR 检测中 Ct 值大于 33 的情况下， 其重复性和准确 性就不是很高） ， 而微滴式数字 PCR 检测系统通过微滴化处理， 使得稀有的待检测片段从大 量的背景 DNA 中分离出来， 从而提高了检测的灵敏度及精确性。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的方法。 0005 数字 PCR 方法在检测食品中菌落总数中的应用也属于本发明的保护范围。 0006 本发明所提供的利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的方法， 具体。

11、可包括如下步 骤 ： 0007 （1） 富集待测食品中的细菌， 将富集物与 DNA 结合物共同孵育， 获得 PCR 扩增模 板 ； 说 明 书 CN 103667462 A 3 2/7 页 4 0008 所述 DNA 结合物为不能穿过完整的细胞膜 （活细菌） ， 但能与细胞膜受损 （死细菌） 后暴露出来的 DNA 结合的物质 ； 0009 （2） 配制 PCR 反应体系， 进行数字 PCR 反应 ； 所述 PCR 反应体系中含有步骤 （1） 获 得的 PCR 扩增模板、 细菌通用引物对、 荧光染料、 dNTP 和 DNA 聚合酶 ； 0010 （3） 根据步骤 （2） 数字 PCR 反应产生的。

12、荧光信号， 计算得到所述待测食品中的菌落 总数。 0011 在上述方法中， 所述待测食品可为液体食品， 也可为固体食品。 如各种鲜活农产品 及其加工食品、 水以及饮料等。 在本发明的一个实施例中， 所述待测食品为奶， 具体为牛奶， 更加具体为生鲜牛乳或巴氏杀菌牛奶。 0012 当所述待测食品为液体食品 （如牛奶） 时， 上述方法的步骤 （1） 中， 所述 “富集待测 食品中的细菌” 可为将所述待测食品 （如牛奶） 离心， 所得沉淀即为所述富集物 （富集了待 测食品中的细菌） 。进一步， 将所述待测食品 （如牛奶） 离心的转速可为 14000g， 时间可为 5-10min（如 10min） ， 。

13、温度可为 4。 0013 在上述方法的步骤 （1） 中， 将所述富集物与所述 DNA 结合物共同孵育的目的是为 了让所述 DNA 结合物与死细菌的 DNA 结合， 从而阻断死细菌 DNA 分子的 PCR 扩增， 从而有效 实现对活细菌的选择性扩增。 0014 在上述方法中， 所述细菌通用引物对具体为由序列表中序列 1 和序列 2 所示的两 条单链 DNA 分子组成的引物对。 0015 在上述方法中， 所述 DNA 结合物具体可为叠氮溴化丙锭 （PMA）或叠氮溴化乙锭 （EMA） 。 0016 在上述方法中， 所述荧光染料具体可为 SybGreen 或 EvaGreen。 0017 在上述方法的。

14、步骤 （2） 中， 进行所述数字 PCR 反应时的退火温度可为 58。进 一步， 在本发明中， 进行所述数字 PCR 反应时的反应程序为 ： 94预变性 3min ； 94 45S， 50 45S， 72 60S， 5 个循环 ； 94 45S， 58 45S， 72 60S， 30 个循环 ； 最后 72保温 10min。 0018 进一步， 在步骤 （1） 中， 所述 DNA 结合物 （PMA 或 EMA） 在孵育体系中的终浓度为 10g/ml。 0019 在本发明的一个实施例中， 上述方法的步骤 （1） 具体为 ： 将 20-50ml 牛奶 （生鲜牛 乳或巴氏杀菌牛奶） 414000g离。

15、心10min后， 收集沉淀， 用1ml生理盐水重悬后加入DNA结 合物 （PMA 或 EMA） 至其终浓度为 10g/ml， 25孵育 20 分钟， 然后 4 14000g 离心 5min， 用生理盐水重悬沉淀至 10-20 微升， 得到所述 PCR 扩增模板。 0020 在上述方法的步骤 （2） 中， 进行所述数字 PCR 反应时的反应体系中， 所述细菌通用 引物对中两条单链 DNA 分子的终浓度均为 10M。 0021 具体的， 在本发明的一个实施例中， 上述方法的步骤 （2） 中， 进行所述数字 PCR 反 应时的反应体系 （以总体积 20 微升为例） 为 ： 5 微升所述 PCR 扩增。

16、模板， 所述细菌通用引物 对中两条单链DNA分子的终浓度均为10M， 1微升荧光染料 （SybGreen或EvaGreen） ， 以及 10 微升 PCR mix， 余量为水。所述 PCR mix 由 dNTP、 DNA 聚合酶和 PCR 缓冲液组成， 具体为 Bio-rad 公司产品， 其产品目录号为 186-4035。 0022 在上述方法中， 进行所述数字 PCR 反应， 并根据产生的荧光信号计算所述待测食 说 明 书 CN 103667462 A 4 3/7 页 5 品中的菌落总数， 是在现有的数字 PCR 系统上进行。首先， 利用数字 PCR 系统自带的分液器 将配制好的所述反应体系。

17、进行分液处理， 生成数万个液滴， 分散至芯片的微反应器或微滴 中， 使每个微滴或反应器的PCR扩增模板数少于或者等于1个 ； 其次， 进行PCR循环扩增， 有 一个 PCR 扩增模板的反应器就会给出荧光信号， 没有 PCR 扩增模板的反应器就没有荧光信 号。进一步， 根据荧光信号的相对比例和 PCR 反应液的体积， 计算出所述待测食品 （如牛奶） 中活细菌总数。 0023 本发明的再一个目的是提供一种利用数字 PCR 检测食品中菌落总数的试剂盒。所 述食品可为液体食品， 也可为固体食品。如各种鲜活农产品及其加工食品、 水以及饮料等。 在本发明的一个实施例中， 所述食品为奶， 具体为牛奶， 更加。

18、具体为生鲜牛乳或巴氏杀菌牛 奶。 0024 具体的， 本发明所提供的试剂盒， 可包括如下物质 ： 0025 （a） 引物对 ； 所述引物对为由序列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 分子 组成的引物对 ； 0026 （b） DNA 结合物 ； 所述 DNA 结合物为不能穿过完整的细胞膜， 但能与细胞膜受损后 暴露出来的 DNA 结合的物质 ； 0027 所述 DNA 结合物具体可为叠氮溴化丙锭 （PMA） 或叠氮溴化乙锭 （EMA） 。 0028 进一步， 所述试剂盒还可包括含荧光染料的 PCR Mix ； 0029 所述荧光染料具体可为 SybGreen 或 EvaGreen。。

19、 0030 所述试剂盒还可以包括 PCR 反应缓冲液。 0031 在本发明中， 所有的所述菌落总数均为活细菌总数 （细胞膜完整的活细菌总数） 。 0032 在本发明中， 所述引物对不限于由序列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 分子组成的引物对， 只要是能够特异性扩增所有细菌的引物对均可。 0033 本发明在数字 PCR 基础上， 设计了可以扩增所有细菌的通用引物， 建立了基于数 字 PCR 方法的食品中菌落总数的检测方法。与常规方法相比， 本发明的方法无需对食品中 的细菌进行分离培养， 使检测时间从 1-2 天缩短至 3-5 小时 ； 同时本发明的方法通过数字 PCR 技术对 。

20、PCR 反应液进行分液处理， 大大减少了背景 DNA 和基质的干扰， 灵敏度可以低至 1 个拷贝 ； 而且该方法无需设置标准曲线， 根据结果可以直接判读样品中的菌落总数， 大大 简化了操作步骤。 具体实施方式 0034 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0035 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0036 数字 PCR 系统 ： Bio-rad 公司 Droplet Digital PCR System （购自伯乐公司， 目录 号为 186-4001） 。其工作原理为 ： 将含有荧光染料的反应体系进行分液处理， 生成数万个液 滴。

21、， 分散至芯片的微滴中， 使每个微滴的模板数少于或者等于 1 个 ； 这样， 在 PCR 循环扩增 时， 有一个模板的微滴就会发出荧光信号， 没有 PCR 扩增模板的微滴就没有荧光信号。进一 步， 根据荧光信号的相对比例和反应液的体积， 就可以计算出反应体系中模板的浓度。 0037 叠氮溴化丙锭 （PMA） ： 美国 Biotium 公司产品， 其产品目录号为 40013。叠氮溴化 乙锭 （EMA） ： 美国 Biotium 公司产品， 其产品目录号为 40015。PMA 和 EMA 均为 DNA 结合物， 说 明 书 CN 103667462 A 5 4/7 页 6 均不能穿过完整的细胞膜，。

22、 但能与细胞膜受损后暴露出来的 DNA 结合。因此， PMA 和 EMA 可 以与死细菌的 DNA 结合， 但是不能与细胞膜完整的活细菌的 DNA 结合。 0038 荧光染料 SybGreen ： 美国 Invitrogen 公司产品， 其产品目录号为 S-7585。荧光 染料 EvaGreen ： 美国 Biotium 公司产品， 其产品目录号为 31000。荧光染料 SybGreen 和 EvaGreen 均可与双链 DNA 分子结合， 发出绿色荧光。 0039 PCR mix ： Bio-rad 公司产品， 其产品目录号为 186-4035。所述 PCR mix 由 dNTP、 DNA 。

23、聚合酶和 PCR 缓冲液组成。 0040 美国 3M 菌落总数测试片 ： 美国 3M 公司产品， 其产品目录号为 6406。 0041 实施例 1、 利用数字 PCR 对市售生鲜牛乳进行菌落总数的检测 0042 本实施例以 12 份市售生鲜牛乳作为待测食品， 编号为 1-12， 利用数字 PCR 技术对 其中的菌落总数 （活细菌总数） 进行检测。 0043 一、 细菌通用引物对的设计 0044 为了能够利用 PCR 方法检测食品中的所有细菌， 根据细菌基因组保守序列， 设计 可以扩增所有细菌的通用引物， 具体如下 ： 0045 正向引物 ： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 。

24、（序列 1） ； 0046 反向引物 ： 5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 （序列 2） 。 0047 二、 PCR 扩增模板的制备 0048 取 20ml 市售生鲜牛乳， 4 14000g 离心 10min， 得沉淀 （细菌） ， 用 1ml 生理盐水 重悬后加入叠氮溴化乙锭 （EMA） ， 使其终浓度为 10g/ml， 室温 （25） 孵育 20 分钟， 然后 4 14000g 离心 5min， 用生理盐水将沉淀重悬至 20 微升， 得到 PCR 扩增模板。 0049 三、 配制 PCR 反应体系 0050 取 5 微升步骤二获得的 PCR 扩增模板， 加入 10 微升 P。

25、CR mix， 2 微升正向引物和 2 微升反向引物 （使正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度均为 10M） ， 1 微升荧光染 料 EvaGreen。混合后得到 20 微升的反应体系。 0051 四、 上机进行数字 PCR 检测 0052 1、 反应体系的分液处理 0053 将步骤三配制好的 PCR 反应体系置于数字 PCR 系统的分液器内， 按照仪器使用说 明进行操作， 实现对反应体系的分液处理， 生成 2 万个液滴。 0054 2、 PCR 循环扩增 0055 每个液体在独立的空间内进行 PCR 循环扩增。设置反应程序如下 ： 94预变性 3min ； 94 45S， 50 45S， 。

26、72 60S， 5 个循环 ； 94 45S， 58 45S， 72 60S， 30 个循环 ； 最 后 72保温 10min。 0056 3、 分析荧光信号 0057 PCR 循环扩增反应结束后， 利用数字 PCR 系统自带的微滴荧光检测仪采集每个液 滴的荧光信号。进一步， 根据发出荧光信号的液滴的数量， 计算出所述待测食品 （市售生鲜 牛乳） 中活细菌总数。 0058 实验同时设置以美国 3M 菌落总数测试片对作为待测食品的市售生鲜牛乳进行菌 落总数测定的对照。具体的实验操作均按照产品说明书记载进行。 0059 实验重复三次， 结果取平均值。 说 明 书 CN 103667462 A 6 。

27、5/7 页 7 0060 结果如表1所示， 从结果可以看出， 本发明采用数字PCR方法对生鲜牛乳中菌落总 数的测定结果， 与现有的 “美国 3M 菌落总数测试片法” 相比， 12 份样本的误差均小于 25%， 平均误差为 13%， 这说明本发明方法具有很高的准确度。另外， 本发明数字 PCR 方法的单样 本全程检测时间为 3 小时， 远短于现有 “美国 3M 菌落总数测试片法” 的 48 小时。 0061 表 1 数字 PCR 法与美国 3M 菌落总数测试片法测定生鲜牛乳中菌落总数的结果对 比 （单位 ： CFU/mL） 0062 0063 实施例 2、 利用数字 PCR 对市售巴氏杀菌牛奶进。

28、行菌落总数的检测 0064 本实施例以 12 份市售巴氏杀菌牛奶作为待测食品， 编号为 1-12， 利用数字 PCR 技 术对其中的菌落总数 （活细菌总数） 进行检测。 0065 一、 PCR 扩增模板的制备 0066 取 50ml 市售巴氏杀菌牛奶， 4 14000g 离心 10min， 得沉淀 （细菌） ， 用 1ml 生理盐 水重悬后加入叠氮溴化丙锭 （PMA） ， 使其终浓度为10g/ml， 室温 （25） 孵育20分钟， 然后 4 14000g 离心 5min， 用生理盐水将沉淀重悬至 10 微升， 得到 PCR 扩增模板。 0067 二、 配制 PCR 反应体系 0068 取 5 。

29、微升步骤一获得的 PCR 扩增模板， 加入 10 微升 PCR mix， 2 微升正向引物和 2 微升反向引物 （使正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度均为 10M） ， 1 微升荧光染 料 SybGreen。混合后得到 20 微升的反应体系。 0069 三、 上机进行数字 PCR 检测 说 明 书 CN 103667462 A 7 6/7 页 8 0070 1、 反应体系的分液处理 0071 将步骤二配制好的 PCR 反应体系置于数字 PCR 系统的分液器内， 按照仪器使用说 明进行操作， 实现对反应体系的分液处理， 生成 2 万个液滴。 0072 2、 PCR 循环扩增 0073 每个液。

30、体在独立的空间内进行 PCR 循环扩增。设置反应程序如下 ： 94预变性 3min ； 94 45S， 50 45S， 72 60S， 5 个循环 ； 94 45S， 58 45S， 72 60S， 30 个循环 ； 最 后 72保温 10min。 0074 3、 分析荧光信号。 0075 PCR 循环扩增反应结束后， 数字 PCR 系统自带的微滴荧光检测仪采集每个液滴的 荧光信号。进一步， 根据发出荧光信号的液滴的数量， 计算出所述待测食品 （市售巴氏杀菌 牛奶） 中活细菌总数。 0076 实验同时设置以美国 3M 菌落总数测试片对作为待测食品的市售巴氏杀菌牛奶进 行菌落总数测定的对照。具体。

31、的实验操作均按照产品说明书记载进行。 0077 实验重复三次， 结果取平均值。 0078 结果如表2所示， 从结果可以看出， 本发明采用数字PCR方法对巴氏杀菌牛奶中菌 落总数的测定结果， 与现有的 “美国 3M 菌落总数测试片法” 相比， 12 份样本的误差均小于 25%， 平均误差为 14%， 这说明本发明方法具有很高的准确度。另外， 本发明数字 PCR 方法的 单样本全程检测时间为 3 小时， 远短于现有 “美国 3M 菌落总数测试片法” 的 48 小时。 0079 表 2 数字 PCR 法与美国 3M 菌落总数测试片法测定巴氏杀菌牛奶中菌落总数的结 果对比 （单位 ： CFU/mL） 0080 0081 说 明 书 CN 103667462 A 8 7/7 页 9 说 明 书 CN 103667462 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 103667462 A 10 。