一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103695552 A (43)申请公布日 2014.04.02 CN 103695552 A (21)申请号 201310725983.0 (22)申请日 2013.12.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) (71)申请人 广西科技大学 地址 545006 广西壮族自治区柳州市东环路 268 号 (72)发明人 黎娅 罗福广 黄杰 易弋 伍时华 (74)专利代理机构 柳州市荣久专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 45113 代理人 韦微 (54) 发明名称 一种罗非鱼无乳链球菌免培养半。

2、定量检测试 剂盒 (57) 摘要 本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半 定量检测试剂盒， 该试剂盒由试剂 A、 试剂 B、 试剂 C、 试剂 D、 试剂 E、 产品说明书和试验结果记录卡 组成 ； 使用本试剂盒， 按本发明所提供的方法， 可 不通过纯培养直接检测出罗非鱼血液中是否携带 无乳链球菌， 并能对血液中无乳链球菌的数量进 行半定量检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 103695552 A CN 103695552 A 1/1 页 2 1. 。

3、一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒， 其特征在于 ： 该试剂盒包括试剂 A、 试剂 B、 试剂 C、 试剂 D 和试剂 E ； 所述的试剂 A 的组成成分为 ： 引物 P1s 0.4 M ； 引物 P1a 0.4 M ； DNA 聚合酶 0.1U/ l ； dATP、 dCTP、 dTTP 和 dGTP 各 500M ； MgCl 3mM ； KCl 100mM， Tris-HCl(pH8.3) 20mM ； 吐温 20 0.005% ； 甘油 0.5% ； 所述的试剂 B 的组成成分为 ： 引物 P2s 0.4 M ； 引物 P2a 0.4 M ； DNA 聚合酶 0.1U/ l ；。

4、 dATP、 dCTP、 dTTP 和 dGTP 各 500M ； MgCl 3mM ； KCl 100mM， Tris-HCl(pH8.3) 20mM ； 吐温 20 0.005% ； 甘油 0.5% ； 所述的试剂 C 为溶质是柠檬酸钠、 枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶 液， 试剂 C 的浓度 0.1%-0.5% ； 所述的试剂 D 为去离子水 ； 所述的试剂 E 为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒， 该试剂 E 中cfb基因的拷 贝数为 1108拷贝 /ml ； 所述的试剂A中引物P1s的序列为 ： 5 - TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3 ，。

5、 引物P1a的 序列为 5 - CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3 ； 所述的试剂B中引物P2s的序列为 ： 5 - ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3 ， 引物P2a 的序列为 5 - CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3 。 权 利 要 求 书 CN 103695552 A 2 1/8 页 3 一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒。 背景技术 0002 罗非鱼是全球主要经济鱼类之一， 具有生长快、 抗病力与抗逆性强、 肉质好、 繁殖 力强、 适应性广以。

6、及群体产量高等一系列优点， 现已成为南方各省出口型养殖规模最大的 鱼类， 产量占全世界的 50， 罗非鱼产业对于增加就业机会、 提高农民收入都有十分重要 的意义。然而近年来， 由于高密度饲养， 种群退化， 加上养殖水质、 环境及气候恶化， 各类病 害时常大面积爆发， 严重影响到罗非鱼产业的健康发展。2009 2013 年， 国内主要的罗非 鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病， 患病罗非鱼在水面离群独游， 游姿失衡， 眼球突 出， 被养殖户形象的称为 “突眼病” 。该病发病率一般达 20 30， 死亡率在 95以上。 病原分析表明引起罗非鱼 “突眼病” 的病原为链球菌， 主要为海豚链球菌 (S。

7、treptococcus iniae) 和无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)。据统计， 近几年因链球菌病导致罗非 鱼产业的损失达 20 亿元， 如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注 的问题。 0003 无乳链球菌是罗非鱼链球菌病最主要的病原菌， 在养殖过程中定期检测罗非鱼是 否受到无乳链球菌的感染， 是预防链球菌病的一种有效措施。 目前已公开的专利和论文中， 有使用分子诊断方法检测无乳链球菌的报道， 这些方法虽然能够特异性的检测无乳链球 菌， 但有明显的缺点 ： (1) 检出灵敏度低， 多数情况只适用于纯培养后菌体的检测， 无法做 到免培养检测 。

8、； (2) 部分灵敏度高的检测方法， 如 LAMP 法， 只能定性判断出罗非鱼是否感 染无乳链球菌， 而对于感染程度， 即罗非鱼体内无乳链球菌的含量无法进行检测。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是 ： 提供一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂 盒， 该试剂盒检测灵敏度高， 解决了上述现有技术的不足之处。 0005 解决上述技术问题的技术方案是 ： 一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂 盒， 该试剂盒包括试剂 A、 试剂 B、 试剂 C、 试剂 D 和试剂 E ； 所述的试剂 A 的组成成分为 ： 引物 P1s 0.4 M ； 引物 P1a 0.4 M ； DNA 聚合酶 0。

9、.1U/ l ； dATP、 dCTP、 dTTP 和 dGTP 各 500M ； MgCl 3mM ； KCl 100mM， Tris-HCl(pH8.3) 20mM ； 吐温 20 0.005% ； 甘油 0.5% ； 所述的试剂 B 的组成成分为 ： 引物 P2s 0.4 M ； 引物 P2a 0.4 M ； DNA 聚合酶 0.1U/ l ； dATP、 dCTP、 dTTP 和 dGTP 各 500M ； MgCl 3mM ； KCl 100mM， Tris-HCl(pH8.3) 20mM ； 吐温 20 0.005% ； 甘油 0.5% ； 所述的试剂 C 为溶质是柠檬酸钠、 枸橼。

10、酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶 液， 试剂 C 的浓度 0.1%-0.5% ； 所述的试剂 D 为去离子水 ； 说 明 书 CN 103695552 A 3 2/8 页 4 所述的试剂 E 为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒， 该试剂 E 中cfb基因的拷 贝数为 1108拷贝 /ml ； 所述的试剂A中引物P1s的序列为 ： 5 - TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3 ， 引物P1a的 序列为 5 - CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3 ； 所述的试剂B中引物P2s的序列为 ： 5 - ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAG。

11、TG -3 ， 引物P2a 的序列为 5 - CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3 。 0006 由于采用上述技术方案， 本发明之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂 盒， 具有以下有益效果 ： 针对上述现有技术的情况， 本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量的检测 试剂盒。该试剂盒利用巢式 PCR 的方法对无乳链球菌特异基因cfb基因进行检测， 大大提 高了检测灵敏度。 配合试剂盒中的血液抗凝剂， 可不通过纯培养， 以罗非鱼的血液为模板直 接对无乳链球菌进行检测。 对照标准反应结果， 即可判断罗非鱼血液内无乳链球菌的含量。 该方法可不通过纯培养而特异、 快速检测罗非。

12、鱼血液是否携带无乳链球菌， 并且可实现半 定量检测， 从而判断罗非鱼感染无乳链球菌的程度， 为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技 术手段。 具体实施方式 0007 一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒， 该试剂盒包括试剂 A、 试剂 B、 试剂 C、 试剂 D、 试剂 E、 产品说明书和试验结果记录卡 ； 所述的试剂 A 含有 0.4 M 引物 P1s、 0.4 M 引物 P1a、 0.1U/l DNA 聚合酶、 500M dATP、 500M dCTP、 500M dTTP、 500M dGTP、 3mM MgCl、 100mM KCl、 20mM Tris-HCl(pH为 8.3)、 0。

13、.005% 吐温 20 和 0.5% 甘油 ； 所述的试剂 B 含有 0.4 M 引物 P2s、 0.4 M 引物 P2a、 0.1U/l DNA 聚合酶、 500M dATP、 500M dCTP、 500M dTTP、 500M dGTP、 3mM MgCl、 100mM KCl、 20mM Tris-HCl(pH为 8.3)、 0.005% 吐温 20 和 0.5% 甘油 ； 所述的试剂 C 为溶质是柠檬酸钠、 枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶 液， 试剂 C 的浓度 0.1%-0.5% ； 所述的试剂 D 为去离子水 ； 所述的试剂 E 为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因。

14、的质粒， 该试剂 E 中cfb基因的拷 贝数为 1108拷贝 /ml ； 所述的试剂A中引物P1s的序列为 ： 5 - TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3 ， 引物P1a的 序列为 5 - CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3 ； 所述的试剂B中引物P2s的序列为 ： 5 - ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3 ， 引物P2a 的序列为 5 - CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3 。 0008 一本发明之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒的使用方法 ： 1绘制标准反应对照表 ： 1.1第一轮 PCR 反应 。

15、： 取一定量的试剂D和试剂E混合， 配制成cfb基因拷贝数分别为2107拷贝/ml、 2106 拷贝 /ml、 2105拷贝 /ml、 2104拷贝 /ml、 2103拷贝 /ml、 2102拷贝 /ml、 0 拷贝 /ml 的 说 明 书 CN 103695552 A 4 3/8 页 5 cfb基因溶液。 0009 抽取健康罗非鱼新鲜血液， 立即与试剂C按1:1的比例混合均匀。 再与上述的cfb 基因溶液分别等体积混合得到混合溶液。 0010 分别吸取上述混合溶液 1l 作为模板， 分别与 12.5l 试剂 A 和 11.5l 的去离 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 。

16、进行第一轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0011 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25-35 次。 0012 将该 PCR 反应液共制备 3 份进行 PCR 反应， 除每份 PCR 反应液的循环次数分别为 25， 30， 35 外， 其他条件均相同。 0013 1.2第二轮 PCR 反应 ： 吸取第一轮 PCR 反应后的 PCR 反应液 1l， 分别与 12.5l 试剂 B 和 11.5l 的去离 子水混合， 制。

17、成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0014 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25 次。 0015 1.3电泳并绘制标准反应对照表 ： 第二轮 PCR 反应完成后， 取 5l 反应后的溶液进行电泳， 并观察结果。在 350 bp 处出 现 DNA 条带者为阳性结果。根据实验结果绘制标准反应对照表， 阳性结果标记 “+” ， 阴性结 果标记 “-” 。该反应对照表格式如下 ：。

18、 2进行样品反应 ： 2.1第一轮 PCR 反应 ： 抽取未死亡的健康或患病罗非鱼的新鲜血液， 立即与试剂 C 按体积比为 1:1 的比例混 合均匀得到混合液。吸取上述混合液 1l 作为模板， 分别与 12.5l 试剂 A 和 11.5l 的 去离子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行第一轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 说 明 书 CN 103695552 A 5 4/8 页 6 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0016 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 。

19、时进行 循环反应， 循环次数为 25-35 次。 0017 将该 PCR 反应液共制备 3 份进行 PCR 反应， 除每份 PCR 反应液的循环次数分别为 25， 30， 35外， 其他条件均相同。 此外， 另取1l去离子水3份作为模板， 同时进行上述反应 作为阴性对照。 0018 2.2第二轮 PCR 反应 ： 吸取第一轮 PCR 反应后的 PCR 反应液 1 l， 分别与 12.5l 试剂 B 和 11.5l 的去离 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行第二轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 7。

20、2延伸 30s。 0019 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25 次。 0020 2.3电泳并绘制标准反应对照表 ： 第二轮 PCR 反应完成后， 取 5l 反应后的溶液进行电泳， 在 350 bp 出现 DNA 条带者为 阳性结果， 观察并记录结果。对照标准反应结果即可判断所抽取罗非鱼血液中无乳链球菌 的浓度。 0021 二具体实施例 ： 实施例一 ： 1绘制标准反应对照表 ： 1.1第一轮 PCR 反应 ： 取一定量的试剂 D 和试剂 E 混合 （试剂 E 为含 cfb 基因的质粒， cfb 基因拷贝数。

21、为 1108 拷贝 /ml） ， 配制成cfb基因拷贝数分别为 2107拷贝 /ml、 2106拷贝 /ml、 2105 拷贝 /ml、 2104拷贝 /ml、 2103拷贝 /ml、 2102拷贝 /ml、 0 拷贝 /ml 的cfb基因溶液。 0022 抽取健康罗非鱼新鲜血液， 立刻与上述的cfb基因溶液分别等体积混合得到混合 溶液。 0023 分别吸取上述混合溶液 1l 作为模板， 分别与 12.5l 试剂 A 和 11.5l 的去离 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行第一轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50。

22、退火 30s ； 72延伸 30s。 0024 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25-35 次。 0025 将该 PCR 反应液共制备 3 份进行 PCR 反应， 除每份 PCR 反应液的循环次数分别为 说 明 书 CN 103695552 A 6 5/8 页 7 25， 30， 35 外， 其他条件均相同。 0026 1.2第二轮 PCR 反应 ： 吸取第一轮 PCR 反应后的 PCR 反应液 1l， 分别与 12.5l 试剂 B 和 11.5l 的去离 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应。

23、液， 进行 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0027 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25 次。 0028 1.3电泳并绘制标准反应对照表 ： 第二轮 PCR 反应完成后， 取 5l 反应后的溶液进行电泳， 并观察结果。在 350 bp 处出 现 DNA 条带者为阳性结果。根据实验结果绘制标准反应对照表 （参见表一） ， 阳性结果标记 “+” ， 阴性结果标记 “-” 。 0029 表一 ： 标准反应对照表 2进行样。

24、品反应 ： 2.1第一轮 PCR 反应 ： 抽取未死亡的健康或患病罗非鱼的新鲜血液， 立即与试剂C （试剂C为浓度0.2%的柠檬 酸钠溶液） 按体积比为 1:1 的比例混合均匀得到混合液。吸取上述混合液 1l 作为模板， 分别与 12.5l 试剂 A 和 11.5l 的去离子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进 行第一轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0030 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 2。

25、5-35 次。 0031 将该 PCR 反应液共制备 3 份进行 PCR 反应， 除每份 PCR 反应液的循环次数分别为 25， 30， 35外， 其他条件均相同。 此外， 另取1l去离子水3份作为模板， 同时进行上述反应 作为阴性对照。 0032 2.2第二轮 PCR 反应 ： 吸取第一轮 PCR 反应后的 PCR 反应液 1 l， 分别与 12.5l 试剂 B 和 11.5l 的去离 说 明 书 CN 103695552 A 7 6/8 页 8 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行第二轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s 。

26、； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0033 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25 次。 0034 2.3电泳并绘制标准反应对照表 ： 第二轮 PCR 反应完成后， 取 5l 反应后的溶液进行电泳， 在 350 bp 出现 DNA 条带者为 阳性结果， 观察并记录结果 （参见表二） 。 0035 表二 ： 实验结果 本次检测中所有反应结果均为阴性， 说明本次检测的罗非鱼未感染无乳链球菌。 0036 实施例二 ： 1绘制标准反应对照表 ： 1.1第一轮 PCR 反应 ： 取一定量的试剂 D 和试剂 。

27、E（试剂 E 为含 cfb 基因的质粒， cfb 基因拷贝数为 1108 拷贝 /ml） 混合， 配制成cfb基因拷贝数分别为 2107拷贝 /ml、 2106拷贝 /ml、 2105拷 贝 /ml、 2104拷贝 /ml、 2103拷贝 /ml、 2102拷贝 /ml、 0 拷贝 /ml 的cfb基因溶液。 0037 抽取健康罗非鱼新鲜血液， 立刻与上述的cfb基因溶液分别等体积混合得到混合 溶液。 0038 分别吸取上述混合溶液 1l 作为模板， 分别与 12.5l 试剂 A 和 11.5l 的去离 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行第一轮 PCR 反应， 反应条。

28、件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0039 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25-35 次。 0040 将该 PCR 反应液共制备 3 份进行 PCR 反应， 除每份 PCR 反应液的循环次数分别为 25， 30， 35 外， 其他条件均相同。 0041 1.2第二轮 PCR 反应 ： 吸取第一轮 PCR 反应后的 PCR 反应液 1l， 分别与 12.5l 试剂 B 和 11.5l 的去离 说 明 书 CN 103695552 A 8 7。

29、/8 页 9 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0042 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25 次。 0043 1.3电泳并绘制标准反应对照表 ： 第二轮 PCR 反应完成后， 取 5l 反应后的溶液进行电泳， 并观察结果。在 350 bp 处出 现 DNA 条带者为阳性结果。根据实验结果绘制标准反应对照表 （参见表三） ， 阳性结果标记 “+” ， 阴性结。

30、果标记 “-” 。 0044 表三 ： 标准反应对照表 2进行样品反应 ： 2.1第一轮 PCR 反应 ： 抽取未死亡的健康或患病罗非鱼的新鲜血液， 立即与试剂C （试剂C为浓度0.2%的柠檬 酸钠溶液） 按体积比为 1:1 的比例混合均匀得到混合液。吸取上述混合液 1l 作为模板， 分别与 12.5l 试剂 A 和 11.5l 的去离子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进 行第一轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s ； 50退火 30s ； 72延伸 30s。 0045 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 。

31、30s 和 72延伸 30s 时进行 循环反应， 循环次数为 25-35 次。 0046 将该 PCR 反应液共制备 3 份进行 PCR 反应， 除每份 PCR 反应液的循环次数分别为 25， 30， 35外， 其他条件均相同。 此外， 另取1l去离子水3份作为模板， 同时进行上述反应 作为阴性对照。 0047 2.2第二轮 PCR 反应 ： 吸取第一轮 PCR 反应后的 PCR 反应液 1l， 分别与 12.5l 试剂 B 和 11.5l 的去离 子水混合， 制成总体积为 25l 的 PCR 反应液， 进行第二轮 PCR 反应， 反应条件为 ： 94预变性 5 min ； 94变性 30s 。

32、； 说 明 书 CN 103695552 A 9 8/8 页 10 50退火 30s ； 72延伸 30s ； 反应过程中， 在反应条件为 94变性 30s、 50退火 30s 和 72延伸 30s 时进行循环 反应， 循环次数为 25 次。 0048 2.3电泳并绘制标准反应对照表 ： 第二轮 PCR 反应完成后， 取 5l 反应后的溶液进行电泳， 在 350 bp 出现 DNA 条带者为 阳性结果， 观察并记录结果 （参见表四） 。 0049 表四 ： 实验结果 本次检测中循环次数第一轮 25 次、 第二轮 25 次的反应结果为阴性， 其余反应结果为 阳性， 阴性对照均为阴性。 对照标准反应结果， 说明本次检测的罗非鱼血液已感染无乳链球 菌， 血液中无乳链球菌的数量约为 2104CFU/ml2106CFU/ml。 说 明 书 CN 103695552 A 10 。