技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特 青霉（Penicillium guanacastense）JP-NJ2及其应用。
背景技术
马尾松是我国重要的造林先锋树种。磷是植物生长发育所需的大量和限制性 元素之一，磷可以加速苗木的生长，并在一定程度上提高苗木的抗逆性和抗病性。 由于土壤中磷素的供应不足，导致我国南方地区许多马尾松人工林生长不良，生 物量下降，衰退现象较严重。在自然条件下，土壤中90%以上的磷为无效磷，植 被难以直接吸收利用，施入的磷肥又多与土壤中金属离子结合形成难溶性磷酸 盐，同时磷肥过多施用会导致水体富营养化，破坏生态平衡。目前，通过以解磷 微生物肥料来提高林地土壤磷的利用率成为人们关注的热点之一。
土壤中能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态的微生物称为 解磷微生物（phosphate-solubilizing microorganisms，PSMs），其种类包括真菌、 细菌及放线菌等。研究表明解磷真菌（Solubilizing phosphorus fungus）在数量和 种类上都少于解磷细菌，但解磷真菌的溶磷能力一般要强于细菌，甚至是细菌的 几十倍，且遗传性状更加稳定，同时解磷真菌还可在一定程度上促进植株生长， 在微生物肥料应用方面具有极大潜力。然而目前对解磷真菌的研究很少，且主要 筛选自农作物根际土壤，从林地生态系统进行筛选研究及报道较少。目前，如何 挖掘土壤磷库资源，提高土壤中磷的利用效率是我国林业生产中急需解决的问 题。因此，从林地根际土壤中筛选高效解磷真菌，是改善林地土壤养分，促进松 树生长的一条有效途径。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种马尾松根 际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2，其具有较强的解磷能力。本发明的另一目 的是提供一种上述马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在促进马尾松苗 生长中的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种马尾松根际解磷真菌，其分类命名为瓜纳卡斯特青霉（Penicillium guanacastense）JP-NJ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013476，保藏日期为：2013年10月17日，保藏地址为：中国武汉， 武汉大学。
所述的马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在促进马尾松苗木生长 中的应用。
所述的马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在溶解难溶性无机磷酸 盐及难溶性有机磷中的应用。
所述的无机磷酸盐包括磷酸铝、磷酸铁和磷酸钙。
所述的有机磷包括卵磷脂和草甘膦。
瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2，是从江苏省林业科学研究院内50年生马尾松的根 际土壤中筛选获得的。
JP-NJ2的生物学特征：JP-NJ2菌株在CYA培养基上25℃培养7d，菌落直径 33mm左右，近于平坦，质地呈絮状兼绒状，有时有规则的放射状皱纹，分生孢 子面呈灰绿色，近于烟灰色，中间部分呈现橘褐色，渗出液少量，黄褐色（图1）； 菌落反面呈橘黄色（图2）。分生孢子梗具帚状分枝，分生孢子球形或近球形。
菌落在NBRIP培养基上，25℃培养7d，菌落直径20-23mm之间，溶磷圈直 径32-38mm之间。菌落较为平坦，质地呈絮状，中间呈烟灰色；菌落中间菌丝 密集，有大量孢子产生，菌落外围分生孢子较少，较稀疏，呈现橘黄色（图3）； 整个菌落反面呈橘黄色（图4）。
JP-NJ2菌株18SrDNA ITS序列，见SEQ ID NO.1所示。将序列与GenBank 数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，JP-NJ2菌株与Penicillium guanacastense的相似度为95%。结合形态特征和18SrDNA ITS序列分析，JP-NJ2 菌株鉴定为瓜纳卡斯特青霉（Penicillium guanacastense）JP-NJ2。
上述的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2对磷酸三钙具有很强的解磷能力。菌剂盆栽 接种试验表明，JP-NJ2菌株可将土壤中难溶性无机磷转变为有效态磷供马尾松 苗木吸收利用，明显促进马尾松苗木的生长。
有益效果：与现有技术相比，本发明的瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2具有的优势 包括：对难溶性无机磷酸盐磷酸三钙（Ca3(PO4)2）、磷酸铝（AlPO4）和磷酸铁 （FePO4·4H2O）具有较好的溶解能力；对难溶性有机磷卵磷脂具有较好的溶解 能力；对有机磷农药草甘膦具有良好的生物降解功能；通过盆栽试验证实菌剂接 种马尾松苗可以明显的促进马尾松的生长。因此，本发明的瓜纳卡斯特青霉 JP-NJ2能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1是JP-NJ2菌株在CYA培养基上生长7d的菌落特征正面图；
图2是JP-NJ2菌株在CYA培养基上生长7d的菌落特征反面图；
图3是JP-NJ2菌株在NBRIP培养基上生长7d的菌落特征正面图；
图4是JP-NJ2菌株在NBRIP培养基上生长7d的菌落特征反面图；
图5是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时对4种不同磷源的溶解能力结果图；
图6是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时对4种不同磷源的解磷率结果图；
图7是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时解无机磷能力和pH值的动态变化结 果图；
图8是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时解有机磷卵磷脂能力和pH值的动态 变化结果图；
图9是JP-NJ2菌株在发酵罐中培养时对草甘膦降解率的动态变化结果图；
图10是JP-NJ2菌株对马尾松苗生长的影响结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以使本 领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应 当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实例中，PDA培养基的配方为：马铃薯20g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸 馏水1000mL。CYA培养基的配方为：K2HPO41.0g，查氏浓缩液10mL，酵母 膏5g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。磷酸盐生长培养基（NBRIP） 的配方为：葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，MgCl2.6H2O5g，KCl0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO40.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。解磷培养基A的配方为：用磷 酸铝（AlPO4）代替NBRIP中的Ca3(PO4)2，其他成分和含量相同。解磷培养基 B的配方为：用磷酸铁（FePO4·4H2O）代替NBRIP中的Ca3(PO4)2，其他成分和 含量相同。解磷培养基C的配方为：用磷酸氢钙（CaHPO4·2H2O）代替NBRIP 中的Ca3(PO4)2，其他成分和含量相同。蒙金娜培养基的配方为：蔗糖10g， (NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·7H2O 0.03g，卵磷脂0.6g，CaCO35g，蒸馏水1000mL，pH7.2。草甘膦培养基的配 方为：用草甘膦代替蒙金娜培养基中的卵磷脂，其他成分和含量相同。
实施例1JP-NJ2菌株解磷试验
将瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2菌株接种到PDA平板上，培养10d后，用灭菌的 打孔器在平板取菌块（直径6mm）分别接种到装有50mL NBRIP液体培养基及 解磷液体培养基A、B、C的100mL的三角瓶中，分别以相同体积未接菌的解磷 培养基为对照（CK），每瓶接种6个菌块，每个待测菌株设三个重复，25℃， 200r·min-1振荡培养，7d后，将发酵液离心10min(4℃，10000r·min-1)；采用 磷钼蓝分光光度法，即取上述离心得到的上清液100uL加入50mL的容量瓶中， 然后加入约25mL的去离子水后，再加1-2滴2,4-二硝基酚指示剂，再加5mL钼 锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，测定OD值。并计算 上清液中的有效磷含量和解磷率。结果如表1及图5、图6所示。其中，解磷率 （%）=（接菌可溶性磷含量－对照可溶性磷含量）/加入磷酸盐的量×100。
表1JP-NJ2菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝和磷酸氢钙的溶 解能力
注：P<0.01。
从表1可以得出，分别以难溶性磷酸盐磷酸三钙（Ca3(PO4)2）、磷酸铝 （AlPO4）、磷酸铁（FePO4·4H2O）、磷酸氢钙（CaHPO4·2H2O）为唯一磷源， 培养7d后，JP-NJ2发酵液中可溶磷含量均高于对照，但对各磷源的溶解效果明 显不同，其中对于磷酸铝（AlPO4）和磷酸三钙（Ca3(PO4)2）的溶解效果较好， 对磷酸铁（FePO4·4H2O）的溶解效果稍弱。
实施例2JP-NJ2菌株发酵罐中解无机磷试验
将瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2菌株接种到PDA平板上，培养10d后，制作液体 PD培养基150mL，从PDA平板上取12个直径6mm的供试菌块接入，25℃摇 瓶震荡4-5d制成种子液，配制1.5L NBRIP培养基放入发酵罐灭菌（121℃， 20min），将种子液接入发酵罐发酵（25℃，pH7.2），自发酵第二天起每隔12h 测一次发酵液中可溶磷的含量，对磷含量进行定量分析，直接用pH计（Basic pH Meter PB-10）测定发酵液的pH值，共测至120h。采用磷钼蓝分光光度法分别 测定发酵液中可溶性磷的含量，即取上述离心得到的上清液10mL加入50mL的 容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水后，再加1-2滴2,4-二硝基酚指示剂， 再加5mL钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，用分光光 度计测定钼蓝在720nm处的吸光度值。并计算上清液中的有效磷含量。
结果如图7所示，解磷真菌JP-NJ2菌株，经过120h的解无机磷能力的动态 测定，在0-60h时该菌株的解磷量逐渐升高，至72h时解磷量达最大，为 3.731mg/mL，此后出现下降趋势。同期测定发酵液pH值发现，pH值与解磷量 呈负相关的关系，随着解磷量的增大，pH值呈明显下降趋势，在72h时pH达 到最低为3.58，后期变化幅度不大，但仍保持在较低水平。
实施例3JP-NJ2菌株发酵罐中解有机磷试验
将瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2菌株接种到PDA平板上，培养10d后，制作液体 PD培养基150mL，从PDA平板上取12个直径6mm的供试菌块接入，25℃摇 瓶震荡4-5d制成种子液，配制1.5L蒙金娜培养基放入发酵罐灭菌（121℃， 20min），将种子液接入发酵罐发酵（25℃，pH7.2），自发酵第二天起每隔12h 测一次发酵液中可溶磷的含量，对磷含量进行定量分析，直接用pH计（Basic pH Meter PB-10）测定发酵液的pH值，共测至120h。采用磷钼蓝分光光度法分别 测定发酵液中可溶性磷的含量，即取上述离心得到的上清液10mL加入50mL的 容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水后，再加1-2滴2,4-二硝基酚指示剂， 再加5mL钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，用分光光 度计测定钼蓝在720nm处的吸光度值。并计算上清液中的有效磷含量。
结果如图8所示，对瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2在25℃下经连续5d发酵培养 及解卵磷脂能力进行动态测定，发现其在0-48h时的解磷量逐渐升高，至60h时 解磷量达最大，为0.153mg/mL。此后该菌株的解磷能力出现下降趋势。同期测 定发酵液pH值发现，pH值与解磷量呈负相关的关系，随着解磷量的增大，pH 值呈明显下降趋势，在60h时达到最低，pH为4.1，后期pH保持上升趋势。
实施例4JP-NJ2菌株降解草甘膦试验
将瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2接种到PDA平板上，培养10d后，从PDA平板 上取6个直径6mm的菌块接入50mL草甘膦液体培养基中，25℃摇瓶震荡5d。
（1）发酵液中总磷含量的测定：取5mL发酵液于凯氏瓶中，加入9mL浓硫 酸及1mL高氯酸消煮至溶液透明，冷却后调整pH至7.0并定容至50mL，采用 磷钼蓝分光光度法测定总磷含量。
（2）发酵液中无机磷含量的测定：取45mL发酵液于离心管中，加0.5g无 磷活性炭，细胞破碎20min后离心，取上清液采用磷钼蓝分光光度法测定无机磷 含量。
发酵液中总磷含量减去无机磷含量等于供试菌株降解出的有机磷含量。按下 式计算解磷率。
结果如图9所示，瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2接入含草甘膦的无机盐液体培养 基中25℃下震荡培养5d后，对培养基中草甘膦的降解率进行了测定，发现瓜纳 卡斯特青霉JP-NJ2在60h时降解率达到最大，为42.85%。
实施例5JP-NJ2菌株促进马尾松生长试验
将JP-NJ2菌株于PD培养基中25℃振荡培养7d。发酵液离心5min（4℃， 6000r·min-1），菌丝体用磁力搅拌器打碎后，用无菌生理盐水调节菌悬液 （7-8×108cfu·mL-1）制成菌剂。离心后的上清液收集到无菌三角瓶中待用。
接种马尾松苗木试验分为四种处理，每种处理均施入15mL对应物，A：菌 悬液，B：发酵液离心后得到的上清液，C：空白的培养基（PD），D：无菌生理 盐水（CK）。每个处理20个重复，接种后的苗木置于温室（20℃）统一管理， 适时浇水。
待接种处理的马尾松苗生长450d后，进行植株苗高、地径的测定。
结果如表2和图10所示，接种马尾松苗木450d后，供试菌株菌悬液及其代 谢物对马尾松苗苗高均具有明显的促生作用；但其对马尾松苗地径的增长无显著 促进效果（P<0.05）。供试菌株接种马尾松苗450d后，与CK和PD培养基相比， 其菌悬液和胞外代谢物对马尾松苗高的促生作用均表现出显著差异，其中菌悬液 使马尾松苗高增长率达97.71%；供试菌株菌悬液对马尾松苗地径的促生作用明 显，增长率为46.78%，其胞外代谢物与CK相比无显著差异。
表2解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2对马尾松生长的影响
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一种马尾松根际解磷真菌瓜纳卡斯特青霉JP-NJ2及其应用
<130> 100
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> Penicillium guanacastense
<400> 1
gactgcggaa ggatcattac tgagtgaggg ccctctgggt ccaacctccc acccgtgttt 60
attgtacctt gttgcttcgg caggcccgcc tcacggccgc cggggggctt tccgcccccg 120
ggcccgcgcc tgccggagac aatcttgaac gctgtctgaa gaatgcagtc tgagcgatta 180
agcaaaatta gttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tccggcatcg atgaagaacg 240
cagcgaaatg cgataattaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga gtctttgaac 300
gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat tgctgccctc 360
aagcccggct tgtgtgttgg gccctgttcc cccgggaaca ggcccgaaag gcagtggcgg 420
caccgcgtcc gatcctcgag cgtatggggc tttgtcaccc gctctgtagg cccggccggc 480
gcttgccccc atcaatcttt ttttcaggtt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 540
acttaagcat atcaataagc cggagga 567