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1、(10)授权公告号 CN 1896256 B (45)授权公告日 2010.07.28 CN 1896256 B *CN1896256B* (21)申请号 200610200633.2 (22)申请日 2006.06.29 C12P 7/22(2006.01) C12R 1/69(2006.01) (73)专利权人 大连理工大学 地址 116024 辽宁大连甘井子区凌工路 2 号 (72)发明人 修志龙 王辉 刘琳 李晓晖 (74)专利代理机构 大连理工大学专利中心 21200 代理人 侯明远 CN 1251361 A,2000.04.26, 全文 . CN 1341587 A,2002.03。
2、.27, 全文 . CN 1277954 A,2000.12.27, 全文 . (54) 发明名称 一种用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇 的方法 (57) 摘要 一种用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇 的方法， 属于天然产物的生物转化和提取技术领 域。 本发明的技术特征是将原料粉碎， 加入碳源和 氮源制成种子培养基和发酵培养基 ； 接种米曲霉 (Aspergillus oryzae)， 通气搅拌发酵 ； 微波辅助 提取发酵液。本发明的效果和益处是在原料粉末 中直接加入碳源和氮源制成培养基， 接种食品级 微生物米曲霉进行发酵， 简化了工艺和操作程序， 缩短了生产周期， 大大提高了白藜芦醇的收率。
3、， 降 低了生产成本。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 陈中伟 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 1896256 B1/1 页 2 1. 一种用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法， 其特征在于工艺步骤包括 ： 1) 将原料粉碎， 加入碳源和氮源， 配制种子培养基和发酵培养基 ； 原料为虎杖、 何首 乌、 买麻藤、 藜芦、 花生衣、 葡萄皮或葡萄籽 ； 种子培养基为添加 0 6的原料粉末的麸皮 培养基 ； 发酵培养基中所加入碳源为 10 30g/L 的麸皮， 氮源为 5 9g/L 的硫酸铵、 3 7g/L 的硝。
4、酸铵或者 3 5g/L 的尿素 ； 2) 接种食品级微生物米曲霉 Aspergillus oryzae CICC 2436 ； 3) 搅拌发酵 ； 4) 发酵液中加入 50 95的乙醇进行微波辅助提取。 2. 根据权利要求 1 所述的一种用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法， 其特征 在于接种量为 5 15， 发酵罐搅拌转速为 150 350rpm， 培养温度为 20 40， 空气通 入量为 0.8 1.5vvm， 发酵时间为 12 48 小时。 3. 根据权利要求 2 所述的一种用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法， 其特征 还在于发酵进行 16 44 小时后， 改变培养温度为 45。
5、 55， 继续培养 1 6 小时。 权 利 要 求 书 CN 1896256 B1/2 页 3 一种用微生物将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法 技术领域 0001 本发明属于天然产物的生物转化和提取技术领域， 特别涉及到用微生物将植物中 的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法。 背景技术 0002 白藜芦醇是一种三羟基芪类化合物， 存在于葡萄、 藜芦、 何首乌、 虎杖等多种植物 中， 具有抗癌、 抗病毒、 抗氧化、 阻止血小板凝聚等作用， 主要用于预防和治疗心血管疾病。 目前， 白藜芦醇已被广泛应用于食品保健品和化妆品， 其需求量在逐年上升。 0003 白藜芦醇的生产方法有化学合成和从天然植物中提取。。
6、化学合成法成本高， 污染 环境， 所以目前白藜芦醇的生产主要是从植物中提取。然而， 植物中的白藜芦醇含量特别 低， 其中在虎杖中含量最高， 但也仅达到 0.43 ( 汉中地区 )， 这就使得其分离纯化成本偏 高。而白藜芦醇类似物白藜芦苷在植物中的含量远高于白藜芦醇。在虎杖中， 白藜芦醇苷 的含量可达到 2.5 ( 汉中地区 ) ； 在何首乌中， 其最高含量可达 4.8 ( 四川 )。如果将白 藜芦醇苷转化为白藜芦醇， 白藜芦醇的产率可大大提高。 0004 传统上， 苷元的获得是通过水解相应的糖苷来实现的。但水解反应需要在高温高 压下由酸或碱催化来完成， 对设备要求高， 且对环境造成污染。相比之。
7、下， 生物转化法具有 条件温和， 过程简单， 污染小等优点， 已经成为药物修饰的重要手段。 0005 将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇主要是通过酶法转化和微生物转化实现的。例如， 在粉末状虎杖原料中加入复合酶恒温酶解反应 48-72 小时 (CN1251363， FR2795964)， 或者 在虎杖提取液中加入纤维素酶进行水解 (CN1566349A)。酶法转化虽然取得了一定的效果， 但是酶价格昂贵， 限制了这些方法的推广使用。微生物转化法是将浸润后的虎杖置于温度 为 20-50的容器内自然发酵 24-96 小时 (CN1385535A) 或者在虎杖中加入专用微生物进 行转化 (CN1513822A。
8、)。微生物转化法可以有效地提高了白藜芦醇的产率， 但自然发酵过 程中的菌群未知， 条件难以控制， 且空气中的霉菌有可能产生有毒物质 ； 专用微生物转化法 (CN1513822A) 中所用微生物未公开， 无法验证和重复， 其实用性受到极大限制。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种食品级微生物米曲霉(Aspergillus oryzae)作为菌种， 对原料虎杖、 何首乌、 买麻藤、 藜芦、 花生衣、 葡萄皮或葡萄籽等进行转化， 再进行微波辅助 提取， 可大大提高白藜芦醇的收率。 0007 为达到上述目的， 本发明的工艺步骤包括 ： 0008 培养基的制备 ： 种子培养基为添加 06的原料粉。
9、末的麸皮培养基。发酵培养基 中必须具备微生物生长所需的碳源和氮源。 碳源为1030g/L的麸皮， 氮源为59g/L的硫酸 铵、 37g/L 的硝酸铵或者 35g/L 的尿素。培养基须在 121下灭菌 1520 分钟方能使用。 0009 种子培养 ： 在摇瓶中进行， 摇床转速为 100200rpm， 温度为 2035， 培养时间为 1824h。 说 明 书 CN 1896256 B2/2 页 4 0010 发酵培养 ： 在 5L 发酵罐中进行， 接种量为 5 15， 搅拌桨转速为 150350rpm， 温度为 2040。发酵过程中通入空气量为 0.81.5vvm， 发酵时间为 1248 小时。发。
10、酵进 行 1644 小时后， 改变培养温度为 4555， 继续培养 16 小时。 0011 产物提取 ： 发酵液中加入一倍的 5095的乙醇进行微波辅助提取。 0012 本发明的优点在于直接将原料粉末进行发酵， 大大提高了其白藜芦醇的收率， 工 艺简单， 重复性好。所用微生物为食品级， 安全可靠。 具体实施方式 0013 以下结合技术方案， 以虎杖为例， 详细叙述本发明的实施方式。 0014 实施例 1 ： 0015 发酵所用菌种为米曲霉 (Aspergillus oryzae)， 购自中国工业微生物菌种保藏中 心， 编号为 CICC 2436。 0016 培养基 ： A.种子培养基 ： 10。
11、g麸皮加100ml自来水煮沸20min， 过滤， 滤液添加水到 100ml， 再加入 6的虎杖粉末。B. 发酵培养基 ： 虎杖粉末 200g(60 目 )， 麸皮 50g， 硝酸铵 12.5g， 自来水 2500ml， 121灭菌 20min。 0017 发酵过程 ： 种子培养在 250ml 的三角瓶中进行， 装液量为 30mL， 摇床转速为 150rpm， 培养温度为 30 ？， 培养时间为 24 小时 ； 发酵培养在 5L 发酵罐中进行， 实际装液量 为 2.5L， 接种量为 5， 转速控制为 250rpm， 通入空气量为 1.5vvm， 温度控制在 37 ？。 0018 发酵结束， 加入。
12、 1 倍于发酵液的 95乙醇， 微波辅助提取。 0019 实验所得结果如下 ： 0020 发酵进行 24 小时， 白藜芦醇的产率为 1.34 (g/g 药材 )， 是未发酵药材中白藜芦 醇产率 (0.43 ) 的 3.12 倍。 0021 实施例 2 ： 0022 发酵所用菌种为米曲霉 (Aspergillus oryzae)， 购自中国工业微生物菌种保藏中 心， 编号为 CICC 2436。 0023 培养基 ： A.种子培养基 ： 10g麸皮加100ml自来水煮沸20min， 过滤， 滤液添加水到 100ml。B. 发酵培养基同实施例 1。 0024 发酵过程 ： 种子培养在 250ml 的摇瓶中进行， 装液量为 30mL， 摇床转速为 150rpm， 培养温度为25？， 培养时间为24小时 ； 发酵培养在250ml摇瓶中进行， 实际装液量为50ml， 接种量为 5， 转速控制为 150rpm， 温度控制在 25 ？。发酵进行 44 小时后， 改变培养温度 为 50 ？， 继续培养 2 小时。 0025 培养结束后， 加入一倍于发酵液的 95乙醇， 微波辅助提取。 0026 实验所得结果如下 ： 0027 白藜芦醇的产率为 1.35 (g/g 药材 )， 是未发酵药材中白藜芦醇产率 (0.35 ) 的 3.86 倍。 说 明 书 。