对相关申请的交叉引用
本专利申请要求2003年9月15日提交的美国专利申请号60/503,239 的利益，并且与美国专利申请号10/893,121相关，所述美国专利申请号 10/893,121要求提交于2003年7月16日的美国临时专利申请号 60/488,144，提交于2003年9月15日的60/503,279，和提交于2003年12 月11日的60/529,406的利益，出于所有目的将其上述每个申请的教导完 整结合于此作为参考。
发明背景
有效和安全的基因递送系统是将在临床上有用的基因治疗所需要的。 病毒载体是相对有效的基因递送系统，但是遭遇到多种局限，诸如逆转成 野生型的可能以及免疫应答问题。结果，非病毒基因递送系统正在受到越 来越多的关注(Worgall，et al.，Human Gene Therapy 8：37-44(1997)；Peeters， et al.，Human Gene Therapy 7：1693-1699(1996)；Yei，et al.，Gene Therapy 1：192-200(1994)；Hope，et al.，Molecular Membrane Biology 15：1-14 (1998))。质粒DNA-阳离子脂质体复合物是目前最常用的非病毒基因递送 载体(Felgner，Scientific American 276：102-106(1997)；Chonn，et al.，Current Opinion in Biotechnology 6：698-708(1995))。然而，复合物较大，系统很不 确定，其不适于全身应用并可激发相当大的毒性副作用(Harrison，et al.， Biotechniques 19：816-823(1995)；Huang，et al.，Nature Biotechnology 15：620-621(1997)；Templeton，et al.，Nature Biotechnology 15：647-652 (1997)；Hofland，et al.，Pharmaceutical Research 14：742-749(1997))。
最近的工作已经显示质粒DNA可被包封在小的(～70nm直径)“稳定的 质粒-脂质颗粒”(SPLP)中，其由包封在双层脂质载体中的单一质粒组成 (Wheeler，et al.Gene Therapy 6：271(1999))。这些SPLPs典型地包含“融合 性的(fusogenic)”脂质二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)，低水平的阳离子脂质， 并在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣时在水性介质中是稳定的。SPLP具有全身 应用，因为在静脉内(i.v.)注射后，它们显示延长的循环生存期，由于在这 些区域增加的血管通透性，它们优先聚集在远侧肿瘤位点，并可在这些肿 瘤位点介导转基因表达。在i.v.注射包含萤光素酶标记基因的SPLP后，在 肿瘤位点观察到的转基因表达的水平优于使用质粒DNA-阳离子脂质体复 合物(lipoplexes)或裸DNA可获得的水平。尽管如此，对于一些应用中的 理想治疗益处，可能需要提高水平的表达(见，例如，Monck，et al.，J.Drug Targ.7：439-452(2000))。
典型地，脂质体和SPLPs都包含PEG-脂质衍生物。典型地，通过将 二酰基甘油磷脂的极性头部基团用PEG进行衍生化来制备PEG-脂质，所 述二酰基甘油磷脂诸如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。这些磷脂通常包 含两条通过酯键与甘油的1-位和2-位结合的脂肪酰基链。不幸的是，在酸 性或碱性条件下，这些酰基基团易对于裂解敏感。这些得到的水解产物， 诸如溶血磷脂和甘油磷酸酯的类似物，没有保持与脂质体或SPLP的双层 结构的相关性。不幸的是，这些离解会削弱脂质体或SPLP结构的完整性， 导致生物活性剂或药物从脂质体或SPLP的显著漏损并导致贮存过程中的 不稳定，因此缩短脂质体或SPLP产物的贮存期限。此外，这些水解产物， 诸如PEG-溶血磷脂从脂质体或SPLP的损失否定了否则可从PEG-磷脂的 存在获得的益处。
脂质的稳定性在脂质体或SPLP药物递送系统的开发中是重要的。因 此，理想的是开发对水解较不敏感的PEG-脂质，由此增加脂质体或SPLP 的循环寿命。本发明解决了这个和其它的需要。
发明概述
本发明提供新的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物，与常用 的PEG-脂质缀合物(诸如PEG-PE缀合物)相比，其具有增加的稳定性。本 发明的PEG-修饰的二烷基丙基缀合物通过增加所述脂质体，SNALP，或 SPLP的循环寿命或使用期限来提高脂质体以及核酸-脂质颗粒(例如， SNALPs和SPLPs)的性质。事实上，已经令人惊奇地发现，本发明的 PEG-DAA缀合物比其它常用的PEG-脂质衍生物更稳定。作为增加的稳定 性的结果，本发明的PEG-DAA缀合物增加了脂质体或SPLP的循环寿命 或使用期限并还减少了由于使用其它PEG-脂质缀合物时脂质体双层或 SPLP的脂肪酰基链的水解所导致的漏损。
本发明提供新的具有如下结构的式I的PEG-DAA缀合物：
在上述式I中，“R1和R2”被独立地选择并是具有约10-约20个碳原子的 烷基基团；PEG是聚乙二醇；并且L是接头部分(例如，包含非酯(non-ester) 的接头部分或包含酯的接头部分)。适合的烷基基团包括，但不限于，月桂 基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基 (C20)。在一个优选的实施方案中；R1和R2是相同的，即它们都是肉豆蔻 基(C14)或都是棕榈基(C16)或都是硬脂基(C18)。在一个优选的实施方 案中，所述烷基基团是饱和的。
在上述的式I中，“PEG”是聚乙二醇，其具有在约550道尔顿到约 10,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约750道尔顿到约5,000道尔 顿范围内的分子量，更优选约1,000道尔顿到约5,000道尔顿范围内 的分子量，更优选约1,500道尔顿到约3,000道尔顿范围内的分子量， 并且甚至更优选约2,000道尔顿，或约750道尔顿分子量。所述PEG可以 任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基取代。在一个优选的实施方案中，末 端羟基基团被甲氧基或甲基基团所取代。PEG可以与脂质直接缀合或可以 通过接头部分与脂质连接。可以使用任何适合于将PEG与脂质偶联的接头 部分，其包括，例如包含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。在一个优 选的实施方案中，所述接头部分是包含非酯的接头部分。用于本文时，术 语“包含非酯的接头部分”指不包含羧酸酯键(-OC(O)-)的接头部分。适合的 包含非酯的接头部分包括，但不限于，酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、 羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，二硫化物 (-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(O)CCH2CH2C(O)-)，琥珀酰胺 (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)，醚，二硫化物，等及其组合(诸如包含氨基甲 酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在一个优选的实施方案中，将氨 基甲酸酯接头用于将PEG偶联于脂质。
在其它实施方案中，包含酯的接头部分被用于将PEG偶联于脂质。 适合的包含酯的接头部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰，磷 酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯及其组合。
在上述的式I中，“L”是包含非酯的接头部分或包含酯的接头部分。在 一个优选的实施方案中，L是包含非酯的接头部分。适合的包含非酯的接 头包括，但不限于，酰氨基接头部分，氨基接头部分，羰基接头部分，氨 基甲酸酯接头部分，脲接头部分，醚接头部分，二硫化物接头部分，琥珀 酰胺接头部分及其组合。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分 是氨基甲酸酯接头部分(即，PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选的实施方 案中，包含非酯的接头部分是酰氨基接头部分(即，PEG-A-DAA缀合物)。 在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是琥珀酰胺基接头部分 (即，PEG-S-DAA缀合物)。
在另一个方面，本发明提供包含式I的聚乙二醇-二烷氧基丙基 (PEG-DAA)缀合物的脂质体。所述脂质体还典型地包括阳离子脂质和非 阳离子脂质。在一些方面，所述脂质体还包括甾醇(例如，胆甾醇)。所述 脂质体可以是空的或，备选地，脂质体还可以包含一种或多种生物活性剂 (例如，本文所述的治疗性产物)。适合的生物活性剂包括，但不限于，抗 肿瘤药，抗生素，免疫调节剂，消炎药和作用在中枢神经系统上的药物。 类似地，适合的生物活性剂包括，但不限于，肽，蛋白质和核酸。
在另一个方面，本发明提供一种将生物活性剂递送给细胞的方法，所 述方法包括使细胞与包含式I的PEG-DAA缀合物的脂质体接触，其中所 述生物活性剂被包封在脂质体中。类似地，在另一方面，本发明提供一种 将生物活性剂递送给患者的方法，所述方法包括将包含式I的PEG-DAA 缀合物的脂质体施用给患者，其中所述生物活性剂被包封在脂质体中。
在另一方面，本发明提供核酸-脂质颗粒，所述核酸-脂质颗粒包括： 核酸；阳离子脂质；非阳离子脂质；和式I的PEG-DAA。在一些方面， 所述核酸-脂质颗粒还包括甾醇(例如，胆甾醇)。
在另一方面，本发明提供一种将核酸引入细胞的方法，所述方法包括 使所述细胞与核酸-脂质颗粒接触，所述核酸-脂质颗粒包括阳离子脂质， 非阳离子脂质，式I的PEG-DAA缀合物，和核酸。
本发明的其它特点，目的和优势及其优选实施方案将通过下面的详细 描述、实施例、权利要求和附图而变得显而易见。
附图简述
图1举例说明两种示范性PEG-二烷氧基丙基衍生物，即N-(2，3-二肉 豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲基醚(即，PEG-C-DMA)，N-(2，3- 二肉豆蔻基氧基丙基)酰胺PEG2000甲基醚(即，PEG-A-DMA)，和N-(2，3- 二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀酰胺PEG2000甲基醚(即，PEG-S-DMA)的结构。
图2举例说明显示包含PEG-DAA缀合物，PEG-DAG缀合物， PEG-神经酰胺缀合物，和PEG-DSPE缀合物的脂质体的稳定性的数据。
图3举例说明显示在IV施用包含PEG-DAA缀合物，PEG-DAG缀 合物，和PEG-神经酰胺缀合物的SPLP后，在肿瘤中的萤光素酶基因表 达的数据。
图4举例说明显示由包含PEG-DAA缀合物，PEG-DAG缀合物， PEG-神经酰胺缀合物，和PEG-DSPE缀合物的SPLP进行体内转染的数 据。
图5举例说明显示在静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG 缀合物的SPLP 48小时后，在肿瘤中的萤光素酶基因表达的数据。
图6举例说明显示静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG 缀合物的SPLP后，在肝，肺，脾，心脏和肿瘤中的萤光素酶基因表达的 数据。
图7举例说明显示在静脉内施用包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG 缀合物的SPLP或pSPLP 48小时后，显示在肿瘤中的萤光素酶基因表达 的数据。
图8举例说明显示由包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG缀合物的 SPLP进行的体内转染的数据。
图9举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs 处理的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述 SPLPs包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素 酶的质粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图10举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图11举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图12举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图13举例说明体内数据，所述体内数据证明在用SPLPs和SNALPs处理 的具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶表达的沉默，所述SPLPs 包括PEG-DAA缀合物并包含在CMV启动子的控制下编码萤光素酶的质 粒，所述SNALPs包括PEG-DAA缀合物并包含抗萤光素酶siRNA。
图14举例说明证明细胞吸收包括PEG-C-DMA缀合物的SPLP的数 据。
图15举例说明证明在施用SPLP或SNALP 24小时后，包括 PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的SPLP和SNALP在具有Neuro-2a肿瘤的 雄性A/J小鼠中的生物分布的数据。
图16举例说明证明在施用SPLP多达24小时后，包含PEG-C-DMA 的SPLP在雄性A/J小鼠中的血液清除率的数据。
图17举例说明在施用SPLP或SNALP 48小时后，包含PEG-C-DMA 的SPLP和SNALP在具有Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中的生物分布的 数据。
图18举例说明在施用SPLP和SNALP多达24小时后，包括 PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的SPLP和SNALP在雄性A/J小鼠中的血 液清除率的数据。
图19举例说明证明由SPLP和pSPLP体内转染的数据，所述SPLP 和pSPLP包含PEG-DAA缀合物和PEG-DAG缀合物并包封编码萤光素酶 的质粒。
图20举例说明证明由SPLP体内转染的数据，所述SPLP包含 PEG-C-DMA缀合物并包封编码萤光素酶的质粒。
图21举例说明证明由SPLP体内转染的数据，所述SPLP包含 PEG-C-DMA缀合物并包封编码萤光素酶的质粒。
图22举例说明证明与SNALPs接触的Neuro-2a细胞中的萤光素酶表 达的沉默的数据，所述SNALPs包括PEG-C-DMA缀合物并包含抗萤光 素酶siRNA。
图23举例说明证明在表达萤光素酶和用SNALPs处理过的雄性A/J 小鼠中的转移性Neuro-2a肿瘤中的萤光素酶表达的沉默的体内数据，所述 SNALPs包括PEG-C-DMA缀合物和包封抗萤光素酶siRNA。
发明详述
I.介绍
本发明提供新的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物，与常用 的PEG-脂质缀合物(诸如PEG-PE缀合物)比较，其具有增加的稳定性。本 发明的PEG-修饰的二烷基丙基缀合物通过增加所述脂质体，SNALP，或 SPLP的循环寿命或使用期限来提高脂质体以及核酸-脂质颗粒(例如， SNALPs和SPLPs)的性质。事实上，已经令人惊奇地发现，包含通过接头 与DAA缀合的PEG的PEG-DAA缀合物比其它常用的PEG-脂质衍生物 更稳定。具体而言，已经令人惊奇地发现，使用包含非酯的接头部分导致 了与常用的PEG-脂质缀合物比较稳定性增加的PEG-DAA缀合物(例如， PEG-PG缀合物)。作为它们增加的稳定性的结果，本发明的PEG-DAA缀 合物增加了脂质体，SNALP或SPLP的循环寿命或使用期限并还减少了 由于使用其它PEG-脂质缀合物时脂质体双层，SNALP，或SPLP的脂肪 酰基链的水解所导致的漏损。
II.定义
术语“二烷氧基丙基”指具有2-烷基链的化合物，其R1和R2都独立地具 有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二烷氧基 丙基具有如下的通式：
术语“PEG”指聚乙二醇，一种具有两个末端羟基基团的线性，乙烯PEG 重复单元的水溶性聚合物。根据它们的分子量，将PEGs进行分类；例如， PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量，并且PEG5000具有约5,000 道尔顿的平均分子量。PEGs是可从Sigma Chemical Co.和其它公司商购的 并且包括例如下列各项：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)，单甲氧基聚乙 二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)，单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯 (MePEG-S-NHS)，单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)，单甲氧基聚乙二 醇-tresylate(MePEG-TRES)，和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基 (MePEG-IM)。此外，所述实例提供合成单甲氧基聚乙二醇-乙酸 (MePEG-CH2COOH)的方案，其特别在制备本发明的PEG-DAA缀合物中 有用。
在一个优选的实施方案中，所述PEG是具有约550到约10,000道尔 顿的平均分子量的聚乙二醇并且任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基取代。 在一个优选的实施方案中，所述PEG在末端羟基位置被甲基所取代。在 另一个优选的实施方案中，所述PEG具有约750到约5,000道尔顿的平 均分子量，更优选地，具有约1,000约5,000道尔顿的平均分子量，更优 选地具有约1,500到约3,000道尔顿的平均分子量，并且，甚至更优选 地具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。所述PEG可以任 选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基所取代。在一个优选的实施方案中， 所述末端羟基基团被甲氧基或甲基基团所取代。
用于本文时，PEG-DAA缀合物指与二烷氧基丙基缀合的聚乙二醇。 所述PEG可以直接与DAA缀合并且可以通过接头部分与DAA缀合。适 合的接头部分包括包含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。
用于本文时，术语“包含非酯的接头部分”指不包含羧酸酯键(-OC(O)-) 的接头部分。适合的包含非酯的接头部分包括，但不限于，酰氨基 (-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲 (-NHC(O)NH-)，二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(O)CCH2CH2C(O)-)， 琥珀酰胺(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)，醚，二硫化物，等及其组合(诸如包 含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在一个优选的实施方案 中，将氨基甲酸酯接头用于将PEG偶联于脂质。
在其它实施方案中，包含酯的接头部分用于将PEG偶联于脂质。适 合的包含酯的接头部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基，磷 酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其组合。
术语“脂质”指一组有机化合物，其包括，但不限于脂肪酸的酯，并且 特征是在水中不溶的，但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成 至少三类：(1)“简单的脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质” 其包括磷脂和糖脂；(3)“衍生的脂质”诸如甾族化合物。
“脂质小泡”指可用于递送化合物的任何脂质组合物，其包括，但不限 于，脂质体，其中水体积被两亲性脂双层所包封；或其中脂质包被包括大 分子组分的内部，诸如包括干扰RNA序列的质粒，伴随减少的水性内部； 或脂质聚集体或胶团，其中被包封的成分包含在相对混乱的脂质混合物 中。
用于本文时，“包封的脂质”可指提供具有充分包封、部分包封或两者 的化合物的脂质制剂。在一个优选的实施方案中，将所述核酸充分包封在 脂质制剂中(例如，形成SPLP，pSPLP，SNALP，或其它核酸脂质颗粒)。 核酸脂质颗粒及其制备方法公开于美国专利号5,976,567，美国专利号 5,981,501和PCT专利公开号WO 96/40964中。
用于本文时，术语“SNALP”指稳定的核酸脂质颗粒，包括SPLP。 SNALP代表包被减少的水性内部的脂质的小泡，所述内部包括核酸(例如， ssDNA，dsDNA，ssRNA，dsRNA，siRNA或质粒，包括转录干扰RNA的质 粒)。用于本文时，术语“SPLP”指包括被包封于脂质小泡中的核酸(例如， 质粒)的核酸脂质颗粒。SNALPs和SPLPs典型地包含阳离子脂质，非阳离 子脂质，和阻止所述颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALPs和 SPLPs具有全身施用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后显示延长的循环寿 命，在远端位点(例如，在物理上与施用位点分隔的位点上聚集并且可以介 导被转染的基因在这些远端位点的表达。SPLPs包括“pSPLP”，其包括如 在WO 00/03683中提及的被包封的缩合剂-核酸复合物。
术语“形成小泡的脂质”意欲包括任何具有疏水部分和极性头部基团 的两亲性脂质，并且其本身可以在水中自发形成双层小泡，示例为大多数 磷脂。
术语“采用小泡的脂质”意欲包括稳定与脂双层结合的任何两亲性脂 质以及其它的两亲性脂质，其疏水部分与内部，双层膜的疏水区域接触， 并且其极性头部基团部分朝向外部，膜的极性表面。采用小泡的脂质包括 这样的脂质，其能够独立地适宜于采用非层状的相，还能够在存在双层稳 定组分时，采取双层结构。典型的实例是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。 双层稳定组分包括，但不限于，抑制SNALPs聚集的缀合的脂质，聚酰胺 低聚物(例如，ATTA-脂质衍生物)、肽、蛋白质、去污剂、脂质衍生物、 PEG-脂质衍生物诸如与二烷氧基丙基偶联的PEG、与二酰基甘油偶联的 PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG，和与神经酰胺缀合的PEG(见，美国专 利号5,885,613，将其并入本文作为参考)。PEG可以直接与脂质缀合或可以 通过接头部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG偶联于脂质的任何接头 部分，包括，例如，包含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。
术语“两亲性脂质”部分地指任何适合的材料，其中脂质材料的疏水部 分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。两亲性脂质通常是脂质小泡的主要 成分。亲水性质来自极性或带电基团诸如碳水化合物，磷酸盐(酯)，羧基、 硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以 通过包含非极性基团来赋予，所述基团包括，但不限于，长链饱和和不饱 和脂族烃基团和由一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这样的基 团。两亲性化合物的实例包括，但不限于，磷脂、氨脂质和神经鞘脂类。 磷脂的代表性实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、 溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰 磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物，诸如鞘磷脂、 鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸也在被称为两亲性脂质的组中。另 外，上述的两亲性脂质可与其它脂质混和，所述脂质包括甘油三酯和固醇。
术语“中性脂质”指在选定的pH以未带电荷或中性两性离子形式存在 的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH下，这样的脂质包括，例如，二 酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、神经鞘磷脂、脑磷脂、 胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
术语“非阳离子脂质”指如上所述的任何中性脂质以及阴离子脂质。
术语“阴离子脂质”指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包 括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂 酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰 乙醇胺，赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它与中 性脂质连接的阴离子修饰基团。
术语“阳离子脂质”指许多脂质种类中的任何一种，其在选定的pH，诸 如生理pH下携带净正电荷。这些脂质包括，但不限于，N，N-二油基-N，N- 二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵 (“DOTMA”)；N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2，3-二油酰 氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙 烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)和N-(1，2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N- 二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)。如下的脂质是阳离子的并且在低于生 理pH时具有正电荷：DODAP，DODMA，DMDMA等。
术语“疏水脂质”指具有非极性基团的化合物，其包括，但不限于，长 链饱和和不饱和脂族烃基团并且这些基团任选地被一个或多个芳香族、脂 环族或杂环族基团所取代。合适的实例包括，但不限于，二酰基甘油、二 烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨 基丙烷。
术语“融合性的”指脂质体，SNALP或其它药物递送系统与细胞膜融合 的能力。所述膜可以是质膜或围绕细胞器，例如内体、核等的膜。
术语“二酰基甘油”指具有2-脂肪酰基链的化合物，其R1和R2都独立地 具有通过酯键与甘油的1-和2-位键合的2-30个碳原子。所述酰基基团可以 是饱和的或具有不同程度的不饱和。二酰基甘油具有如下的通式：
术语“ATTA”或“聚酰胺”指，但不限于，在美国专利号6,320,017和 6,586,559中公开的化合物，将它们都并入本文作为参考。这些化合物包括 具有如下式的化合物：
其中：R是选自由氢、烷基和酰基组成的组中的成员；R1是选自由氢和烷 基组成的组中的成员；或任选地，R和R1和它们所结合的氮原子形成叠氮 基部分；R2是选自由氢、任选地取代的烷基、任选地取代的芳基和氨基酸 侧链组成的组的成员；R3是选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、 氨基和NR4R5组成的组的成员，其中R4和R5独立地是氢或烷基；n是4-80； m是2-6；p是1-4；并且q是0或1。那些本领域技术人员将清楚的是其它聚 酰胺可用在本发明的化合物中。
术语“核酸”或“聚核酸”指包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸 的以单或双链形式存在的聚合物。核酸包括包含已知核苷酸类似物或修饰 的主链残基或键的核酸，其是合成的，天然存在的，或非天然存在的，其 具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸相似的方式进行 代谢。这些类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯 (phosphoroorothioates)，氨基磷酸酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-O-甲 基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。除非具体限制，该术语涵盖包含天然核 苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天 然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的核酸序列还 暗含涵盖其保守性修饰的变体(例如，简并密码子替换)，等位基因，直向 同源物，SNPs和互补序列以及明显指出的序列。具体地，可通过产生序列 来获得简并密码子替换，在所述序列中一个或多个选定(或所有)的密码子 的第三个位置由混和的碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer et al.， Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem. 260：2605-2608(1985)；和Cassol et al.(1992)；Rossolini et al.，Mol.Cell. Probes 8：91-98(1994))。“核苷酸”包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，碱 基，和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团进行连接。“碱基”包括嘌呤和嘧啶， 其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、 肌苷，和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限于 取代新的反应基的修饰，所述反应基诸如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧 酸盐(酯)和卤代烷。DNA可以以反义、质粒DNA、质粒DNA的部分、预压 缩的DNA、聚合酶链式反应(PCR)的产物、载体(P1，PAC，BAC，YAC，人工 染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物存在。术语 核酸与基因、cDNA、由基因编码的mRNA和干扰RNA分子可替换地使用。
术语“基因”指包括部分长度或全长的编码序列的核酸(例如，DNA或 RNA)序列，所述编码序列是产生多肽或多肽前体(例如，来自A，B，C，D，E， G型肝炎病毒；或单纯疱疹病毒的多肽或多肽前体)所必需的。
用于本文时，“基因产物”指基因的产物诸如包括，例如mRNA的RNA 转录物。
III.聚乙二醇-修饰的二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物
本发明提供新的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物，与常用 的PEG-脂质缀合物(诸如PEG-PE缀合物)相比，其具有增加的稳定性。更 具体地，本发明提供新的具有如下结构的式I的PEG-DAA缀合物：
在上述式I中，“R1和R2”被独立地选择并是具有约10-约20个碳原子的 烷基基团。所述烷基基团可以是饱和的或是不饱和的。适合的烷基基团包 括，但不限于，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬脂基(C18) 和二十碳烷基(C20)。在一个实施方案中，R1和R2是相同的，即R1和 R2都是肉豆蔻基(C14)或都是硬脂基(C18)等。在另一个实施方案中，R1和R2是不同的，即R1是肉豆蔻基(C14)，R2是硬脂基(C18)。在一个优 选的实施方案中，本发明的PEG-DAA缀合物是对称的，即，R1和R2都是 相同的。
在上述式I中，PEG是聚乙二醇，一种具有两个末端羟基基团的线性， 乙烯PEG重复单元的水溶性聚合物。根据它们的分子量，将PEGs进行分 类；例如，PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量，并且PEG 5000 具有约5,000道尔顿的平均分子量。PEGs是可从Sigma Chemical Co.和其 它公司商购的并且包括下列：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)，单甲氧基 聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)，单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸 酯(MePEG-S-NHS)，单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)，单甲氧基聚乙 二醇-tresylate(MePEG-TRES)，和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基 (MePEG-IM)。此外，所述实例提供合成单甲氧基聚乙二醇-乙酸 (MePEG-CH2COOH)的方案，其特别在制备本发明的PEG-DAA缀合物中 有用。
在一个优选的实施方案中，所述PEG是具有约550到约10,000道尔 顿的平均分子量的聚乙二醇并且任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基取代。 在一个优选的实施方案中，所述PEG在末端羟基位置被甲基所取代。在 另一个优选的实施方案中，所述PEG具有约750到约5,000道尔顿的平 均分子量，更优选地，具有约1,000到约5,000道尔顿的平均分子量，更 优选地具有约1,500到约3,000道尔顿的平均分子量，并且，甚至更优 选地具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。
在上述式I中，“L”是包含非酯的接头部分或包含酯的接头部分。在一 个优选的实施方案中，L是包含非酯的接头部分，即，不包含羧酸酯键 (-OC(O)-)的接头部分。适合的包含非酯的接头包括，但不限于，酰氨基接 头部分，氨基接头部分，羰基接头部分，氨基甲酸酯接头部分，脲接头部 分，醚接头部分，二硫化物接头部分，琥珀酰胺接头部分，琥珀酰基及其 组合。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是氨基甲酸酯接头 部分(即，PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选的实施方案中，包含非酯的 接头部分是酰氨基接头部分(即，PEG-A-DAA缀合物)。在一个优选的实 施方案中，包含非酯的接头部分是琥珀酰胺基接头部分(即，PEG-S-DAA 缀合物)。
在其它实施方案中，L是包含酯的接头部分。适合的包含酯的接头部 分包括，例如，羧酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)， 磺酸酯及其组合。
使用本领域那些技术人员已知的标准技术和试剂来合成本发明的 PEG-DAA缀合物。将认识到本发明的PEG-DAA缀合物将包含各种酰 胺，胺，醚，硫代，氨基甲酸酯和脲键。本领域那些技术人员将意识到形 成这些键的方法和试剂是众所周知的并且是容易获得的。见，例如，March， ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY(Wiley 1992)，Larock， COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989)；和 Furniss，VOGEL′S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ed.(Longman 1989)。还将理解的是，任何出现的官能团在合成本发明 的PEG-DAA缀合物中的不同点上可需要保护和去保护。本领域那些技术 人员将意识到这些技术是众所周知的。见，例如Green和Wuts， PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991)。
形成本发明的PEG-DAA缀合物的反应的一般顺序在下面的实施例 部分进行阐明。所述实施例提供制备本发明的PEG-A-DMA，PEG-C-DMA 和PEG-S-DMA缀合物的合成方案。使用类似的方法，本领域技术人员可 以容易地产生本发明的其它PEG-DAA缀合物。
除前述之外，对于本领域那些技术人员将容易变得显而易见的是可以 使用其它亲水性聚合物来取代PEG。可以用来取代PEG的适合的聚合物 的实例包括，但不限于，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉， 聚羟基丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺，聚乙酸， 聚羟基乙酸，和衍生化纤维素，诸如羟甲基纤维素和羟乙基纤维素。
IV.包含PEG-DAA缀合物的SPLPs和SNALPs
在一个实施方案中，本发明提供包含聚乙二醇(PEG)-二烷氧基丙基 (DAA)缀合物，即，PEG-DAA缀合物的稳定的核酸-脂质颗粒(例如， SPLPs和SNALPs)以及其它的基于脂质的载体系统。本发明的脂质-核酸 颗粒典型地包括核酸，阳离子脂质，非阳离子脂质和PEG-DAA缀合物。 所述阳离子脂质典型地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约2％到约 60％，优选地构成所述颗粒中存在的总脂质的约5％到约45％。在某些 优选的实施方案中，阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约5％ 到约15％。在其它优选的实施方案中，阳离子脂质构成在所述颗粒中存在 的总脂质的约40％到约50％。非阳离子脂质典型地构成在所述颗粒中存 在的总脂质的约5％到约90％，优选地构成在所述颗粒中存在的总脂质 的约20％到约85％。PEG-DAA缀合物典型地构成在所述颗粒中存在 的总脂质的1％到约20％，优选地构成在所述颗粒中存在的总脂质的2％ 到约15％，更优选地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约4％到约 10％。本发明的核酸-脂质颗粒还可以包含胆甾醇。如果存在，胆甾醇典型 地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约10％到约60％，优选地胆甾醇构 成在所述颗粒中存在的总脂质的约20％到约45％。对于本领域技术人员 将容易变得显而易见的是，例如，使用在下面的实施例部分中描述的ERP 测定，核酸-脂质颗粒的成分的比例可以变化。例如，对于全身递送，阳离 子脂质可以构成在所述颗粒中存在的总脂质的约5％到约15％，而对于 局部或区域性递送，所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约 40％到约50％。
本发明的SPLPs和SNALPs典型地具有少于约150nm的平均直径并 且是基本无毒的。此外，当存在于本发明的SPLPs和SNALPs中时，核 酸对于水溶液中核酸酶的降解具有抗性。SPLPs和SNALPs以及它们的 制备方法公开于美国专利号5,976,567，美国专利号5,981,501和PCT专利 公开号WO 96/40964中，将其所有的教导并入本文作为参考。
可以单独或与一种或多种其它的阳离子脂质种类或非阳离子脂质种类 组合来将各种适合的阳离子脂质用在本发明中。
用在本发明中的阳离子脂质可以是在选定的pH，诸如生理pH下携带 净正电荷的许多脂质种类的任何一种。适合的阳离子脂质包括，但不限于， DODAC，DOTMA，DDAB，DOTAP，DOSPA，DOGS，DC-Chol和DMRIE， 或其组合。也用在本发明中的许多这些阳离子脂质和相关类似物，已经描 述在同时待审的USSN 08/316,399；美国专利号5,208,036，5,264,618， 5,279,833和5,283,185中，将其内容并入本文作为参考。此外，可获得许 多阳离子的商购制剂并可将其用在本发明中。这些包括，例如 LIPOFECTIN(可商购的阳离子脂质体，其包括来自GIBCO/BRL，Grand Island，New York，USA的DOTMA和DOPE)；LIPOFECTAMINE(可商购 的阳离子脂质体，包括来自GIBCO/BRL的DOSPA和DOPE)；和 TRANSFECTAM(可商购的阳离子脂质体，包括来自Promega Corp.， Madison，Wisconsin，USA的DOGS)。
用于本发明的非阳离子脂质可以是能够产生稳定复合体的多种中性不 带电荷的，两性离子或阴离子脂质。它们优选地是中性的，尽管它们可以 备选地是带正电荷或带负电荷的。用在本发明中的非阳离子脂质的实例包 括：磷脂-相关的物质，诸如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷 脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂，磷 脂酸，脑苷脂，二鲸蜡基磷酸酯，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷 脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油 (DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)， 棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二 油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环已烷-1-羧酸酯 (DOPE-mal)。非阳离子脂质或甾醇诸如胆甾醇可以存在。另外的不含磷的 脂质是，例如，硬脂胺，十二烷胺，十六胺，乙酰基棕榈酸酯，甘油蓖麻 醇酸酯，硬脂酸十六烷基酯，十四烷酸异丙酯，两性丙烯酸酯聚合物，三 乙醇胺-硫酸月桂酯，烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化脂肪酸酰胺，二(十八烷基) 二甲基溴化铵等，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺， 鞘磷脂，脑磷脂，和脑苷脂。其它的脂质诸如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂 酰乙醇胺可以存在。非阳离子脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000和与磷脂或与神经酰胺(被称作PEG-Cer)缀合的聚乙二醇， 如在同时待审的USSN 08/316,429中所描述的，将其并入本文作为参考。
在优选的实施方案中，非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱(例如，二硬 脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷 脂酰胆碱)，二酰基磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和棕榈酰油 酰磷脂酰乙醇胺)，神经酰胺或鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是 来自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基基团。更优选地是酰基基团是月桂 酰，肉豆蔻酰，硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中，非阳离子脂质 将是胆甾醇，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺，或卵鞘磷脂(ESM)。
除了阳离子和非阳离子脂质之外，本发明的SPLPs包括聚乙二醇-二烷 氧基丙基缀合物，即PEG-DAA缀合物。术语“二烷氧基丙基”指具有2-烷 基链的化合物，其R1和R2都独立地具有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的 或具有不同程度的不饱和。二烷氧基丙基具有如下的通式：
在本发明优选的实施方案中，PEG-DAA缀合物是二月桂基氧基丙基 (C12)-PEG缀合物，二肉豆蔻基氧基丙基(C14)-PEG缀合物，二棕榈酰氧 基丙基(C16)-PEG缀合物或二steryl氧基丙基(C18)-PEG缀合物。本领域 那些技术人员将容易明白其它的二烷氧基丙基可以用在本发明的 PEG-DAA缀合物中。
在一个优选的实施方案中，PEG-DAA缀合物具有下式：
在式I中，R1和R2独立地被选择并且是具有约10到约22个碳原子 的长链烷基基团。长链烷基基团可以是饱和的或是不饱和的。适合的烷基 基团包括，但不限于，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬 脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在优选的实施方案中，R1和R2是相同 的，即，R1和R2都是肉豆蔻基(即，二肉豆蔻基)，R1和R2都是硬脂基(即， 二硬脂基)，等。在式I中，PEG是具有约550到约8,500道尔顿的平均 分子量的聚乙二醇。在一个优选的实施方案中，PEG具有约1,000到约 5,000道尔顿的平均分子量，更优选地，具有约1,000到约3,000道尔 顿的平均分子量，甚至更优选地，具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的 平均分子量。所述PEG可以任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基基团所 取代。
在式I中，L是接头部分(例如，包含非酯的接头部分或包含酯的接 头部分)。可以使用适合于将PEG偶联于二烷氧基丙基主链的任何接头部 分。在一个优选的实施方案中，L是包含非酯的接头部分，即，不包含羧 酸酯键(-OC(O)-)的接头部分。适合的包含非酯的接头部分包括，但不限于， 酰氨基(-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)， 脲(-NHC(O)NH-)，琥珀酰(-(O)CCH2CH2C(O)-)，琥珀酰胺基，醚，二硫 化物，及其组合。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是氨基 甲酸酯接头部分(即，PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选的实施方案 中，包含非酯的接头部分是酰氨基接头部分(即，PEG-A-DAA缀合物)。 在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是琥珀酰胺基接头部分 (即，PEG-S-DAA缀合物)。
在其它实施方案中，L是包含酯的接头部分。适合的包含酯的接头部 分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)， 磺酸酯及其组合。
已经令人惊奇地发现，PEG-DAA缀合物特别有用于本发明的核酸- 脂质颗粒(例如，SNALPS和SPLP’s)。PEG-DAA缀合物具有超过PEG-磷 脂衍生物的多个优势。例如，PEG-磷脂衍生物在它们的磷酸盐基团上具有 负电荷，其导致多种不利。首先，负电荷可以导致与制剂中的阳离子脂质 的相互作用，并且因此，导致阻止PEG-磷脂交换出双层的静电力。第二， 磷酸酯基团的负电荷中和作为包封过程的必需部分的阳离子电荷。为了抵 消磷酸酯基团的中和作用，必须使用更高摩尔百分比的阳离子脂质，因此 增加了制剂的毒性。此外，与PEG-神经酰胺相比，PEG-DAA缀合物更 易于生产和制造。
除了前述组分之外，本发明的SPLPs还可以包含阳离子聚(乙二醇) (PEG)脂质，或CPLs，其已经被设计插入脂双分子层以赋予正电荷(见， Chen，et al.，Bioconj.Chem.11：433-437(2000))。用在本发明中的适合的 SPLPs和SPLP-CPLs，以及制备和使用SPLPs和SPLP-CPLs的方法公开 于，例如提交于2000年4月20日的美国申请号09/553,639，和提交于2000 年4月20日并在2000年10月26日公布为WO 00/62813的PCT专利申 请号CA 00/00451，将其每个的教导全文并入本文作为参考。
A.目标产物
除了上述组分之外，本发明的SPLPs和SNALPs包括核酸(例如，单链 或双链DNA，单链或双链RNA，RNAi，siRNA等)。适合的核酸包括， 但不限于，质粒，反义寡核苷酸，核酶以及其它的聚-和寡-核苷酸。在优 选的实施方案中，所述核酸编码产物，例如目标治疗性产物。
目标产物可以用于商业目的，包括用于作为药物或诊断的治疗性目 的。治疗性产物的实例包括，蛋白质，核酸，反义核酸，核酶，tRNA，snRNA， siRNA，抗原，VIII因子，和凋亡蛋白(Zhuang et al.(1995)Cancer Res.55(3)： 486-489)。适合种类的基因产物包括，但不限于，细胞毒性/自杀基因，免 疫调节剂，细胞受体配体，肿瘤抑制物，和抗血管发生的基因。选择的特 定基因将取决于所意欲的目的或治疗。这些目标基因的实例在下面和贯穿 整个说明书进行描述。
1.siRNA
SNALPs和SPLPs的核酸组分典型地包括干扰RNA(即，siRNA)，其 可以以几种形式进行提供，包括，例如作为一个或多个分离的小干扰 RNA(siRNA)双链体，更长的双链RNA(dsRNA)，或作为转录自DNA质 粒中的转录盒的siRNA或dsRNA。
RNA群可以用于提供长的前体RNAs，或与可用于制备siRNA的选定 靶序列具有基本或完全同一性的长前体RNAs。所述RNAs可以按照本领 域技术人员中众所周知的方法来从细胞或组织中分离，合成，和/或克隆。 RNA可以是混和的群(获自细胞或组织，转录自cDNA，扣除的(subtrated)， 选择的等)，或可以代表单一靶序列。RNA可以是天然存在的，例如，分 离自组织或细胞样品，例如使用T7或SP6聚合酶和PCR产物或克隆的 cDNA在体外合成的；或以化学方法合成。
为了形成长的dsRNA，对于合成RNAs，互补体还可以在体外转录并 杂交以形成ds RNA。如果使用天然存在的RNA群，例如通过转录相应于 RNA群的cDNAs，或通过使用RNA聚合酶，还提供了RNA互补体(例如， 形成dsRNA，其通过大肠杆菌(E.coli)RNAse III或切酶进行消化)。接着， 前体RNAs进行杂交从而形成双链RNAs进行消化。dsRNAs可以直接被 包封在SNALPs中或可以在包封前进行体外消化。
或者，可以将编码一个或多个siRNA模板的一个或多个DNA质粒包封 在核酸-脂质颗粒中。例如，基于小核RNAU6或人RNase P RNA H1的天然 存在转录单位，可以从质粒中的DNA模板将siRNA转录为自动折叠为具有 发夹环的双链体的序列，所述质粒具有RNA聚合酶III转录单位(见， Brummelkamp，et al.，Science 296：550(2002)；Donzé，et al，Nucleic A cids Res.30：e46(2002)；Paddison，et al.，Genes Dev.16：948(2002)；Yu，et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.99：6047(2002)；Lee，et al.，Nat.Biotech.20：500(2002)； Miyagishi，et al.，Nat.Biotech.20：497(2002)；Paul，et al.，Nat.Biotech.20：505 (2002)；和Sui，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.99：5515(2002))。典型地，转 录单位或盒将包含RNA转录启动子序列，诸如H1-RNA或U6启动子和终止 序列，所述启动子可操作地与转录所需siRNA序列的模板连接，所述终止 序列包括2-3个尿苷残基和聚胸苷(T5)序列(多腺苷酸化信号) (Brummelkamp，Science，同上)。选定的启动子可以提供组成型或诱导型转 录。将组合物和DNA-指导的RNA干扰分子的转录的方法详细描述于美国 专利号6,573,099，将其并入本文作为参考。优选地，所述合成性或转录的 siRNA具有约1-4个，优选地约2-3个核苷酸的3’突出端以及5’磷酸末端 (Elbashir，et al.，Genes Dev.15：188(2001)；Nyknen，et al.，Cell 107：309 (2001))。将转录单位结合到质粒或DNA载体中，干扰RNA转录自所述质粒 或DNA载体。将适合于体内递送遗传物质用于治疗目的的质粒详细描述于 美国专利号5,962,428和5,910,488中，它们两者都结合到本文作为参考。选 定的质粒可以提供靶细胞的瞬时或稳定的递送。本领域那些技术人员将清 楚的是起初被设计用于表达所需基因序列的质粒可以被进行修饰从而包 含转录siRNA的转录单位盒。
分离RNA，合成RNA，杂交核酸，制备和筛选cDNA文库以及进行PCR 的方法是本领域众所周知的(见，例如.，Gubler&Hoffman，Gene 25：263-269(1983)；Sambrook at al.，同上；Ausubel et al.，同上)，PCR方法 也是这样(见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis et al.，eds，1990))。表达文库也是本领域技术 人员众所周知的。公开用在本发明中的一般方法的另外的基本书籍包括 Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)； Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。
对适合的质粒进行工程改造从而使其以可表达的形式包含模板序列，所 述序列编码目标基因产物的部分长度的序列或完整的序列。模板序列还可 以用于提供分离的或合成的siRNA和dsRNA。一般而言，理想的是使目标 基因产物的转录或翻译下调或沉默。适合种类的基因产物包括，但不限于， 与肿瘤发生和细胞转化相关的基因，血管发生基因，免疫调节剂基因，诸 如与炎症和自体免疫应答有关的那些，配体受体基因，与神经变性疾病相 关的基因，和与病毒感染和存活相关的基因。
与肿瘤发生和细胞转化相关的基因序列的实例包括易位序列诸如 MLL融合基因，BCR-ABL(Wilda，et al.，Oncogene，21：5716(2002)；Scherr， et al.，Blood 101：1566)，TEL-AML1，EWS-FLI1，TLS-FUS，PAX3-FKHR， BCL-2，AML1-ETO和AML1-MTG8(Heidenreich，et al.，Blood 101：3157 (2003))；过度表达的序列诸如多药物抗性基因(Nieth，et al.，FEBS Lett. 545：144(2003)；Wu，et al，Cancer Res.63：1515(2003))，细胞周期蛋白(Li，et al.，Cancer Res.63：3593(2003)；Zou，et al.，Genes Dev.16：2923(2002))，β- 联蛋白(Verma，et al.，Clin Cancer Res.9：1291(2003))，端粒末端转移酶基因 (Kosciolek，et al.，Mol Cancer Ther.2：209(2003))，c-MYC，N-MYC，BCL-2， ERBB1和ERBB2(Nagy，et al.Exp.Cell Res.285：39(2003))；和突变序列 诸如RAS(综述于Tuschl和Borkhardt，Mol.Interventions，2：158(2002))。 使编码DNA修复酶的序列沉默在与化疗剂的施用联合使用中发现了应用 (Collis，et al.，Cancer Res.63：1550(2003))。编码与肿瘤迁移有关的蛋白质 的基因也是目标靶序列，例如，整联蛋白，选择蛋白和金属蛋白酶。前述 实例不是穷尽性的。可以将任何有利于或促进肿瘤发生或细胞转化，肿瘤 生长或肿瘤迁移的完整或部分基因序列包括作为靶序列。
生血管基因能够促进心血管的形成。特别感兴趣的是血管内皮生长因 子(VEGF)(Reich，et al.，Mol.Vis.9：210(2003))。
免疫调节剂基因是调节一个或多个免疫应答的基因。免疫调节剂基因 的实例包括细胞因子诸如生长因子(例如，TGF-α.，TGF-β，EGF，FGF，IGF， NGF，PDGF，CGF，GM-CSF，SCF，等)，白细胞介素(例如，IL-2，IL-4，IL-12 (Hill，et al.，J.Immunol.171：691(2003))，IL-15，IL-18，IL-20，等)，干扰素(例 如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，等)和TNF。Fas和Fas配体基因也是目标 免疫调节剂靶序列(Song，et al.，Nat.Med.9：347(2003))。在生血和淋巴样 细胞中的编码次级信号分子的基因也包括在本发明中，例如，Tec家族激 酶，诸如酪氨酸蛋白激酶(Btk)(Heinonen，et al.，FEBS Lett.527：274(2002))。
细胞受体配体包括这样的配体，其能够结合细胞表面受体(例如，胰岛 素受体，EPO受体，G-蛋白偶联受体，具有酪氨酸激酶活性的受体，细 胞因子受体，生长因子受体等)从而调节(例如，抑制，激活等)涉及受体的 生理途径(例如，葡萄糖水平调节，血液细胞发展，有丝分裂发生等)。细 胞受体配体的实例包括细胞因子，生长因子，白细胞介素，干扰素，红细 胞生成素(EPO)，胰岛素，胰高血糖素，G-蛋白偶联受体配体等)。编码三 核苷酸重复(例如，CAG重复)的延伸的模板在神经变形疾病中使病原序列 沉默中发现用途，所述疾病由三核苷酸重复的延伸所导致，诸如脊髓延髓 肌肉萎缩和亨廷顿舞蹈病(Caplen，et al.，Hum.Mol.Genet.11：175(2002))。
与病毒感染和存活相关的基因包括由病毒表达从而结合，进入和在细 胞中进行复制的那些。特别感兴趣的是与慢性病毒疾病相关的病毒序列。 特别感兴趣的病毒序列包括人免疫缺陷病毒(HIV)的序列(Banerjea，et al.， Mol.Ther.8：62(2003)；Song，et al.，J.Virol.77：7174(2003)；Stephenson JAMA 289：1494(2003)；Qin，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：183(2003))， 肝炎病毒(Hamasaki，et al.，FEBS Lett.543：51(2003)；Yokota，et al.，EMBO Rep.4：602(2003)；Schlornai，et al.，Hepatology 37：764(2003)；Wilson，et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.100：2783(2003)；Kapadia，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. 100：2014(2003))，疱疹病毒(Jia，et al.，J.Virol.77：3301(2003))，和人乳头 状瘤病毒(HPV)(Hall，et al.，J.Virol.77：6066(2003)；Jiang，et al.， Oncogene 21：6041(2002))。
2.另外的治疗性产物
如上解释，在本发明的一些实施方案中，所述SPLPs和SNALPs包封 编码治疗性产物的核酸，诸如，例如，肿瘤抑制基因，免疫调节剂基因， 细胞受体配体基因，抗-生血管基因，和细胞毒性/自杀基因。
a)肿瘤抑制
肿瘤抑制基因是能够抑制细胞，特别是肿瘤细胞的生长的基因。因此， 将这些基因递送到肿瘤细胞中在癌症的治疗中是特别有用的。肿瘤抑制基 因包括，但不限于，p53(Lamb et al.，Mol.Cell.Biol.6：1379-1385(1986)， Ewen et al.，Science 255：85-87(1992)，Ewen et al.(1991)Cell 66：1155-1164， 和Hu et al.，EMBO J.9：1147-1155(1990))，RB1(Toguchida et al.(1993) Genomics 17：535-543)，WT1(Hastie，N.D.，Curr.Opin.Genet.Dev. 3：408-413(1993))，NF 1(Trofatter et al.，Cell 72：791-800(1993)，Cawthon et al.，Cell 62：193-201(1990))，VHL(Laif et al.，Science 260：1317-1320(1993))， APC(Gorden et al.，Cell 66：589-600(1991))，DAP激酶(见，例如，Diess et al.(1995)Genes Dev.9：15-30)，p16(见，例如，Marx(1994)Science 264(5167)：1846)，ARF(见，例如，Quelle et al.(1995)Cell 83(6)：993-1000)， 神经纤维瘤蛋白(见，例如，Huynh et al.(1992)Neurosci.Lett.143(1-2)： 233-236)，和PTEN(见，例如，Li et al.(1997)Science 275(5308)： 1943-1947)。
b)免疫调节剂基因
免疫调节剂基因是调节一个或多个免疫应答的基因。免疫调节剂基因 的实例包括细胞因子诸如生长因子(例如，TGF-α.，TGF-β，EGF，FGF，IGF， NGF，PDGF，CGF，GM-CSF，G-CSF，SCF，等)，白细胞介素(例如，IL-2， IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-20，等)，干扰素(例如，IFN-α， IFN-β，IFN-γ，等)，TNF(例如，TNF-α)和Flt3-配体。
c)细胞受体配体
细胞受体配体包括这样的配体，其能够结合细胞表面受体(例如，胰岛 素受体，EPO受体，G-蛋白偶联受体，具有酪氨酸激酶活性的受体，细 胞因子受体，生长因子受体等)从而调节(例如，抑制，激活等)涉及受体的 生理途径(例如，葡萄糖水平调节，血液细胞发展，有丝分裂发生等)。细 胞受体配体的实例包括，但不限于细胞因子，生长因子，白细胞介素，干 扰素，红细胞生成素(EPO)，胰岛素，单链胰岛素(Lee et al.(2000)Nature 408：483-488)，胰高血糖素，G-蛋白偶联受体配体等)。这些细胞表面配体 可以用在治疗遭受疾病的患者中。例如，当在葡萄糖反应性肝细胞-特异性 L类型的丙酮酸激酶(LPK)启动子控制下表达时，单链胰岛素能够在 streptocozin诱导的糖尿病大鼠和自体免疫的糖尿病小鼠中导致糖尿病的 缓解而没有副作用(Lee et al.(2000)Nature 408：483-488)。这种单链胰岛素 通过用短的转角-形成七肽(Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg)取代胰岛素的C- 肽的35个氨基酸残基得以产生。
d)抗生血管基因
抗-生血管基因能够抑制新血管化。这些基因对于治疗那些癌症特别有 用，在所述癌症中血管发生在疾病的病理发展中具有作用。抗-生血管基因 的实例包括，但不限于，内皮抑制素(见例如，美国专利号6,174,861)，制 管张素(见，例如，美国专利号5,639,725)，和VEGF-R2(见例如， Decaussin et al.(1999)J.Pathol.188(4)：369-737)。
e)细胞毒性/自杀基因
细胞毒性/自杀基因是在细胞周期中能够直接或间接杀死细胞，导致调 亡，或停滞细胞的那些基因。这些基因包括，但不限于，免疫毒素基因， 单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因，胞嘧啶脱氨酶基因，黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶基因，p53基因，嘌呤核苷磷酸化酶基因，羟酸酯酶 基因，脱氧胞苷激酶基因，硝基还原酶基因，胸苷磷酸化酶基因，和细胞 色素P450 2B1基因。
在基因疗法中，已知为基因递送酶前药疗法(″GDEPT″)的技术或，备 选地，“自杀基因/前药”系统，试剂诸如无环鸟苷和鸟嘌呤(对于胸苷激酶)， 环磷酰胺(cyclophosphoamide)(对于细胞色素P450 2B1)，5-氟胞苷(对于胞 嘧啶脱氨酶)典型地与表达盒组合(例如，同时地或非同时地，例如顺序地) 进行全身施用从而获得所需的细胞毒性或抑制细胞效应(见，例如， Moolten，F.L.，Cancer Res.，46：5276-5281(1986))，所述表达盒编码本发明的 自杀基因组成。关于GDEPT系统的综述，见，例如Moolten，F.L.，The Internet Book of Gene Therapy，Cancer Therapeutics，Chapter 11(Sobol，R.E.， Scanlon，NJ(Eds)Appelton&Lange(1995))。在该方法中，异源基因在表达 盒中被递送到细胞中，所述表达盒包含RNAP启动子，所述异源基因编码 促进细胞较不敏感的第一化合物(即，“前药”)代谢为细胞更敏感的第二化 合物的酶。所述前药与基因一起或在基因传递之后被递送到细胞中。所述 酶将前药处理为第二化合物并据此响应。由Moolten提出的适合的系统是 单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因和前药鸟嘌呤。最近Zerrouqui，et al.，Can.Gen.Therapy，3(6)：385-392(1996)；Sugaya，et al.，Hum.Gen.Ther.， 7：223-230(1996)和Aoki，et al.，Hum.Gen.Ther.，8：1105-1113(1997)使用 阳离子-脂质核酸团聚体进行局部递送(即，直接肿瘤内注射)，或区域性递 送(即，腹膜内)TK基因到小鼠肿瘤中来应用了该方法。已经提出了使用应 用病毒载体的GDEPT系统的人临床试验(见，Hum.Gene Ther.，8：597-613 (1997)，和Hum.Gene Ther.，7：255-267(1996))并且其正在进行。
对于关于本发明的使用，最优选的治疗性产物是用在基因递送酶前药 疗法(″GDEPT″)中有用的那些。任何自杀基因/前药组合可以按照本发明进 行使用。适合用于本发明的数种自杀基因/前药组合在Sikora，K.OECD Documents中，Gene Delivery Systems at pp.59-71(1996)被引用，将其并入 本文作为参考，包括，但不限于下列各项： 自杀基因产物 更少活性的前药 被活化的药物 单纯疱疹病毒类 型1胸苷激酶 (HSV-TK) 鸟嘌呤(GCV)， 无环鸟苷，溴代 乙烯基-脱氧尿苷， 或其它底物 磷酸化的dGTP 类似物 胞嘧啶脱氨酶 (CD) 5-氟胞嘧啶 5-氟尿嘧啶 黄嘌呤-鸟嘌呤-磷 酸核糖转移酶 (XGPRT) 6-硫代黄嘌呤 (6TX) 6-硫鸟苷单磷酸 酯 嘌呤核苷 磷酸化酶 MeP-dr 6-甲基嘌呤 细胞色素P450 2B1 环磷酰胺 [细胞毒性 代谢物] Linamarase 苦杏仁苷 氰化物 硝基还原酶 CB 1954 硝基苯甲脒 β-内酰胺酶 PD PD芥子 β-葡糖醛酸酶 adria-glu 阿霉素 羧肽酶 MTX-丙氨酸 MTX 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 过氧化物 青霉素酰胺酶 adria-PA 阿霉素 超氧化物歧化酶 XRT DNA损伤剂 核酶 RNA 裂解产物
如果被异源基因产物代谢为细胞更敏感的化合物，任何前药可以进行 使用。优选地，细胞对于代谢物的敏感性至少是对于前药敏感性的10倍。
可以有用于本发明的GDEPT系统的修饰，包括，例如，使用修饰的 TK酶构建物，其中TK基因已经被突变从而导致前药更快地转变为药物 (见例如，Black，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，93：3525-3529(1996))。 或者，TK基因可以在二顺反子构建物中与增加其效果的另一个基因一起 进行递送。例如，为了增加还被称作“邻近效应”的“旁观者效应”(其中在被 转染的细胞附近中的细胞也被杀死)，TK基因可以与缝隙连接蛋白，诸如 连接蛋白43的基因一起进行递送。连接蛋白容许TK酶的毒性产物从一个 细胞扩散到另一个细胞。TK/连接蛋白43构建物具有CMV启动子，所述 CMV启动子通过内部核糖体进入序列和编码连接蛋白43的核酸与TK基 因可操作地进行连接。
B.SPLP和SNALP的制备及其应用
可以使用许多不同方法中的任一种来制备本发明的SPLPs和 SNALPs，即包含PEG-DAA缀合物的那些SPLPs和SNALPs。在一个实 施方案中，本发明提供通过疏水核酸-脂质中间体复合体制备的脂质-核酸 颗粒。所述复合体优选地是电荷中和的。在基于去污剂或基于有机溶剂的 系统中的这些复合体的操作可以导致颗粒形成，其中核酸被保护。
本发明提供制备血清稳定性核酸脂质颗粒的方法，其中核酸被包封在 脂双层中并且被保护免于降解。另外，本发明中形成的颗粒在生理pH下 优选地是中性或带负电荷。对于体内应用，中性颗粒是有利的，而对于体 外应用，所述颗粒更优选带负电荷的。这提供来另外的优势，即与其中核 酸可以被包封在阳离子脂质中的带正电荷的脂质体制剂比较，聚集减少。
通过本发明的方法制备的SNALPs大小是约50-约150nm，其中大部 分颗粒具有约65-约85nm的大小。通过去污剂透析方法或通过改进的反 相方法可以形成所述颗粒，所述反相方法利用有机溶剂来在混和成分的过 程中提供单相。不倾向于被任何具体形成机制所束缚，质粒或其它核酸与 阳离子脂质的去污剂溶液接触从而形成被包被的质粒复合体。这些被包被 的质粒可以聚集并沉淀。然而，去污剂的存在减少了这种聚集并且使被包 被的质粒与过量脂质(典型地，非阳离子脂质)反应从而形成颗粒，在所述 颗粒中，质粒或其它核酸被包封在脂双层中。下面描述的使用有机溶剂形 成质粒-脂质颗粒的方法按照相似的方案。
在一些实施方案中，使用去污剂透析来形成所述颗粒。因此，本发明 提供制备血清稳定性核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：
(a)在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质结合从而形成被包被的质粒-脂 质复合体；
(b)使非阳离子脂质与被包被的核酸-脂质复合体接触从而形成包括质粒- 脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液；和
(c)透析步骤(b)中的去污剂溶液从而提供血清稳定性核酸-脂质颗粒的溶 液，其中所述核酸被包封在脂双层中，所述颗粒是血清稳定性的并具有约 50-约150nm之间的大小。
通过在去污剂溶液中使质粒与阳离子脂质结合来形成被包被的核酸- 脂质复合体的起始溶液。
在这些实施方案中，所述去污剂溶液优选地是具有临界胶束浓度为 15-300mM，更优选地为20-50mM的中性去污剂的水溶液。合适的去污剂 的实例包括，例如，N，N’-((辛酰基亚氨基)-二-(1，3-亚丙基))-二-(D-葡糖酰 胺(gluconamide))(BIGCHAP)；BRIJ 35；脱氧-BIGCHAP；十二烷基聚(乙 二醇)醚；吐温20；吐温40；吐温60；吐温80；吐温85；Mega 8；Mega 9；Zwittergent3-08；Zwittergent3-10；Triton X-405；己基-，庚基-，辛 基-和壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷；和庚基硫代吡喃葡萄糖苷；其中辛基β-D- 吡喃葡萄糖苷和吐温20是最优选的。去污剂在去污剂溶液中的浓度典型地 是约100mM-约2M，优选地是约200mM-约1.5M。
将阳离子脂质和核酸典型地进行结合从而产生约1∶1-约20∶1比率，优 选地约1∶1-约12∶1比率，以及更优选地约2∶1-约6∶1比率的电荷比率(+/-)。另 外，在溶液中的质粒总浓度将典型地是约25μg/mL-约1mg/mL，优选地是 约25μg/mL-约500μg/mL，并且更优选地是约100μg/mL-约250μg/mL。在一 段时间内，在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质的结合典型地保持在室 温，所述时间足够被包被的复合体形成。或者，核酸和阳离子脂质可以在 去污剂溶液中结合并被加热到达到约37℃的温度。对于对温度特别敏感的 核酸，被包被的复合体可以在更低的温度形成，所述温度典型地低至约 4℃。
在一个优选的实施方案中，在形成的SPLP或SNALP中的核酸与脂质 的比率(质量/质量比率)的范围在约0.01-约0.08之间。起始物质的比率也在 这个范围内，因为纯化步骤典型地将未被包封的核酸以及空脂质体去除。 在另一个优选的实施方案中，所述SPLP或SNALP制剂使用每10mg总脂质 约约400μg核酸，或约0.01至约0.08，更优选地约0.04的核酸与脂质比率， 比率对应于每50μg核酸，1.25mg的总脂质。
接着，使被包被的核酸-脂质复合体的去污剂溶液与非阳离子脂质接触 从而提供核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液。有效用在该步骤 中的非阳离子脂质包括，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经 酰胺，神经鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂和脑苷脂。在优选的实施方案中，所 述非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺或 神经鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是衍生自具有C10-C24碳链的 脂肪酸的酰基基团。更优选地，所述酰基基团是月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈 酰、硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中，所述非阳离子脂质将是 1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷 脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆甾醇，或其混合物。在 最优选的实施方案中，所述核酸-脂质颗粒将是在体内具有提高特性的融合 颗粒，所述非阳离子脂质将是DSPC或DOPE。如上所阐释，本发明的核酸 -脂质颗粒将还包含PEG-DAA缀合物。此外，本发明的核酸-脂质颗粒还可 包含胆甾醇。
用于本发明方法的非阳离子脂质的量典型地是约0.5-约10mg的总脂 质比上50μg的核酸。优选地，总脂质的量是每50μg的核酸约1-约5mg。
形成核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液后，优选地通过透 析来去除去污剂。去污剂的去除导致围绕核酸的脂质双层的形成，从而提 供血清稳定性的核酸-脂质颗粒，所述颗粒具有约50nm-约150nm的大小。 因此形成的颗粒不聚集并且任选地以大小排列(size)以获得均一颗粒大小。
可以通过任一可获得的方法来对血清稳定性的核酸-脂质颗粒进行大 小排列以获得按粒度分级的脂质体。可以进行按粒度分级从而获得理想的 大小范围并且相对较窄的颗粒大小分布。
可获得一些技术从而对所述颗粒进行按大小排列到理想的大小。用于 脂质体并等同地可应用于本发明颗粒的一个大小排列的方法描述于美国 专利号4,737,323，将其并入本文作为参考。通过水浴或探针超声波处理对 颗粒混悬液进行超声波处理来产生进行性的颗粒大小减少为少于约50nm 的大小。匀浆法是依赖于剪切力将更大的颗粒断裂为更小的颗粒的另一个 方法。在一个典型的匀浆方法中，通过标准的乳状液匀浆器使颗粒再循环 直到观察到典型地在约60和80nm之间的选定颗粒大小。在两种方法中，颗 粒大小分布可以通过常规激光束颗粒大小辨别，或QELS来进行监测。
通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜来挤压颗粒也是将颗粒大小 减少到相对充分定义的大小分布的有效方法。典型地，通过膜来将混悬液 循环一次或数次直到获得理想的颗粒大小分布。可以通过连续更小孔的膜 来挤压所述颗粒从而获得大小的逐渐减少。
在另一组实施方案中，本发明提供制备血清稳定性核酸-脂质颗粒的方 法，所述方法包括：
(a)在有机溶剂中制备包括阳离子脂质和非阳离子脂质的混合物；
(b)使核酸的水溶液与步骤(a)中的所述混合物接触从而提供清晰的单 相；和
(c)移去所述有机溶剂来提供核酸-脂质颗粒的混悬液，其中所述核酸 被包封在脂双层中，所述颗粒在血清中是稳定的并且具有约50-150nm的大 小。
用于该组实施方案中的核酸(例如，质粒)，阳离子脂质和非阳离子脂 质如对于上述去污剂透析方法所描述的。
对于有机溶剂的选择将典型地包括对溶剂极性和所述溶剂可在颗粒 形成的后期被去除的容易性的考虑。也可被用作溶解剂的有机溶剂以足以 提供质粒和脂质的清晰单相混合物的量存在。合适的溶剂包括，但不限于， 氯仿、二氯甲烷、二乙醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇或其它脂族 醇诸如丙醇、异丙醇、丁醇、叔-丁醇、异丁醇、戊醇和己醇。两种或更多 溶剂的组合也可用在本发明中。
通过将核酸的第一溶液，其典型地是水溶液和脂质的第二有机溶液混 和在一起来完成核酸与阳离子和非阳离子脂质的有机溶液接触。本领域技 术人员将理解可以通过许多方法，例如通过机械方式诸如通过使用涡旋混 和器来使该混和发生。
在核酸已经与脂质的有机溶液接触后，去除所述有机溶剂，因此形成 血清稳定性核酸-脂质颗粒的水性混悬液。用于去除有机溶剂的方法将典型 地包括在减压下蒸发或将惰性气体(例如，氮或氩气)的气流鼓风吹过所述 混合物。
因此形成的血清稳定性核酸脂质颗粒将典型地大小在约50nm和 150nm之间。为了获得进一步的颗粒中大小减少或大小的均一性，可以按 照如上所述进行按大小排列。
在其它的实施方案中，所述方法将还包括添加非脂质聚阳离子，其可 用于利用本发明的组合物影响细胞的转化。合适的非脂质聚阳离子的实例 包括，但不限于，海地美溴铵(hexadimethrine bromide)(商标名 POLYBRENE下，从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA 购得)或其它heaxadimethrine的盐。其它合适的聚阳离子包括，例如，聚-L- 鸟氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚-D-赖氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亚 胺的盐。
在一些实施方案中，在将核酸包封在SPLP或SNALP中之前，可以将 聚阳离子用于压缩核酸。例如，可以将聚阳离子(例如，聚乙烯亚胺)用作 冷凝剂从而形成如在WO 00/03683中描述的PEI-浓缩的DNA复合体。
在某些实施方案中，可以在单相系统(例如，Bligh和Dyer单相或水性 和有机溶剂的类似混合物)或两相系统中进行核酸-脂质颗粒的形成，伴以 合适的混和。
当在单相系统中进行复合体的形成时，阳离子脂质和核酸每个都溶解 在一体积的单相混和物中。两种溶液的组合提供单一混合物，复合体形成 在所述混合物中。或者，所述复合体可以在两相混合物中形成，在所述两 相混合物中，阳离子脂质与核酸(其出现在水相中)结合，并将其“推”到有 机相中。
在另一个实施方案中，本发明提供制备核酸-脂质颗粒的方法，所述方 法包括：
(a)使核酸与包括非阳离子脂质和去污剂的溶液接触以形成核酸-脂 质混合物；
(b)使阳离子脂质与核酸-脂质混合物接触从而中和核酸的负电荷的 部分并形成核酸和脂质的中和电荷的核酸的混合物；和
(c)使去污剂从电荷被中和的混合物中去除从而提供脂质-核酸颗 粒，其中所述核酸被保护免于降解。
在一组实施方案中，非阳离子脂质和去污剂的溶液是水溶液。通过将 核酸的第一溶液与脂质和去污剂的第二溶液混和在一起来典型地完成核 酸与非阳离子脂质和去污剂的溶液接触。本领域技术人员将理解通过许多 方法，例如通过机械方式诸如通过使用涡旋混合器该混和可以发生。优选 地，所述核酸溶液还是去污剂溶液。用在本发明方法中的非阳离子脂质的 量典型地基于所用的阳离子脂质的量进行确定，并典型地是阳离子脂质的 量的约0.2-5倍，优选地是所用的阳离子脂质的量的约0.5-约2倍。
将因此形成的核酸-脂质混合物与阳离子脂质接触从而中和负电荷部 分，其与存在的核酸(或其它聚阴离子物质)关联。所用的阳离子脂质的量 将典型地足以中和所述核酸的至少50％的负电荷。优选地，所述负电荷将 至少有70％被中和，更优选地有至少90％被中和。有效用在本发明中的阳 离子脂质包括，例如DODAC，DOTMA，DDAB，DOTAP，DC-Chol和 DMRIE。这些脂质和相关的类似物已经在同时待审的USSN 08/316,399和 美国专利号5,208,036，5,264,618，5,279,833和5,283,185中有所描述，将其 说明书并入本文作为参考。另外，许多阳离子脂质的商业制剂是可获得的 并且可以使用在本发明中。这些包括，例如，LIPOFECTIN(可商购的阳 离子脂质体，包括DOTMA和DOPE，来自GIBCO/BRL，Grand Island，New York，USA)；LIPOFECTAMINE(可商购的阳离子脂质体，其包括DOSPA 和DOPE，来自GIBCO/BRL)；和TRANSFECTAM(可商购的阳离子脂 质，其包括在乙醇中的DOGS，来自Promega Corp.，Madison，Wisconsin， USA)。
可以通过许多技术的任一个，优选地通过将阳离子脂质的溶液和包含 所述核酸-脂质混合物的溶液混合在一起，来完成阳离子脂质与核酸-脂质 混合物的接触。在将两种溶液混和(或以任一个其它方式接触)后，与核酸 关联的负电荷部分被中和。但是，核酸仍旧保持在未压缩的状态并获得亲 水特性。
在阳离子脂质已经与核酸-脂质混合物接触后，将去污剂(或去污剂和 有机溶剂的组合)去除，因此形成所述脂质-核酸颗粒。用于去除去污剂的 方法将典型地包括透析。当有机溶剂存在时，通过在减压下蒸发或通过将 惰性气体(例如，氮气或氩气)的气流鼓风吹过混合物来典型地成功去除它。
因此形成的颗粒将典型地从约100nm到数微米来按大小排列。为了进 一步获得在所述颗粒中大小减少或大小的均一性，可以将所述脂质-核酸颗 粒进行超声波处理、过滤或进行其它用在脂质体制剂中并且是本领域技术 人员所熟知的大小排列技术。
在其它实施方案中，该方法将还包括添加非脂质聚阳离子，其可用于 利用本发明的组合物影响细胞的脂质转染。合适的非脂质聚阳离子的实例 包括，海地美溴铵(商标名POLYBRENE下，从Aldrich Chemical Co.， Milwaukee，Wisconsin，USA购得)或其它heaxadimethrine的盐。其它合适 的聚阳离子包括，例如，聚-L-鸟氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚-D- 赖氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亚胺的盐。这些盐的添加优选地在颗粒已经形 成后进行。
在另一方面，本发明提供制备核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：
(a)在溶液中使一定量的阳离子脂质与核酸接触；所述溶液包括约 15-35％的水和约65-85％的有机溶剂并且阳离子脂质的量足以产生从约 0.85-约2.0的+/-电荷比率，从而提供疏水脂质-核酸复合体；
(b)在溶液中使疏水，脂质-核酸复合体与非阳离子脂质接触从而提供 核酸-脂质混合物；和
(c)从脂质-核酸混合物去除有机溶剂从而提供脂质-核酸颗粒，其中核 酸被保护免于降解。
有效用在本发明该方面中的所述核酸、非阳离子脂质、阳离子脂质和 有机溶剂与对于上面使用去污剂的方法所述的那些相同。在一组实施方案 中，步骤(a)的溶液是单相的。在另一组实施方案中，步骤(a)的溶液是两相 的。
在优选的实施方案中，所述阳离子脂质是DODAC，DDAB，DOTMA， DOSPA，DMRIE，DOGS或其组合。在其它优选的实施方案中，非阳离 子脂质是ESM，DOPE，DOPC，DSPC，基于聚乙二醇的聚合物(例如，PEG 2000，PEG 5000，PEG-修饰的二酰基甘油，或PEG修饰的二烷氧基丙基)， 二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆甾醇或其组合。在其它优选的实施方案中， 有机溶剂是甲醇、氯仿、二氯甲烷，乙醇，二乙醚或其组合。
在一个特别优选的实施方案中，核酸是质粒；所述阳离子脂质是 DODAC，DDAB，DOTMA，DOSPA，DMRIE，DOGS或其组合；所述非阳离 子脂质是ESM，DOPE，PEGs-DAAs，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆甾醇， 或其组合(例如DSPC和PEGs-DAAs)；并且所述有机溶剂是甲醇、氯仿，二 氯甲烷、乙醇、二乙醚或其组合。
如上，优选地通过机械方式诸如通过使用涡旋混和器将核酸的第一溶 液，和脂质的第二溶液混和在一起，来典型地完成所述核酸与阳离子脂质 的接触。得到的混合物包含如上所述的复合体。接着，通过添加非阳离子 脂质和去除有机溶剂来将这些复合体转化成颗粒。非阳离子脂质的添加通 过简单将非阳离子脂质的溶液添加到包含所述复合体的混合物中典型地 完成。还可以使用反向添加。可以通过本领域那些技术人员已知的方法来 完成有机溶剂的随后的去除并也如上所述。
使用在本发明该方面中的非阳离子脂质的量典型地是用于提供电荷 被中和的脂质-核酸复合体的阳离子脂质的量(基于摩尔基础)的约0.2-约15 倍。优选地，所述量是所用的阳离子脂质的量的约0.5-约9倍。
在另一方面中，本发明提供脂质-核酸颗粒，其通过如上所述的方法进 行制备。在这些实施方案中，所述脂质-核酸颗粒是净电荷中性的或携带总 电荷，所述总电荷给所述颗粒提供更大的基因脂转染活性。优选地，颗粒 的核酸组分是编码所需蛋白质或阻断不需要蛋白质的产生的核酸。在一个 优选的实施方案中，核酸是质粒，非阳离子脂质是卵神经鞘磷脂并且所述 阳离子脂质是DODAC。在特别优选的实施方案中，所述核酸是质粒，所 述非阳离子脂质是DSPC和胆甾醇的混合物，并且所述阳离子脂质是 DOTMA。在其它特别优选的实施方案中，所述非阳离子脂质还可包括胆 甾醇。
如本文所讨论的进行多种制备SPLP-CPLs(包含CPL的SPLPs)或 SNALP-CPL’s(包含CPL的SNALPs)的通用方法。两种通用技术包括“插入 后”技术，即将CPL插入，例如预形成的SPLP或SNALP中，和“标准”技术， 其中在例如，SPLP或SNALP形成步骤中，CPL被包括在脂质混合物中。所 述插入后技术导致这样的SPLPs，所述SPLPs主要在SPLP或SNALP双层膜 的外面中具有CPLs，而标准技术提供这样的SPLPs或SNALPs，其在内面 和外面都具有CPLs。
具体而言，“插入后”包括在适合的条件下(优选地在60℃2-3小时)， 在CPL存在的情况下，形成SPLPs或SNALPs(通过任何方法)，并温育预形 成的SPLPs或SNALPs。可以将介于60-80％之间的CPL插入接受小泡外小 叶中，得到多达约5到10mol％(相对于总脂质)的最终浓度。所述方法 尤其有用于由磷脂制成的小泡(其可以包含胆甾醇)，并且还有用于包含 PEG-脂质(诸如PEG-DAAs)的小泡。
在“标准”技术的实例中，可以通过挤压来形成本发明的CPL-SPLPs和 CPL-SNALPs。在该实施方案中，包括CPL的所有的脂质被共同溶解在氯 仿中，其接着在高真空后，在氮气下被去除。所述脂质混合物在释放的缓 冲液中被水合，并通过两个具有100nm孔大小的聚碳酸酯滤器进行挤压。 得到的SPLPs或SNALPs在内面和外面上都包含CPL。在另一个标准技术 中，CPL-SPLPs或CPL-SNALPs的形成可以使用去污剂透析或乙醇透析方 法来成功完成，例如，如在美国专利号5,976,567和5,981,501中所讨论的， 将其都并入作为参考。
本发明的核酸-脂质颗粒可以单独或在具有生理可接受的载体(诸如生 理盐水或磷酸盐缓冲液)的混合物中进行施用，所述生理可接受的载体按照 施用路径和标准的药用实践来选择。一般地，生理盐水将被应用作为药用 载体。其它合适的载体包括，例如水，缓冲的水，0.4％的盐水，0.3％的甘 氨酸等，包括增加稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白，脂蛋白，球蛋白等。
药用载体通常是在颗粒形成后被添加的。因此，在颗粒形成后，所述 颗粒可以被稀释到药用载体诸如普通盐水中。
在药用制剂中颗粒的浓度可以在广泛范围内变化，即从少于约0.05重 量％，通常在或至少约2-5重量％到多至10-30重量％，并将按照选定的特定 施用方式主要通过液体体积、粘度等进行选择。例如，可以将浓度增加以 降低与治疗相关的流体负荷。这可以在患有与动脉粥样硬化相关的充血性 心力衰竭或严重高血压病的患者中是特别理想的。或者，由刺激性脂质组 成的颗粒可以被稀释到低浓度从而在施用位点减少炎症。
如上所述，本发明的核酸-脂质颗粒包含PEG-DAA缀合物。包括其它 组分通常是理想的，所述其它组分以与PEG-DAA缀合物相似的方式作用， 并作用于阻止颗粒聚集和提供增加循环生存期限以及增加核酸-脂质颗粒 到靶组织的传递的方式。这些组分包括，但不限于，PEG-脂质缀合物，诸 如到颗粒中的PEG-神经酰胺或PEG-磷脂(诸如PEG-PE)，神经节苷脂GM1- 修饰的脂质或ATTA-脂质。典型地，颗粒中成分的浓度将是约1-20％并且 更优选地从约3-10％开始。
本发明的药物组合物可以通过常规，众所周知的灭菌技术进行灭菌。 可以对水溶液进行包装以进行使用或在无菌条件下进行过滤并冷冻干燥， 在施用前将所述冷冻干燥的制剂与无菌水溶液结合。所述组合物可以如合 适的生理条件所要求包含药用辅助物质，所述辅助物质诸如pH调节剂和缓 冲剂，毒性调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。 另外，所述颗粒混悬液可以包括脂质-保护性试剂，其在储存时，保护脂质 免于自由基和脂质-过氧化损伤。亲脂性自由基猝灭剂，诸如α生育酚和水 溶性铁特异性螯合剂，诸如铁草铵是合适的。
在其应用的另一个实例中，脂质-核酸颗粒可以被结合到广泛的局部剂 型中，所述剂型包括，但不限于，凝胶，油，乳剂等。例如，包含核酸- 脂质颗粒的混悬液可以被配制并且被作为局部乳膏，糊，软膏，凝胶，洗 剂等进行施用。
一旦形成，本发明的血清稳定性核酸-脂质颗粒用于将核酸引入细胞 中。因此，本发明还提供将核酸(例如，质粒)引入细胞的方法。所述方法 通过首先如上所述形成颗粒，接着使颗粒与细胞接触一段时间来在体外或 在体内进行，所述时间足以使转染发生。
本发明的核酸-脂质颗粒可以被吸附于几乎任何与它们那混和或接触 的细胞类型。一旦被吸附，所述颗粒可以被所述细胞的部分所胞吞，与细 胞膜交换脂质，或与细胞融合。颗粒的核酸部分的转移或结合可以通过这 些途径的任何一种发生。具体而言，当发生融合时，颗粒的膜被整合到细 胞膜中并且所述颗粒的内容物与细胞内流体结合。
使用本发明的ERP测定，可以对SPLP或其它的基于脂质的载体系统的 转染效率进行优化。更具体地，ERP测定的目的是基于它们对内体膜的结 合/吸收或与其的融合/不稳定化的相对影响来区分各种阳离子脂质和 SNALPs的辅助脂质成分的作用。该测定可从数量上确定SPLP的每个组分 或其它基于脂质的载体系统怎样实现转染效率，由此使SPLP或其它的基于 脂质的载体系统优化。如上解释，内体释放参数，或备选地，ERP被定义 为：
受体基因表达/细胞
SPLP吸收/细胞
将容易对于本领域那些技术人员而言是显而易见的是可以使用任何 报告基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等)。此外，可 以用任何可检测的标记来标记脂质成分(或，备选地，SPLP的任何组分或 基于脂质的制剂)，提供抑制或对吸收到细胞中的干扰。使用本发明的ERP 测定，本领域技术人员可以评价各种脂质成分(例如，阳离子脂质，非阳 离子脂质，PEG-脂质衍生物，PEG-DAA缀合物，ATTA-脂质衍生物，钙， CPLs，胆甾醇，等)对细胞吸收和转染效率的影响，由此优化SPLP或其 它基于脂质的载体系统。通过比较各种SPLPs的每种或其它基于脂质的制 剂，可以容易地确定优化的系统，例如，SPLP或其它基于脂质的制剂， 其在细胞中具有最大的吸收，伴对最大的转染效率。
进行本发明的ERP测定的合适的标记包括，但不限于，光谱标记，诸 如荧光染料(例如，荧光素和衍生物，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)和Oregon Greenθ；若丹明和衍生物，诸如德克萨斯红，四若丹明异硫氰酸酯 (tetrarhodimine isothiocynate)(TRITC)，等，洋地黄毒苷，生物素，藻红蛋 白，AMCA，CyDyesθ等；放射性标记，诸如3H，125I，35S，14C，32P，33P， 等；酶诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等；光谱比色标记诸如胶态金或 有色玻璃或塑料珠，诸如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳等。使用本领域众所周 知的方法，可以将标记直接或间接与SPLP的组分或其它的基于脂质的载 体系统进行偶联。如上指出，可以使用广泛种类的标记，其中取决于所需 的敏感性，与SPLP的组分缀合的容易性，稳定性需求和可获得的使用仪 器和处理方案来选择标记。
V.包含PEG-DAA缀合物的脂质体
除了上述的SPLP制剂之外，本发明的PEG-DAA缀合物可以用在空 脂质体或如本文所述的包含一种或多种生物活性剂的脂质体的制剂中，包 括，例如本文所述的治疗性产物。脂质体还典型地包括阳离子脂质和非阳 离子脂质。在一些实施方案中，脂质体还包含甾醇(例如，胆甾醇)。
A.脂质体制剂
可以用于制备脂质体的多种方法描述在，例如Szoka，et al.，Ann.Rev. Biophys.Bioeng.，9：467(1980)，美国专利号4,186,183，4,217,344，4,235,871， 4,261,975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028，4,946,787，PCT公开 号WO 91/17424，Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta， 443：629-634(1976)；Fraley，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352 (1979)；Hope，et al.，Biochim.Biophys.Acta，812：55-65(1985)；Mayer，et al.， Biochim.Biophys.Acta，858：161-168(1986)；Williams，et al.，Proc.Natl.Acad Sci.，85：242-246(1988)，the text Liposomes，Marc J.Ostro，ed.，Marcel Dekker， Inc.，New York，1983，Chapter 1，和Hope，et al.，Chem.Phys.Lip.，40：89 (1986)中，将它们全部都并入作为参考。适合的方法包括，但不限于，超 声波，挤压，高压/匀浆，微观流体化(microfluidization)，去污剂透析，小 脂质体小泡的钙诱导的融合，和醚-浸入方法，这些方法都是本领域众所周 知的。
一种方法产生多层的非均质大小的小泡。在该方法中，小泡-形成脂质 被溶解在适合的有机溶剂或溶剂系统中并且在真空下或惰性气体下被干 燥从而形成薄的脂质薄膜。如果需要，所述薄膜可以被再次溶解在适合的 溶剂中，诸如叔丁醇，并接着被冷冻干燥从而形成更均一的脂质混合物， 其以更容易水合的粉末样形式存在。该薄膜被覆盖以水性缓冲溶液并且容 许水合，典型地在15-60分钟的时期内，伴随搅拌。得到的多层小泡的大 小分布可以通过在更剧烈的搅拌条件下使脂质水合或通过添加增溶去污 剂，诸如脱氧胆盐(酯)来向更小的尺寸进行转变。
可以通过超声波或挤压法来制备单层的小泡。通常用尖端(tip)超声波 仪，诸如Branson尖端(tip)超声波仪在冰浴中来进行声波振荡。典型地， 所述混悬液进行强烈的声波振荡循环。挤压可以在生物膜挤压机诸如 Lipex Biomembrane Extruder上进行。在挤压滤器中的限定的孔大小可以产 生具体大小的单层的脂质体小泡。通过不对称陶瓷滤器，诸如商购自 Norton Company，Worcester MA的Ceraflow Microfilter进行的挤压也可以 形成脂质体。还可以通过将磷脂溶解在乙醇中并接着将脂质注射到缓冲液 中，导致脂质同时形成单层小泡来制备单层小泡。此外，磷脂可以溶解在 去污剂，例如胆酸酯(盐)，Triton X，或正烷基葡糖苷中。将所述药物添加 到被溶解的脂质-去污剂胶束中后，通过许多可能的方法中的任一种来去除 去污剂，所述方法包括，透析，凝胶过滤，亲和色谱法，离心和超滤。
在制备脂质体后，在配置过程中没有经过大小筛分的脂质体可以被按 照大小排列从而获得理想的大小范围和相对较窄的脂质体大小分布。约 0.2-0.4微米的大小范围使脂质体混悬液通过常规滤器以过滤方法进行灭 菌。如果，所述脂质体已经被按大小筛分到约0.2-0.4微米，过滤灭菌方 法可以在高通量基础上进行。
可以获得数种将脂质体筛分到所需大小的技术。一种筛分方法描述在 美国专利号4,737,323中，将其并入作为参考。通过水浴或探测器声波振 荡来对脂质体混悬液进行声波处理将大小逐渐减少到少于约0.05微米大 小的小单层小泡。匀浆法是依赖于剪切力将大脂质体断裂为更小脂质体的 另一种方法。在典型的匀浆方法中，通过标准的乳剂匀浆器将多层小泡进 行再循环直到观察到选定的脂质体大小，典型地介于约0.1和0.5微米之 间。通过准电子光散射(QELS)来确定脂质体小泡的大小，如在Bloomfield， Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，10：421-450(1981)中所描述的，将其并入作为参 考。通过声波处理形成的脂质体，可以减少平均的脂质体直径。不连续的 声波振荡循环可以与QELS评价交替进行从而指导有效的脂质体合成。
通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜来挤压脂质体也是将脂质体 大小减少到相对充分限定的大小分布的有效方法。典型地，所述混悬液通 过膜循环一次或多次直到获得所需的脂质体大小分布。所述脂质体可以通 过连续地更小孔的膜进行挤压从而获得脂质体大小的之间减少。对于在本 发明中的使用，具有约0.05微米到约0.40微米范围内大小的脂质体是优 选的。在特别优选的实施方案中，脂质体介于约0.05和约0.2微米之间。
在优选的实施方案中，使用本领域那些技术人员已知的常规方法来制 备空的脂质体。
B.将脂质体用作递送载体
本发明的药物递送组合物(例如，脂质体，胶束，脂质-核酸颗粒，病 毒体等)对于治疗剂或生物活性剂的全身或局部递送是有用的，并且在诊断 分析中也是有用的。
下列讨论通常关于脂质体；然而，对于本领域技术人员而言将容易变 得显而易见的是这种相同的讨论对于本发明的其它药物递送系统(例如，胶 束，病毒体，核酸-脂质颗粒(例如，SNALP和SPLP)，等，使用本发明的 PEG-DAA缀合物，它们都可以被有利地形成)是可以充分应用的。
对于治疗剂或生物活性剂的递送，包含PEG-DAA的脂质体组合物可 以加载以治疗剂并被施用于需要治疗的受试者。使用本发明的组合物和方 法进行施用的治疗剂可以是被选择用于待治疗的疾病的适合治疗的多种 药物的任一种。通常，药物将是抗肿瘤药，诸如长春新碱(以及其它的长春 花属生物碱)，多柔比星，米托蒽醌，喜树碱，顺铂，博来霉素，环磷酰胺， 甲氨蝶呤，链佐星等。尤其优选的抗肿瘤药包括，例如，放线菌素D，长 春新碱，长春花碱，胱氨酸阿拉伯糖苷，蒽环霉素，烷化剂，铂化合物， 抗代谢药，和核苷类似物，诸如甲氨蝶呤和嘌呤和嘧啶类似物。使用本发 明的化合物和方法来将抗感染药递送到具体组织中也可以是理想的。本发 明的组合物还可以用于选择性地递送其它药物，包括，但不限于，局部麻 醉药，例如，地布卡因和氯丙嗪；β-肾上腺素阻断药，例如，普萘洛尔， 噻吗洛尔和拉贝洛尔；抗高血压药，例如可乐定和肼屈嗪；抗抑郁药，例 如，丙米嗪，阿米替林和多塞平；anti-conversants，例如，苯妥英；抗组胺 药，例如苯海拉明，chlorphenirimine和异丙嗪；抗生素/抗菌剂，例如， 庆大霉素，环丙沙星，和头孢西丁；抗真菌剂，例如，咪康唑，特康唑， 益康唑，异康唑，butaconazole，克霉唑，伊曲康唑，制霉菌素，nafiifine 和两性霉素B；杀寄生虫药，激素，激素拮抗剂，免疫调节剂，神经递质 拮抗剂，抗青光眼药，维生素，麻醉剂和显象剂。
如上提及，阳离子脂质可以用在治疗基因或寡核苷酸的递送中，其意 欲在细胞中诱导或阻断一些蛋白质的产生。核酸是带负电荷的并且可以与 带正电荷的本体结合从而形成SPLP，其适合于制剂和如上所述的核酸的 细胞递送。
本发明的PEG-DAA缀合物的另一个临床应用是作为佐剂用于对动 物和人的免疫。出于免疫目的，可以将蛋白质抗原，诸如白喉类毒素，霍 乱毒素，寄生抗原，病毒抗原，免疫球蛋白，酶和组织相容性抗原结合到 包含本发明的PEG-DAA缀合物的脂质体中或附着于其上。
包含本发明的PEG-DAA缀合物的脂质体作为疫苗的载体也是特别有 用的，其将靶向适合的淋巴器官以刺激免疫应答。
包含本发明的PEG-DAA缀合物的脂质体还可以被用作载体，其将免 疫抑制剂或免疫刺激剂选择性地递送到巨噬细胞。具体而言，使用本发明 的脂质体，可以将用于抑制巨噬细胞活性的糖皮质激素和激活巨噬细胞的 淋巴因子进行递送。
可以将包含本发明的PEG-DAA缀合物和包含靶分子的脂质体用于刺 激或抑制细胞。例如，结合具体抗原的脂质体可以用于刺激特异性结合抗 原的B细胞群体展示表面抗体。在脂质体表面上结合生长因子或淋巴因子 的脂质体可以定向于刺激表达这些因子的适合受体的细胞。使用这种方 法，骨髓细胞可以作为癌症患者的治疗的部分被刺激增殖。
可以将包含本发明的PEG-DAA缀合物的脂质体用于递送任何产物 (例如，治疗剂，诊断用药，标记或其它化合物)，所述产物包括目前被配 制在PEG-衍生的脂质体中的那些。
在某些实施方案中，理想的是使用特异于细胞类型或组织的靶向部分 来靶向本发明的脂质体。使用多种靶向部分，诸如配体，细胞表面受体， 糖蛋白，维生素(例如核黄素)和单克隆抗体靶向脂质体在以前已经进行了 描述(见，例如，美国专利号4,957,773和4,603,044，将其教导并入本文 作为参考)。所述靶向部分可以包括完整的蛋白或其部分。
靶向机制通常需要靶向试剂以这样的方式定位在脂质体的表面上，从 而使靶向部分能够与所述靶，例如，细胞表面受体相互作用。在一个实施 方案中，所述脂质体被设计为将连接体部分在脂质体形成的时候结合到膜 中。所述连接体部分必须具有被牢固包埋和锚定在膜中的亲脂性部分。其 必须还具有在脂质体的水性表面上的可通过化学方法获得的亲水性部分。 对所述亲水性部分进行选择从而在化学上适合于靶向试剂，从而使所述部 分和试剂形成稳定的化学键。因此，连接体部分通常延伸出脂质体的表面， 并且被进行构造以正确定位靶向试剂。在某些情形中，可能的是将靶向试 剂直接连接于连接体部分，但是在许多情形中，其必须更适合于使用第三 分子来充当“分子桥”。所述桥连接连接体部分和离开脂质体表面的靶向试 剂，由此使靶向试剂可自由地获得与细胞靶相互作用。
可以使用偶联靶向试剂的标准方法。例如，可以使用磷脂酰乙醇胺， 其可以被激活从而连接靶向试剂，或使用衍生化的亲脂性化合物，诸如脂 质-衍生的博来霉素。使用，例如，结合蛋白质A的脂质体可以构建抗体- 靶向的脂质体(见，Renneisen，et al.，J.Bio.Chem.，265：16337-16342(1990)I： 和Leonetti，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，87：2448-2451(1990))。靶向 部分的实例还可以包括，特异于细胞组分的其它蛋白质，包括与赘生物或 肿瘤相关的抗原。可以通过共价键来将用作靶向部分的蛋白质连接于脂质 体。见，Heath，Covalent Attachment of Proteins to Liposomes，149 Methods in Enzymology 111-119(Academic Press，Inc.1987)。其它靶向方法包括生物 素-抗生物素蛋白系统。
在某些情形中，脂质体的诊断靶向可以随后用于治疗被靶向的细胞或 组织。例如，当毒素与被靶向的脂质体偶联时，所述毒素可以接着有效破 坏被靶向的细胞，诸如肿瘤细胞。
C.将脂质体用作诊断用药
可以用标志物对使用本发明的PEG-DAA缀合物制备的药物递送组 合物，例如脂质体进行标记，所述标志物将促进各种疾病状态的诊断成像， 所述疾病包括肿瘤，发炎的关节，病变等。典型地，尽管还可以使用荧光 标记，这些标记将是放射性标志物。使用γ-辐射放射性同位素是特别有利 的，因为它们可以容易地在井式闪烁计数器中进行计数，在计数前不需要 组织匀浆并且可以用γ照相机成像。
典型地使用γ-或正子辐射的放射性同位素，诸如作为γ-辐射的.99Tc，24Na，51Cr，59Fe，67Ga，86Rb，111In，125I，和195pt；诸如作为正子辐射的68Ga，82Rb， 22Na，75Br，122I和18F。出于体内诊断的目的，还可以用顺磁同位素来标记 脂质体，如通过使用磁共振成像(MRI)或电子自旋共振(ESR)。见，例如， 美国专利号4,728，575，将其的教导并入本文作为参考。
D.脂质体的加载
将常规药物加载到脂质体中的方法包括，例如，包封技术，加载到双 层和跨膜电势加载方法。
在一个包封技术中，药物和脂质体组分溶解在有机溶剂中，其中所有 的种类是可混合的并且被浓缩以形成干燥的薄膜。接着，将缓冲液加入干 燥的薄膜中并且形成药物被结合到小泡的壁中的脂质体。备选地，将所述 药物置于缓冲液中并且加入仅有脂质成分的干燥的薄膜中。以这种方式， 药物将被包封在脂质体的水性内部。用在形成脂质体中的缓冲液可以是任 何生物相容性的缓冲溶液，例如等渗盐水，磷酸盐缓冲液，或其它低离子 强度的缓冲液。通常，药物将以从约0.01ng/mL到约50mg/mL的量存在。 接着将得到的脂质体如上所述任选地进行按大小排列，所述脂质体具有结 合在水性内部或在膜中的药物。
跨膜电势加载方法已经详细描述在美国专利号4,885,172，5,059,421，和 5,171,578中，将其内容并入本文作为参考。简而言之，跨膜电势加载方法 可以用于基本上任何常规药物，所述药物当溶解在适合的水性介质中时， 可以以带电状态存在。优选地，药物将是相对亲脂性的从而将分配到脂质 体膜中。跨膜电势通过脂质体或蛋白质-脂质体复活体的双层产生，并且所 述药物以跨膜电势的方式被加载。跨膜电势通过穿过膜产生对于一个或多 个带电种类(例如，Na+，K+和/或H+)的浓度梯度来产生。该浓度梯度通过 产生具有不同的内部和外部介质的脂质体来产生并且具有相关的质子梯 度。药物累积可以接着以通过Henderson-Hasselbach方程预期的方式发生。
可以按照标准技术来将本发明的脂质体组合物施用于受试者。优选地， 脂质体组合物的药物组合物经肠胃外，即腹膜内地，静脉内地，皮下地或 肌内地进行施用。更优选地，所述药物组合物通过推注注射来静脉内地进 行施用。用在本发明中的适合的制剂见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985)。可以 将药物组合物用于，例如诊断多种疾病，或治疗多种疾病状态(诸如炎症， 感染(病毒性和细菌性感染)，赘生物，癌症等)。
优选地，将药物组合物进行静脉内施用。因此，本发明提供用于静脉 内施用的组合物，其包括脂质体悬浮在可接收的载体，优选地水性载体中 的溶液。可以使用多种水性载体，例如，水，缓冲的水，0.9％的等渗盐水， 等。这些组合物可以通过常规，众所周知的灭菌技术进行灭菌，或可以过 滤除菌。可以将得到的水溶液原样使用或进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的 制剂在施用前与灭菌的水溶液进行组合。根据大致生理条件，所述组合物 可以包含药用辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂，湿润剂等， 例如，乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，脱水山梨醇单月桂酸 酯，三乙醇胺油酸酯等。
根据选定的施用的具体模式，在药物制剂中的脂质体组合物的浓度可 以在广泛范围内变化，即，从少于约0.05重量％，通常在或至少约2-5重 量％到多至10到30重量％并将主要根据流体体积，粘度等进行选择。对 于诊断，施用的组合物的量将取决于所用的具体标记(即，放射性标记，荧 光标记，等)，被诊断的疾病状态和临床医师的判断，但是将通常在每公斤 体重约1和约5mg之间。
本发明将通过具体实施例的方式更详细地进行描述。下列实施例是出 于举例说明的目的进行提供，并且不意欲以任何方式限制本发明。那些本 领域技术人员将容易地认识到可以被改变或修改从而产生基本上相同的 结果的多种非关键参数。
实施例
实施例1：PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA′s)的合成
随后的实施例举例说明了三种PEG-脂质，PEG-A-DMA(7)， PEG-C-DMA(8)，和PEG-S-DMA(9)的合成。它们具有共同的前体，胺脂 质1，2-肉豆蔻基氧基丙胺(5)。该脂质具有烷基链14碳单元(C14)的长度。 适合于本发明的其它的PEG DAAs可以使用相似的方案进行合成。例如， 使用(5)的C18类似物可以合成PEG-A-DSA和PEG-C-DSA。在起初步骤中 (化合物(1)的合成)可以通过简单用等克分子量的硬脂酰溴化物取代肉豆蔻 基溴化物来合成C18类似物。
1.1，2-二肉豆蔻基氧基-3-烯丙氧基丙(1)的制备
将苯(250ml)加入95％的氢化钠(11.4g，450.0mmol)，用氮气冲洗烧 瓶，并进行密封。将3-烯丙氧基-1，2-丙二醇(6.6g，50.0mmol)的苯(75ml) 溶液加入烧瓶中。使用注射器，将97％的1-溴四癸烷(36.7ml，120.0mmol) 加入烧瓶中并在持续的氮气流下使反应留待回流过夜。一旦被冷却到室 温，将过量的氢化钠用乙醇缓慢淬火直到没有观察到进一步的泡腾。将溶 液转移到具有苯(250ml)的分液漏斗中，并用蒸馏水洗涤(3×200ml)。用 硫酸镁对有机层进行干燥并在旋转蒸发仪上去除溶剂从而产生无色的油。 TLC(5％醚-己烷，在钼酸盐中显影)说明大多数起始材料已经反应形成了 产物。通过快速柱层析法(1-5％醚-己烷)对得到的产物进行进一步的纯化 以产生15.0g(57.3％)的1，2-二肉豆蔻基氧基-3-烯丙氧基丙烷(1)。
2.1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷3-醇(2)的制备
将1，2-二肉豆蔻基氧基-3-烯丙氧基丙烷1(15.0g，28.6mmol)溶解在乙 醇(250ml)中。加入三氟乙酸(20ml)，随后加入四(三苯基膦)钯(0)(4.5g，3.9 mmol)。用锡纸包裹烧瓶并用氮气冲洗它以减少与光和空气的接触，然后 在80℃搅拌过夜。在旋转蒸发仪上去除乙醇。TLC(100％CHCl3，在钼酸 盐中显影)说明大多数起始材料已经反应形成了产物。通过快速柱层析法 (100％DCM)对得到的产物进行进一步的纯化以产生11.5g(83.1％)的1，2- 二肉豆蔻基氧基-丙烷-3-醇2。
3.O-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)甲磺酸(methanesulphonate)(3)的制备
用氮气洗涤包含97％甲磺酐(methanesulphonic anhydride)(8.4g，48.0 mmol)的烧瓶并溶解在无水二氯甲烷(50ml)中。缓慢加入无水吡啶(3.9ml， 48.0mmol)，形成白色沉淀。将1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷-3-醇15(11.5g， 24.0mmol)的无水二氯甲烷(100ml)溶液加入，并于室温将反应搅拌过夜。 将溶液转移到转移到具有二氯甲烷(100ml)的分液漏斗中，用蒸馏水洗涤(3 ×100ml)。接着用二氯甲烷(100ml)将合并的水性洗涤物进行反萃取。用 硫酸镁对合并的有机层进行干燥并在旋转式气化气上去除二氯甲烷以产 生无色的油。TLC(100％CHCl3，在钼酸盐中显影)说明起始材料都已经反 应形成了产物。该反应产生了11.9g的粗制O-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基) 甲磺酸(3)。
4.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)苯邻二甲酰亚胺的制备(4)
将粗制O-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)甲磺酸3(14.2g，25.3mmol)和苯 邻二甲酰亚胺钾(13.9g，75.0mmol)用氮冲洗并溶解在无水N，N-二甲基甲 酰胺(250ml)中。将所述反应于70℃在稳定的氮气流下搅拌过夜。使用高 真空泵取代通常的吸气器在旋转蒸发仪上去除N，N-二甲基甲酰胺。将残余 物溶解在氯仿(300ml)中并将其转移到用氯仿漂洗(50ml)的分液漏斗中， 接着用蒸馏水和乙醇(3×300ml蒸馏水，50ml乙醇)洗涤。用氯仿对合并 的水性洗涤物进行反萃取(2×100ml)。用硫酸镁对合并的有机层进行干燥 并在旋转蒸发仪上去除氯仿。TLC(30％醚-己烷，在钼酸盐中显影)显示起 始物质已经反应形成产物。该反应产生13.5g的粗制
N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)苯邻二甲酰亚胺4。
5.1，2-二肉豆蔻基氧基丙胺(5)的制备
将粗制N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)苯邻二甲酰亚胺4(20.0g，25.0 mmol)溶解于乙醇(300ml)。加入一水合肼(20ml，412.3mmol)并将所述反 应回流过夜。在旋转蒸发仪上去除所述乙醇并将所述残余物溶解在氯仿中 (200ml)。过滤所述沉淀物并在旋转蒸发仪上去除氯仿。TLC(10％ MeOH-CHCl3，在钼酸盐中显影)说明大多数起始物质已经反应以形成产 物。通过快速柱层析法(0-5％MeOH-CHCl3)对该得到的产物进行进一步的 纯化以产生10.4g(89.7％，来自1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷-3-醇2的三个步 骤)的1，2-二肉豆蔻基氧基丙胺(5)。
6.甲氧基PEG2000乙酸(6)的制备
将10％的浓缩的硫酸(20ml)水(180ml)溶液加入重铬酸钠(3.0g，10 mmol)。将PEG2000甲醚(20.0g，10mmol)溶解在这种鲜橙色溶液中，并将 反应在室温进行搅拌过夜。接着，用氯仿(3×250ml)对所述产物进行抽提， 将深蓝色留在水层中。在旋转蒸发仪上去除氯仿溶剂，得到淡蓝色蜡。TLC (13％MeOH-CHCl3，在碘中显影)显示大多数起始物质已经反应形成产物。 接着，通过快速柱层析法(0-15％MeOH-CHCl3)对这种粗制物质进行进一步 的纯化。接着，将得到的产物在醚中进行结晶以产生5.6g(27.1％)的白色 固体形式的甲氧基PEG2000乙酸6。
7.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)酰胺PEG2000甲醚(7)的制备
对于N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)酰胺PEG2000甲醚(即， PEG-A-DMA)的制备，将甲氧基PEG2000乙酸6(3.4g，1.7mmol)溶解在苯 (40ml)中并用氮气冲洗。通过注射器和针穿过subaseal将草酰氯(1.7ml.2.5 g，20mmol)缓慢加入。将该反应搅拌2小时，接着在旋转蒸发仪上将苯溶 剂去除。将2，3-肉豆蔻基基氧基丙胺5(0.87g，1.8mmol)加入烧瓶中，随后 加入无水二氯甲烷(40ml)和三乙胺(1.5ml，10mmol)。将反应搅拌48小时。 加入蒸馏水(250ml)，用盐酸(1.5ml)对所述溶液进行酸化并进行摇动，收 集有机层。用氯仿(2×65ml)从水层中抽提产物。用硫酸镁对合并的有机 层进行干燥。在旋转蒸发仪上去除氯仿从而产生黄色固体。TLC(10％ MeOH-CHCl3，在硫酸铜和碘中显影)说明大多数起始物质已经反应以形成 产物。通过快速柱层析法(0-7％MeOH-CHCl3)对粗制物质进行进一步的纯 化。接着通过加入活性炭(2g)和乙醇(100ml)对其进行漂白并将所述混合 物在旋转蒸发仪上于55℃旋转30分钟。将炭滤去并在旋转蒸发仪上去除 乙醇。将所述产物进行冷冻干燥以产生1.7g蓬松白色粉末形式的(38.1％) 的N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)酰胺PEG2000甲醚7。
8.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲醚(8)的制备
对于N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲醚(即 PEG-C-DMA)的制备，按照上述1-5步骤进行。接着用氮气冲洗PEG2000甲醚(2.0g，1.0mmol)并将其溶解在无水二氯甲烷(15ml)中。加入双光气 (300μl，2.5mmol)并将所述反应在室温搅拌3小时。在旋转蒸发仪上去除 二氯甲烷并使用高真空泵将任何残余的双光气去除。用氮气冲洗所述烧瓶 并加入2，3-二肉豆蔻基氧基丙胺5(0.7g，1.5mmol)。将此溶解在无水二氯甲 烷(15ml)中，并加入三乙胺(280μl)，将该反应在室温搅拌过夜。将该溶 液转移到具有二氯甲烷(5ml)的分液漏斗中并用蒸馏水洗涤(2×20ml)。用 硫酸镁干燥有机层并在旋转蒸发仪上去除二氯甲烷。TLC(3％ MeOH-CHCl3，在钼酸盐和碘中显影)显示大多数起始物质已经反应形成了 产物。通过快速柱层析法(1.5-10％MeOH-CHCl3)对得到的产物进行进一步 的纯化以得到1.2g(46.5％)的N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯 PEG2000甲醚8。
9.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀酰胺PEG2000甲醚(13)的制备
对于N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀酰胺PEG2000甲醚(13)的制备， 按照上述1-5步骤进行。剩下的步骤按照”
a.PEG2000甲磺酸酯(9)的制备
甲磺酰酐(8.2g，47.1mmol)溶解在无水氯仿(80ml)中。将吡啶(3.8ml， 47.0mmol)加入所述溶液中并观察到发烟同时有白色沉淀物形成。将 PEG2000甲醚(31.5g，15.5mmol)的无水氯仿(70ml)溶液加入，将该反应搅拌 3小时。将已经形成的白色沉淀物滤去并在旋转蒸发仪上去除过滤物的氯 仿溶剂。TLC(5％MeOH-CHCl3，在碘中显影)显示大多数起始物质已经反 应以形成产物。通过快速柱层析法(0-10％MeOH-CHCl3)对该产物进行进一 步的纯化以产生白色固体形式的30.1g(92.8％)的PEG2000甲磺酰9。
b.PEG2000苯邻二甲酰亚胺(10)的制备
将苯邻二甲酰亚胺钾(11.1g，59.7mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰 胺(400ml)中。将PEG2000甲磺酰9(35.0g，16.7mmol)的无水N，N-二甲基甲 酰胺溶液(100ml)加入烧瓶中并使该反应于75℃搅拌过夜。使用高真空泵 取代通常的吸气器来在旋转蒸发仪上去除N，N-二甲基甲酰胺溶剂。将得到 的产物溶解在二氯甲烷(250ml)中并用蒸馏水(2×250ml)和盐水(250ml) 进行洗涤。将二氯甲烷溶剂的合并有机层在旋转蒸发仪上进行去除。TLC (7％MeOH-CHCl3，用UV光和Mary’s试剂观察)显示大多数起始物质已经 反应形成产物。通过快速柱层析法(0-10％MeOH-CH2Cl2)对得到的产物进 行进一步的纯化。将该产物从醚中进行结晶以产生19.4g(54.1％)的PEG2000苯邻二甲酰亚胺10。
c.PEG2000胺(11)的制备
将PEG2000苯邻二甲酰亚胺10(10.3g，4.8mmol)溶解在乙醇(200ml) 中。将一水合肼(6.0ml，123.7mmol)缓慢加入并将反应在100℃回流过夜。 将白色沉淀物滤去并在旋转蒸发仪上去除乙醇溶剂。将得到的产物溶解在 氯仿中并将在氯仿中不溶的剩余白色固体滤去，再次将氯仿在旋转蒸发仪 上去除。TLC(10％MeOH-CHCl3，在碘，钼酸盐和Mary’s试剂中显影)说 明所有的起始物质已经反应以形成产物。接着，将该产物从醚中结晶以产 生白色粉末形式的9.0g(93.0％)的PEG2000胺11。
d.PEG2000琥珀酰胺(12)的制备
将PEG2000胺11(9.0g，4.4mmol)和琥珀酐(3.8g，38.1mmol)溶解在吡 啶(100ml)中并将该反应搅拌过夜。将吡啶溶剂在旋转蒸发仪上于60℃进 行去除。将所述残余物溶解在蒸馏水(100ml)中，并用盐酸进行酸化，用 二氯甲烷进行抽提(100ml，2×70ml)，用硫酸镁进行干燥。TLC(10％ MeOH-CHCl3，在碘中显影)说明大多数起始物质已经反应形成了产物。通 过快速柱层析法(0-10％MeOH-CHCl3)对该产物进行进一步的纯化以产生 5.2g(55.9％)的PEG2000琥珀酰胺12。
e.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀酰胺PEG2000甲醚(13)的制备
将PEG2000琥珀酰胺(2.0g，0.9mmol)和N-羟基琥珀酰胺(0.2g，2.0mmol) 溶解在无水氯仿(10ml)中。接着，将1，3-二环己基-碳二亚胺(0.3g，1.5mmol) 的无水氯仿(5ml)溶液加入，并将所述反应搅拌1小时。加入1，2-二肉豆蔻 基氧基丙胺5(0.48g，1.0mmol)的无水氯仿(5ml)和三乙胺(0.6ml，4mmol) 的溶液中，将反应搅拌1小时。TLC(12％MeOH-CHCl3，在钼酸盐中显影) 说明大多数起始物质已经反应形成了产物。将溶液通过具有二氯甲烷的硅 藻土进行过滤，用盐酸进行酸化，并用蒸馏水(2×50ml)和盐水(50ml)进 行洗涤。将水层用二氯甲烷(50ml)进行反萃取，并在硫酸镁上来干燥合并 的有机层。通过(my)快速柱层析法(0-7％MeOH-CHCl3)来对所述产物进行 进一步的纯化以产生1.8g(69.0％)的N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀酰胺 PEG2000甲醚13。
为了检验它们的稳定性，将C18PEG-脂质的每个配制在空的脂质体中 并贮存于37℃恒温箱达42天。所述脂质体以括号中的相关摩尔比率包含 下列脂质：胆甾醇(55％)，1，2-二油基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(15％)， 1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-胆碱磷酸(20％)，PEG-脂质(10％)。此外，配制 PEG-CerC20和商业生产的PEG-DSPE，同时配制PEG-DSG作为对照。在 不同时间点，从恒温箱中移出每个样品的等份试样，用乙醇稀释并用HPLC 进行分析从而确定存在的具体PEG2000脂质的浓度。将蒸发光散射检测器 用作检测的方法。将结果显示于图2。
实施例2.被包封在SPLP中的核酸的表达，所述SPLP包括PEG-二烷氧基
丙基缀合物
该实施例描述这样的实验，所述实验比较被包封在包含PEG-二酰基 甘油缀合物的SPLP中的核酸对比被包封在包含PEG-二烷氧基丙基缀合 物的SPLP中的核酸的表达。所有的SPLP制剂包括在CMV启动子控制下 编码萤光素酶的质粒(pLO55)。 组 # 小鼠 细胞 路径 处理 路径 # 剂量 最后一 次注射 后的时 间 测定* A 6 Neuro-2a SC PBS IV 1 48hrs 体重， 血液分析， 萤光素酶 活性 B 6 Neuro-2a SC SPLP PEG-DSG IV 1 48hrs C 6 Neuro-2a SC SPLP PEG-DSPE IV 1 48hrs D 6 Neuro-2a SC SPLP PEG- 神经酰胺 C20 IV 1 48hrs E 6 Neuro-2a SC SPLP PEG-A-DSA IV 1 48hrs F 6 Neuro-2a SC SPLP PEG-C-DSA IV 1 48hrs G 6 Neuro-2a SC SPLP PEG-S-DSA IV 1 48hrs
所有的SPLP制剂包含pL055和DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-脂质 (20∶55∶15∶10)。下列制剂由：
A：PBS(pH 7.4).
B：L055PEG-DSG SPLP，0.50mg/ml.
C：L055PEG-DSPE SPLP，0.50mg/ml.
D：L055PEG-神经酰胺C20SPLP，0.50mg/ml.
E：L055PEG-A-DSA SPLP，0.50mg/ml.
F：L055PEG-C-DSA SPLP，0.50mg/ml.
G：L055PEG-S-DSA SPLP，0.50mg/ml制作。 组 小鼠 数量 接种日期 处理 注射日期 收集日期 A 6 第0天 PBS 第13天 第15天 B 6 第0天 SPLP PEG-DSG 第13天 第15天 C 6 第0天 SPLP PEG-DSPE 第13天 第15天 D 6 第0天 SPLP PEG-神经酰 胺C20 第13天 第15天 E 6 第0天 SPLP PEG-A-DSA 第13天 第15天 F 6 第0天 SPLP PEG-C-DSA 第13天 第15天 G 6 第0天 SPLP PEG-S-DSA 第13天 第15天
在第0天，将在50μl PBS中的1.5×106 Neuro2A细胞皮下施用给每只 小鼠。在第13天，小鼠被随机安排并通过静脉内(IV)注射用1剂量的SPLP 制剂或PBS进行处理。剂量的量基于在给药日每天进行的体重测量。在 SPLP施用后48小时，将小鼠称重并进行处死，并收集它们的血液，收集 下列组织：肿瘤，肝(切成两半)，肺，脾和心脏，进行称重，立即冷冻并 贮存于-80℃直到进一步分析。
通过测定被表达的萤光素酶报告蛋白的酶促活性来确定在收集的组 织中的基因表达。将结果显示于图3和4中。
结果证明在i.v.注射SPLP后48小时，包含PEG-二烷氧基丙基缀合物 的SPLP在肿瘤中的转染水平与那些包含PEG-二酰基甘油缀合物的SPLP 的转染水平基本相似。用包含PEG-二烷氧基丙基缀合物的SPLP注射的小 鼠和用包含PEG-二酰基甘油缀合物的SPLP注射的小鼠的器官(肝，肺， 脾和心脏)中的基因表达的量基本相似。
实施例3.被包封在SPLP中的核酸的表达，所述SPLP包括PEG-二烷氧基
丙基缀合物
该实施例描述这样的实验，所述实验比较被包封在SPLP中的核酸的 表达，所述SPLP包括PEG-二烷氧基丙基缀合物。所有的SPLP制剂包括 在CMV启动子控制下编码萤光素酶的质粒(pLO55)。 组 # 小鼠 肿瘤 途径 处理 途径 # 剂量 时间 测定*** A 4 Neuro-2a SC PBS IV I 48hrs 体重， 血液分析， 萤光素酶 活性 B 5 Neuro-2a SC SPLP PEG-DSG IV 1 48hrs C 5 Neuro-2a SC SPLP PEG-A-DSA IV 1 48hrs D 5 Neuro-2a SC SPLP PEG-A-DPA IV 1 48hrs E 5 Neuro-2a SC SPLP PEG-A-DMA IV 1 48hrs
所述脂质(DSPC∶CHOL∶DODMA∶PEG-脂质)在SPLP中以随后的摩尔 比(20∶55∶15∶10)存在。下列的制剂由
A：无菌过滤的PBS，5mL.
B：具有PEG-DSG的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.
C：具有PEG-A-DSA的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.
D：具有PEG-A-DPA的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.
E：具有PEG-A-DMA的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.制作。 组 # 小鼠 接种日期 处理 注射日期 收集日期 A 4 第0天 PBS 第12天 第14天 B 5 第0天 SPLP PEG-DSG 第12天 第14天 C 5 第0天 SPLP PEG-A-DSA 第12天 第14天 D 5 第0天 SPLP PEG-A-DPA 第12天 第14天 E 5 第0天 SPLP PEG-A-DMA 第12天 第14天
在第0天，将1.5×106 Neuro2A细胞施用给每只小鼠。当肿瘤是合适 天小(200-400mm3)时，小鼠被随机安排并通过静脉内(IV)注射用1剂量 的SPLP制剂或PBS进行处理。剂量的量基于在给药日每天进行的体重测 量。在SPLP施用后48小时，将小鼠处死，并收集它们的血液，收集下列 组织：肿瘤，肝(切成两半)，肺，脾&心脏，进行称重，立即冷冻并贮存 于-80℃直到进一步分析。
通过测定被表达的萤光素酶报告蛋白的酶促活性来确定在收集的组 织中的基因表达。将结果显示于图5和6中。
结果说明包括PEG-二烷氧基丙基(即，PEG-DAA)的SPLP可以方便地 用于将远端肿瘤转染到与包括PEG-二酰基甘油的SPLP相同的程度。而 且，用包含PEG-二烷基甘油的SPLP所见的转染水平与用包含PEG-二酰 基甘油(例如，PEG-DSG)的SPLP所见的那些相似。结果还说明在非肿瘤 组织中发生非常低的转染。而且，与其它SPLP制剂相比，包括PEG-二烷 氧基丙基的SPLP显示减少的毒性。
实施例4：被包封在包含PEG-二烷氧基丙基缀合物的SPLP和pSPLP中 的核酸的表达
该实施例描述这样的实验，所述实验比较了被包封在包含PEG-二烷 氧基丙基的SPLP中的核酸对比与SPLP比较的PEI浓缩的DNA(pSPLP) 中的核酸的表达。 组 #小鼠 细胞 处理 路径 最后一次注 射后的时间 点 测定* A 4 SC Neuro-2a 1剂量的PBS IV 48hrs 萤光素酶 活性 B 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-pSPLP PEG-DSG IV 48hrs C 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-pSPLP PEG-DPG IV 48hrs D 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-pSPLP PEG-DMG IV 48hrs E 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-pSPLP PEG-A-DSA IV 48hrs F 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-pSPLP PEG-A-DPA IV 48hrs G 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-pSPLP PEG-A-DMA IV 48hrs H 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-SPLP PEG-A-DSA IV 48hrs I 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-SPLP PEG-A-DPA IV 48hrs J 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-SPLP PEG-A-DMA IV 48hrs K 4 SC Neuro-2a 1剂量的L055-SPLP PEG-A-DMA 20mg pDNA/Kg IV 48hrs
所有制剂含有DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DAG(20∶55∶15∶10)。制备下 列制剂：
A：PBS(pH 7.4)
B：L055PEG-DSG pSPLP，0.5mg/ml
C：L055PEG-DPG pSPLP，0.43mg/ml
D：L055PEG-DMG pSPLP，0.5mg/ml
E：L055PEG-A-DSA pSPLP，0.5mg/ml
F：L055PEG-A-DPA pSPLP，0.5mg/ml
G：L055PEG-A-DMA pSPLP，0.5mg/ml
H：L055PEG-A-DSA SPLP，0.5mg/ml
I：L055PEG-A-DPA SPLP，0.5mg/ml
J：L055PEG-A-DMA SPLP，0.5mg/ml
K：L055PEG-A-DMA SPLP，2.1mg/ml
在第0天，将在50μl PBS中的1.5×106 Neuro2A细胞皮下施用给每只 小鼠。在第13天，小鼠被随机安排并通过静脉内(IV)注射用1剂量的SPLP 制剂或PBS进行处理。剂量的量基于在给药日当天进行的体重测量。在 SPLP施用后48小时，将小鼠称重并进行处死，并收集它们的血液，收集 下列组织：肿瘤，肝(切成两半)，肺，脾和心脏，进行称重，立即冷冻并 贮存于-80℃直到进一步分析。
通过测定被表达的萤光素酶报告蛋白的酶促活性来确定在收集的组 织中的基因表达。将结果显示于图7和8中。 组 小鼠 数量 肿瘤SC SPLP处 理 终止 A 4 第0天 第12天 第14天 B 4 第0天 第12天 第14天 C 4 第0天 第12天 第14天 D 4 第0天 第12天 第14天 E 4 第0天 第12天 第14天 F 4 第0天 第12天 第14天 G 4 第0天 第12天 第14天 H 4 第0天 第12天 第14天 I 4 第0天 第12天 第14天 J 4 第0天 第12天 第14天
结果说明与长链形式(即，PEG-DSG和PEG-A-DSA)比较，在pSPLP 中的短链PEG-脂质(即，PEG-DMG和PEG-A-DMA)的存在在肿瘤转染上 导致了约5-10倍的减少。这些结果在一起说明，当pSPLP包含C14PEG-脂 质时，观察到的pSPLP(C18PEG-脂质)对肿瘤转染超过SPLP的提高被完 全取消。这可以是由于许多因素：(1)当PEG-脂质离开pSPLP的双层时， pSPLP稳定性的增加，(2)在PEG-脂质去除后电荷的增加，或(3)C14 PEG-脂质的条件没有被优化(例如，在双层中阴离子脂质的量)。如果这些 中的任何一种在组织中，还需要进行其它的实验来确定是那一种。此外， 对于所有的系统而言，在其它被测试的器官中的活性是相当低的。有趣的 是，20mg/kg剂量的PEG-A-DMA SPLP给出的肿瘤中的萤光素酶基因表 达的水平与5mg/kg剂量所给出的肿瘤中的萤光素酶基因表达水平相当， 但是与相同的5mg/kg剂量相比，在肝中的基因表达高得多。
实施例5：用SNALPS使基因表达沉默
该实施例举例说明在共施用SPLPs和SNALPs后，在具有Neuro 2A 肿瘤的小鼠中的基因表达的沉默，所述SPLPs包含在CMV启动子控制下 编码萤光素酶的质粒，所述SNALPs包含抗-萤光素酶siRNA。 组 # 小鼠 肿瘤 途径 处理 时间点 途径 # 剂量 1 3 Neuro-2a SQ PBS /PBS 48h IV 1 24A 4 L055-SPLP /PBS 混和 24h 24B 4 L055-SPLP/抗-1uc siRNA脂质体混和 48A 4 L055-SPLP /PBS 混和 48h 48B 4 L055-SPLP/抗-luc siRNA脂质体混和 72A 4 L055-SPLP/PBS 混和 72h 72B 4 L055-SPLP/抗-luc siRNA脂质体混和 组 # 小鼠 接种日 期 途 径 IV处理 时间点 注射日期 收集日期 1 3 第0天 SQ PBS/PBS 48h 第13天 第15天 24A 4 L055-SPLP/ PBS混和 24h 第14天 24B 4 L055-SPLP/ 抗-luc siRNA 脂质体混和 第14天 48A 4 L055-SPLP/ PBS混和 48h 第13天 48B 4 L055-SPLP/ 抗-luc siRNA 脂质体混和 第13天 72A 4 L055-SPLP/ PBS混和 72h 第12天 72B 4 L055-SPLP/ 抗-luc siRNA 脂质体混和 第12天
在第0天，以在50μL磷酸盐缓冲溶液总体积中1.5×106细胞的剂量， 用Neuro 2A细胞对36只雄性A/J小鼠(Jackson Laboratories)进行皮下接种。 一旦肿瘤达到合适大小后(典型地在第9天或其后)，将200-240μl的PBS 或如上述实施例6描述所制备的SPLP，SNALP制剂(总共100μg核酸)进 行静脉内施用。在施用PBS，SPLP或SPLP和SNALP的混合物24，48 或72小时后，将小鼠处死，收集器官(例如，肝、肺、脾、肾、心脏)和肿 瘤并进行萤光素酶活性的评价。
在单一iv给药后48小时，pL055 SPLP和抗-luc siRNA SNALP(都包 含PEG-A-DMA)的共施用最大地减少萤光素酶基因表达达40％。结果显示 于图13中。
实施例6：包含PEG-DAA缀合物的SPLP的吸收
该实施例举例说明在体外，哺乳动物细胞对包含PEG-DAA缀合物的 SPLP的吸收。下表提出的SPLP制剂用3H-CHE进行标记，并且在4℃或 37℃被温育于细胞上达24小时。SPLP包含2，4，或10mol％PEG-C-DMA。 M0l％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DODMA) A 20∶50∶10∶15 B 20∶61∶4∶15 C 20∶63∶2∶15
SPLP的吸收在37℃发生的效率更高，并且PEG-C-DMA的量减少。 将数据举例说明于图14。
实施例7：包含PEG-DAA缀合物的SPLP的生物分布和血液清除率
该实施例举例说明包含PEG-DAA缀合物的SPLP的生物分布和血液 清除率。包含PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的3H-CHE-标记的SPLP被静 脉内施用于携带Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中。如下配制SPLP： 组 处理 Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶阳离子脂 质) A SPLP(15mol％PEG-C-DMA) 20∶50∶15∶15 B SPLP(10mol％PEG-C-DMA) 20∶55∶10∶15 C SPLP(5mol％PEG-C-DMA) 20∶60∶5∶15
在SPLP施用48小时后确定SPLP在肝，脾，肺和肿瘤中的生物分布。 将结果显示于图15中。
在SPLP施用后1，2，4和24小时后确定SPLP的血液清除率。将结 果显示于图16中。
实施例8：包含PEG-DAA缀合物的SPLP和SNALP的生物分布和血液 清除率
该实施例举例说明包含PEG-DAA缀合物的SPLP和SNALP的生物 分布和血液清除率。包含PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的3H-CHE-标记的 SPLP或SNALP被静脉内施用于携带Neuro-2a肿瘤的雄性A/J小鼠中。 SPLP包括被包封的编码萤光素酶的质粒，SNALP包括被包封的抗萤光素 酶siRNA序列。SPLP和SNALP制剂都具有下列脂质比率：DSPC 20％： 胆甾醇55％：PEG-脂质10％：DODMA 15％。
在SPLP或SNALP施用后24小时，确定SPLP或SNALP在肝，脾， 肾上腺，肿瘤，小肠，淋巴结，肾，大肠，股骨，心脏，胸腺，睾丸和脑 中的生物分布。将结果显示于图17。
在施用SPLP和SNALP后1，2，4，8，和24小时确定包含PEG-C-DMA 或PEG-C-DSA的SPLP和SNALP的血液清除率。将结果显示于图18中。
实施例9：包含PEG-DAA缀合物的SPLP和pSPLP对细胞的转染
该实施例描述了三个单独的实验，进行所述实验来评价在用各种包封 了质粒的SPLP制剂体内转染后，在器官和肿瘤中的基因表达，所述质粒在 CMV启动子的控制下编码萤光素酶。
第一个实验评价在静脉内施用SPLP和pSPLP后，在携带Neuro2A 肿瘤的雄性A/J小鼠中的萤光素酶基因表达。比较包含C14和C18 PEG-C-DAAs的制剂与等价的PEG-DAGs。PEG部分具有2000道尔顿的 分子量。DODMA被用作SPLP中的阳离子脂质。将POPG或DOP用作 pSPLP中的阴离子脂质。如下配制SPLP和pSPLP： 样品描述，(PEG-脂质类型， 带电的脂质类型) Mol％ (DSPC∶Chol∶PEG-脂质∶带电的脂质) A SPLP(PEG-DSG，DODMA) 20∶50∶15∶15 B SPLP(PEG-DMG，DODMA) 20∶55∶10∶15 C SPLP(PEG-C-DSA， DODMA) 20∶60∶5∶15 D SPLP(PEG-C-DMA， DODMA) 20∶62.5∶2.5∶15 E pSPLP(PEG-C-DSA，POPG) 20∶55∶10∶15 F pSPLP(PEG-C-DSA，DOP) 20∶60∶5∶15 G pSPLP(PEG-DS G，POPG) 20∶62.5∶2.5∶15
在静脉内施用SPLP和pSPLP后48小时，在肝，肺，脾，心脏和肿 瘤中测量萤光素酶基因表达。对于所有测试的SPLP和pSPLP制剂而言， 相对于其它组织类型，萤光素酶的表达在肿瘤中最高。将结果显示于图19。
第二个实验评价在静脉内施用SPLP后，在携带Neuro2A肿瘤的雄性 A/J小鼠中的萤光素酶基因表达，所述SPLP包括不同百分比(即，15％，10％， 5％，或2.5％)的PEG-C-DMA。 Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DODMA) A 20∶50∶15∶15 B 20∶55∶10∶15 C 20∶60∶5∶15 D 20∶62.5∶2.5∶15
在施用SPLP后48小时，测量在肿瘤中的萤光素酶的表达。将结果显 示于图20。
第三组实验评价在静脉内施用SPLP后，在携带Neuro2A肿瘤的雄性 A/J小鼠中的萤光素酶基因表达，所述SPLP包括具有不同大小的PEG部 分的PEG-C-DMA缀合物(即，2000或750道尔顿)。 样品描述 A SPLP-PEG2000-C-DMA (CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG2000-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％) B SPLP-PEG750-C-DMA/DODMA (CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG750-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％) C SPLP-高PEG750-C-DMA (CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG750-C-DMA 50∶20∶15∶15mol％) D SPLP-DODAC (CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG2000-C-DMA∶DODAC 45∶20∶15∶10∶10mol％) 0.35mg/ml
在施用SPLP后48小时，在肝，肺，脾，心脏和肿瘤中测量萤光素酶 基因表达。对于所有测试的SPLP制剂而言，相对于其它组织类型，萤光 素酶表达在肿瘤中最高。将结果显示于图21中。
实施例10：在体外用包含PEG-DAA缀合物的SNALPs使基因表达沉默
该实施例描述在体外在递送包封siRNA的SNALP后，基因表达的沉 默。在存在或缺乏氯喹的情况下，使表达萤光素酶的Neuro2A-G细胞与包 封抗萤光素酶siRNA(即，siRNA，其包括下列序列： GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU 并靶向DNA序列： GATTATGTCCGGTTATGTATT)的SNALP制剂接触达48小时。所述SNALP 制剂包含不同量的PEG-C-DMA(C14)，即，1％，2％，4％，或10％。阳离子 脂质是DODMA。 组 处理 Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DAA∶DODMA) A PBS - B 裸siRNA - C SNALP(PEG-C-DMA) 20∶40∶10∶30 D SNALP(PEG-C-DMA) 20∶46∶4∶30 E SNALP(PEG-C-DMA) 20∶48∶2∶30 F SNALP(PEG-C-DMA) 20∶49∶1∶30 将结果显示于图22。
实施例11：在体内用包含PEG-DAA缀合物的SNALPs使基因表达沉默
该实施例描述这样的实验，其说明在体内，在施用包封siRNA的 SNALP后，基因表达的沉默。
该实验说明包封siRNA的SNALP的施用，可以使在转移瘤中的基因 表达沉默。用包含PEG-DAA缀合物和包封抗萤光素酶siRNA(即，siRNA 包含下列序列：GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU并靶向DNA序列： GATTATGTCCGGTTATGTATT)的SNALPs处理携带Neuro-2a肿瘤的雄 性A/J小鼠，所述小鼠表达萤光素酶，具有转移性肝肿瘤。所有的SNALPs 具有如下配制：DSPC 20％∶胆甾醇55％∶PEG-C-DMA 10％∶DODMA 15％。小鼠接受SNALP的单一静脉内施用。在SNALP注射后48小时测 定肿瘤中的萤光素酶表达。所述结果证明SNALP的施用可以在体内在 SNALP施用的位点的远端位点使基因表达沉默。将这些结果显示于图23 中。
要理解的是上述描述意欲举例说明而不是限制性的。在阅读上述描 述后，许多实施方案将对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。因此， 本发明的范围应该不是参考上述描述来确定，而是应该参考后附的权利要 求连同被授予这些权利要求的等价物的充分范围来确定。出于所有的目 的，将所有的文章和参考文献，包括专利申请，专利和PCT出版物的内容 并入本文作为参考。