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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310134124.4 (22)申请日 2013.04.18 C12N 5/076(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院兰州畜牧与兽药 研究所 地址 730050 甘肃省兰州市七里河区硷沟沿 335 号 (72)发明人 郭宪 丁学智 阎萍 梁春年 王宏博 鲁京兰 等 . 肝素、 咖啡因、 丙酮酸钠、 BSA 对 延边黄牛卵母细胞体外受精效果的影响. 中国畜 牧兽医 .2012, 第 39 卷 ( 第 1 期 ),118-121 页 . 郭宪 等 . 提高牛胚胎体外生产效率的研究 进。
2、展 .中国畜牧兽医 .2004, 第 32 卷 ( 第 2 期 ),37-39 页 . 阎萍 等 . 牦牛卵巢卵母细胞体外培养成熟 条件的建立 .畜牧与兽医 .2006, 第 38 卷 ( 第 1 期 ),14-16 页 . 郭宪 . 牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研 究 .中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 硕 士 ) 农业科技辑 .2004,D050-13 页 . (54) 发明名称 一种牦牛精子体外获能的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种牦牛精子体外获能的方 法， 主要包括 ： 牦牛冷冻精液解冻方法、 精子体外 获能液及获能方法、 精子体外受精液及获能效果 评估方法。并提供了牦牛精。
3、子体外获能的具体条 件， 确保牦牛精子体外获能的质量和效率。 本发明 技术与方法全面， 操作方便， 测定结果准确， 可完 全用于牦牛精子体外获能或胚胎体外生产， 能够 有效提高牦牛的繁殖效率。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 冯娟 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 CN 103173406 B 2016.05.11 CN 103173406 B 1.一种牦牛精子体外获能的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)从液氮罐中取出冷冻精液细管， 空气中停留6s， 然后投入3738的恒温水浴锅 中， 待其融化1/2时取出； (2)。
4、用灭菌卫生纸搽去细管外水分， 再迅速用酒精棉球搽拭一次， 置于超净工作台内使 其完全溶解； (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； 所述步骤(3)上浮法步骤为： 向溶解后的精液中加入1mL精子获能液， 混匀后分装于4个 小塑料离心管中， 38.5CO2培养箱上浮1h， 然后将4个离心管中的上清液小心收集到1个 10mL离心管中， 约0.60.8mL， 700800g离心洗涤2次， 810min/次； 洗涤后的精子沉淀用 含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成21074107个/mL， 38.5预孵获能处理2530min， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 1.0mM丙酮酸。
5、钠组成； 所述TALP基础液由100mM 氯化钠、 3.1mM氯化钾、 2.1mM氯化钙、 0.4mM氯化镁、 0.29mM磷酸二氢钠、 21.6mM乳酸钠、 10mMHepes、 25mM碳酸氢钠及抗生素组成； 所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素； 所述 CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和； (4)将步骤(3)处理的精子， 移入受精液中， 精卵共培养， 进行体外受精， 检测精子获能 效果； (5)受精1618h后， 用早期胚胎培养液把受精卵洗涤35遍， 转移至早期胚胎培养液 中， 48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。 2.根据权利要求1所述的方法， 。
6、其特征在于， 所述步骤(4)体外受精步骤为： 将体外成熟 的卵母细胞用受精液洗涤35遍， 放入预孵2h的50 L受精液微滴中， 每滴1520枚； 每微滴 受精液加入50 L获能后的精子悬液， 使精子的最终浓度为1106个/mL。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(5)中， 早期胚胎培养液为基础液 M199添加10胎牛血清及抗生素； 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 培养条件为 CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103173406 B 2 一种牦牛精子体外获能的方法 技术领域 0001 本发明属牦牛繁殖领域， 。
7、涉及牦牛胚胎生物技术， 具体涉及一种牦牛精子体外获 能的方法。 背景技术 0002 牦牛是分布于青藏高原及毗邻地区特有的牛种资源。 牦牛的繁殖具有明显的季节 性， 牦牛发情具有普通牛的一般特征， 但不如普通牛种明显。 但特殊的自然生态环境条件， 使牦牛形成了晚熟、 繁殖力低的生态生理特性。 0003 随着现代生物技术的发展， 胚胎生物技术逐步应用于牦牛科学研究， 但由于重复 性差、 结果不稳定， 致使牦牛胚胎生物技术在牦牛生产上还未有效开展。 尤其是牦牛体外受 精技术， 普遍存在的问题是受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定， 体外受精的总 成功率偏低。 而牦牛精子的体外获能是体外受精技术的。
8、关键环节， 因此极有必要针对牦牛 生态生理特性与繁殖特征， 研制出一种牦牛精子体外获能的方法， 完善牦牛胚胎体外生产 技术方案， 加速生物技术在牦牛繁育中的应用， 从而提高牦牛繁殖效率， 全面发挥优良牦牛 的繁殖特性。 发明内容 0004 为了降低精子解冻过程中的损伤， 提高有效获能精子数， 解决上述技术问题， 本发 明针对牦牛冷冻精液与精子特点， 提供一种简便、 合理的牦牛精子体外获能的方法， 结果准 确， 易于操作， 可用于牦牛胚胎体外生产及相关科学研究中， 并为牦牛胚胎生物技术发展提 供参考。 0005 其技术方案如下： 0006 一种牦牛精子体外获能的方法， 包括如下步骤： 0007 。
9、(1)从液氮罐中取出冷冻精液细管， 空气中停留6s， 然后投入3738的恒温水 浴锅中， 待其融化1/2时取出； 0008 (2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分， 再迅速用酒精棉球搽拭一次， 置于超净工作台 内使其完全溶解； 0009 (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； 0010 (4)将步骤(3)处理的精子， 移入受精液中， 精卵共培养， 进行体外受精， 检测精子 获能效果； 0011 (5)受精1618h后， 用早期胚胎培养液把受精卵洗涤35遍， 转移至早期胚胎培 养液中， 48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。 0012 进一步优选， 所述步骤(3)上浮法步骤为： 向溶解后的精液中。
10、加入1mL精子获能液， 混匀后分装于4个小塑料离心管中， 38.5CO2培养箱上浮1h， 然后将4个离心管中的上清液 小心收集到1个10mL离心管中， 约0.60.8mL， 700800g离心洗涤2次， 810min/次； 洗涤 后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成21074107个/mL， 38.5预孵获能 说明书 1/4 页 3 CN 103173406 B 3 处理2530min， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 1.0mM丙酮酸钠组成； 所述TALP 基础液由100mM氯化钠、 3.1mM氯化钾、 2.1mM氯化钙、 04mM氯化镁、 0.29mM磷酸。
11、二氢钠、 21.6mM乳酸钠、 10mMHepes、 25mM碳酸氢钠及抗生素组成； 所述抗生素为75mg/L青霉素+ 50mg/L链霉素； 所述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0013 进一步优选， 所述步骤(4)体外受精步骤为： 将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤 35遍， 放入预孵2h的50 L受精液微滴中， 每滴1520枚； 每微滴受精液加入2550 L获能 后的精子悬液， 使精子的最终浓度为1106个/mL， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/ mLBSA、 0.09mM丙酮酸钠组成； 所述TALP基础液由114mM氯化钠、 3.2mM氯化钾、 2.0。
12、mM氯化钙、 0.5mM氯化镁、 0.4mM磷酸二氢钠、 25mM碳酸氢钠、 10mM乳酸钠及抗生素组成； 所述抗生素为 30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 所述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0014 进一步优选， 所述步骤(5)中， 早期胚胎培养液为基础液M199添加10胎牛血清及 抗生素； 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 培养条件为CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0015 本发明的有益效果： 0016 本发明解冻的牦牛冷冻精液精子活力 0.35， 获能后精子活力 0.7， 受精用精子 密度11062106个/mL， 受。
13、精用精子畸形率 15， 成熟卵母细胞受精后卵裂率 60。 本发明用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面， 操作方便， 测定结果准确， 易于牦 牛胚胎体外生产使用。 本发明用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面， 操作方便， 测定结果准确， 易于牦牛胚胎体外生产使用。 具体实施方式 0017 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 0018 实施例1 0019 解冻1支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。 0020 (1)从液氮罐中取出1支牦牛冷冻精液细管， 空气中停留6s， 然后投入3738 的恒温水浴锅中， 待其融化1/2时取出。 0021 (2)用灭菌卫生纸搽去细管外水。
14、分， 再迅速用酒精棉球搽拭一次， 置于超净工作台 内使其完全溶解。 0022 (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； 上浮法步骤为： 向溶解后的精液中加入 1mL精子获能液， 混匀后分装于4个小塑料离心管中， 38.5CO2培养箱上浮1h， 然后将4个离 心管中的上清液小心收集到1个10mL离心管中， 约0.60.8mL， 700g离心洗涤2次， 10min/ 次； 洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成21074107个/mL， 38.5 预孵获能处理25min， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 1.0mM丙酮酸钠组成； 所述 TALP基础液由100。
15、mM氯化钠、 3.1mM氯化钾、 2.1mM氯化钙、 0.4mM氯化镁、 0.29mM磷酸二氢钠、 21.6mM乳酸钠、 10mMHepes、 25mM碳酸氢钠及抗生素组成； 所述抗生素为75mg/L青霉素+ 50mg/L链霉素； 所述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0023 (4)将步骤(3)处理的精子， 移入受精液中， 精卵共培养， 进行体外受精， 检测精子 获能效果； 体外受精步骤为： 将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤35遍， 放入预孵2h的50 L受精液微滴中， 每滴20枚； 每微滴受精液加入50 L获能后的精子悬液， 使精子的最终浓度 说明书 2/4 页。
16、 4 CN 103173406 B 4 力1106个/mL， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 0.09mM丙酮酸钠组成； 所述TALP 基础液由114mM氯化钠、 3.2mM氯化钾、 2.0mM氯化钙、 0.5mM氯化镁、 0.4mM磷酸二氢钠、 25mM 碳酸氢钠、 10mM乳酸钠及抗生素组成； 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 所述CO2 培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0024 (5)受精18h后， 用早期胚胎培养液把受精卵洗涤35遍， 转移至早期胚胎培养液 中， 48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。 早期胚胎培养液为基础。
17、液M199添加10胎牛血 清及抗生素； 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 培养条件为CO2含量5、 温度 38.5、 湿度饱和。 0025 实施例2 0026 解冻2支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。 0027 (1)从液氮罐中取出2支牦牛冷冻精液细管， 空气中停留6s， 然后投入3738 的恒温水浴锅中， 待其融化1/2时取出。 0028 (2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分， 再迅速用酒精棉球搽拭一次， 置于超净工作台 内使其完全溶解。 0029 (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； 上浮法步骤为： 向溶解后的精液中加入 1.5mL精子获能液， 混匀后分装于6个小塑料。
18、离心管中， 38.5CO2培养箱上浮1h， 然后将6个 离心管中的上清液小心收集到1个15mL离心管中， 约0.81.2mL， 800g离心洗涤2次， 8min/ 次； 洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成21074107个/mL， 38.5 预孵获能处理30min， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 1.0mM丙酮酸钠组成； 所述 TALP基础液由100mM氯化钠、 3.1mM氯化钾、 2.1mM氯化钙、 0.4mM氯化镁、 0.29mM磷酸二氢钠、 21.6mM乳酸钠、 10mMHepes、 25mM碳酸氢钠及抗生素组成； 所述抗生素为75mg/L青霉素。
19、+ 50mg/L链霉素； 所述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0030 (4)将步骤(3)处理的精子， 移入受精液中， 精卵共培养， 进行体外受精， 检测精子 获能效果； 体外受精步骤为： 将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤35遍， 放入预孵2h的50 L受精液微滴中， 每孔20枚卵母细胞； 每微滴加入25 L获能后的精子悬液， 使精子的最终浓 度为1106个/mL， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 0.09mM丙酮酸钠组成； 所述 TALP基础液由114mM氯化钠、 3.2mM氯化钾、 2.0mM氯化钙、 0.5mM氯化镁、 0.4mM磷酸二氢。
20、钠、 25mM碳酸氢钠、 10mM乳酸钠及抗生素组成： 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 所 述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0031 (5)受精16h后， 用早期胚胎培养液把受精卵洗涤35遍， 转移至早期胚胎培养液 中， 48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。 早期胚胎培养液为基础液M199添加10胎牛血 清及抗生素； 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 培养条件为CO2含量5、 温度 38.5、 湿度饱和。 0032 实施例3 0033 200枚牦牛卵母细胞体外受精用冷冻精液体外获能处理。 0034 (1)从液氮罐中取出。
21、2支牦牛冷冻精液细管， 空气中停留6s， 然后投入3738 的恒温水浴锅中， 待其融化1/2时取出。 0035 (2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分， 再迅速用酒精棉球搽拭一次， 置于超净工作台 内使其完全溶解。 说明书 3/4 页 5 CN 103173406 B 5 0036 (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； 上浮法步骤为： 向溶解后的精液中加入 1.5mL精子获能液， 混匀后分装于6个小塑料离心管中， 38.5CO2培养箱上浮1h， 然后将6 个离心管中的上清液小心收集到1个15mL离心管中， 约0.81.2mL， 700800g离心洗涤2 次， 810min/次； 洗涤后的精子。
22、沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成21074107 个/mL， 38.5预孵获能处理30min， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 1.0mM丙酮 酸钠组成； 所述TALP基础液由100mM氯化钠、 3.1mM氯化钾、 2.1mM氯化钙、 0.4mM氯化镁、 0.29mM磷酸二氢钠、 21.6mM乳酸钠、 10mMHepes、 25mM碳酸氢钠及抗生素组成； 所述抗生素 为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素； 所述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0037 (4)将步骤(3)处理的精子， 移入受精液中， 精卵共培养， 进行体外受精， 检。
23、测精子 获能效果； 体外受精步骤为： 将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤35遍， 放入预孵2h的 600 L四孔培养板受精液中， 每孔50枚卵母细胞； 每孔受精液加入100200 L获能后的精子 悬液， 使精子的最终浓度为1106个/mL， 所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、 0.09mM 丙酮酸钠组成； 所述TALP基础液由114mM氯化钠、 3.2mM氯化钾、 2.0mM氯化钙、 0.5mM氯化镁、 0.4mM磷酸二氢钠、 25mM碳酸氢钠、 10mM乳酸钠及抗生素组成； 所述抗生素为30mg/L青霉素+ 20mg/L链霉素； 所述CO2培养箱中： CO2含量5、 温度38.5、 湿度饱和。 0038 (5)受精16h后， 用早期胚胎培养液把受精卵洗涤35遍， 转移至早期胚胎培养液 中， 48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。 早期胚胎培养液为基础液M199添加10胎牛血 清及抗生素； 所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素； 培养条件为CO2含量5、 温度 38.5、 湿度饱和。 0039 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 本发明的保护范围不限于此， 任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 通过技术方案的简单变化或等效替 换均落入本发明的保护范围内。 说明书 4/4 页 6 CN 103173406 B 6 。