发明背景
本申请涉及用于电化学测试条的试剂，例如在血糖检测中常用类型的试剂，并且 涉及利用此类试剂的组合物、测试条和有关方法。
从商业价值和学术兴趣两者考虑，大部分生物传感器涉及利用氧化还原酶对于特 异性目的分子(或“分析物”)的特异性。这些生物传感器中的氧化还原酶用于催化电子脱离 特异性目的分子且转移到更容易通过一些转导机制检测的化学品上，或反之亦然。转导机 制包括通过电化学、电或光学方式测量浓度。更容易通过这些转导机制检测的化学品被称 为“介体”，因为其在生物学酶和生物传感器中的传感机制之间的中介作用。
氧化还原酶的一个亚类是氧化酶，其使用样品中已经存在的氧作为介体，通常形 成过氧化氢作为已接受来自酶的电子的部分。基于对形成的过氧化氢的检测的生物传感器 构成了早一代的装置，但这些装置由于检测过氧化物的困难而在商业上受到障碍，所述过 氧化物仅在催化电极(例如铂)上可电化学检测。
开发了克服这种困难的几种方法。与本发明有一些关联的是Lau等人(US7,135, 100和US7,608,180)的公开内容，其中使用不同的铁氰化物盐以促进电子脱离过氧化氢 (当氧充当介体以再生酶时形成)并且转移到电极内。因此，这种系统中的铁氰化物不充当 就酶而言的介体，而是在远离酶的一个步骤起作用。Lau的盐就其在有机溶剂和聚合物中的 溶解度和在水中的低溶解度进行选择，这是旨在处理关于过氧化物介导的生物传感器的另 一个困难的标准。这就是，目的分析物通常在存在过氧化氢酶的生物样品中，所述过氧化氢 酶分解过氧化物而不释放电子。必须开发在生物传感器中的(例如使用膜的)方法，以保持 过氧化物酶远离生成的过氧化物，并且开发膜可溶性铁氰化物，从而使得信号可以到达电 极且被检测。
针对这些基于过氧化物的生物传感器的问题的另一个响应是开发用于基于氧化 酶的生物传感器的试剂系统，其可以无需氧介导而操作。此类系统通常使用铁氰化钾作为 直接介体以使酶恢复至活性状态。除钾盐外的铁氰化物盐已与之前的氧化还原酶组合提及 并且包括：‘铁氰化钠’(如US7,816,145、US7,749,766、US7,582,123、US7,169,273、US 6,258,254中)或‘碱金属铁氰化物(例如铁氰化钾或钠)’US6,187,751。在三个其他实例 中，铁氰化物盐无差别地列出：‘金属离子包括例如碱金属离子例如锂、钠和钾离子；碱土金 属离子例如镁和钙离子；以及铝和锌离子’(Kadota等人US5,858,695)或靶向有机溶剂中 的溶解度(上文提及的Lau等人US7,135,100和US7,608,180)。
铁氰化钾是用于多种氧化还原酶的良好介体。即使对于氧化酶例如葡萄糖氧化 酶，以高浓度(~100mM或更大)的铁氰化钾也是足够快速的介体，使得它通常可以超出样品 中浓度较少的氧，所述氧随后仅成为干扰物。铁氰化钾在水中的溶解度给予含有它的生物 传感器制剂另一个优点；当铁氰化物以大量存在时(例如Walling等人在US5,508,171中限 定了铁氰化钾在其传感器中的‘约0.15摩尔(M)到约0.7M’的有用范围)，它可以支持在对 电极处的足够逆反应以平衡在工作电极处的反应。逆反应提供足够的电流并且锚定化学电 位，从而使得不需要参考电极，对电极也不必大于工作电极。这意味着传感器可以简化为具 有相同大小和材料的电极的双电极传感器。使用这类试剂的其他工作见于WO97/00441、US 5,708,247和US6,258,229中。
然而，并且可能由于其广泛使用，关于铁氰化钾的问题已被广泛认识到。这些包括 对氧的敏感性，因为即使铁氰化物可以作为介体而超出氧，但产生的亚铁氰化物仍对通过 氧的氧化是敏感的。铁氰化物的另一个问题是如果铁氰化钾维持与酶密切接触，一些铁氰 化物即使在干燥试剂中经过延长时期也有转化成亚铁氰化物的趋势。已公开了多种制备制 剂的方法，以改善这个问题：Nankai等人(US5,120,420)将其酶和铁氰化钾存放在通过‘亲 水高分子物质层’而分开的层中，以使得它们分离且确保‘极佳的保存性质’，而Walling等 人(US5,508,171)使用微晶纤维素以分散铁氰化钾。
随着更快速的测试时间和改善准确度的重要性的增加，铁氰化钾(需要较高浓度) 的缓慢介导速率及其在干燥试剂中产生亚铁氰化物的趋势造成铁氰根离子作为生物传感 器试剂中的组分逐渐失宠。为此，已开发了不需要如此高的浓度以超出氧的介体，例如US 5,378,628、US5,393,903、US5,437,999、US5,410、059、US5,589,326、US5,846,702的 金属联吡啶(“bpy”)络合物，US6,605,201、US6,676,816、US7,074,308的金属吡啶基-咪 唑络合物，和US7,090,756的双配位的咪唑络合物。然而，这些类型的络合物不一定具有高 溶解度以支持必需的逆反应，并且因此测试条的结构必须更复杂，并引入参考电极或Ag/ AgCl对电极/参考电极。高溶解度Os络合物的类型已在US5,589,326中描述，但锇络合物的 成本使得对于一次性测试条，这种方法明显比铁氰化钾更昂贵。
可以通过添加第二种介体，包括上文描述的那些，补充铁氰化钾的活性；这一般导 致加重两种介体的最差特征的问题，特别是：(a)所需氧化电位必须适合最高介体氧化电 位，(b)由于氧的信号丧失将受两种介体在这方面最差的一种支配，和(c)信号大小将仅 是最佳表现介体的那种。此外，向含有铁氰化钾的制剂的添加第二种介体加重了干燥试剂 中亚铁氰化物的产生。必须开发关于这些问题的方法，并且这些包括Guo等人的，在夹心中 的两个电极上的试剂组分的物理分离方法(US6,033,866)。
关于该问题的部分解决方案由Harding等人，US2007/0295616-A1提出，所述专利 通过引用并入本文，其中精心选择的电极电位允许两个电子转移种类协同而不是平行作 用。在这个系统中，介体再生酶，并且穿梭化合物充当用于向电极转移及转出电子的主要或 甚至唯一的电活性种类。公开于该申请中的介体和穿梭化合物的具体组合包括作为介体的 [Os(MeBpy)2(Im)2]2+/3+或[Os(Mebpy)2Pic]+/2+和作为穿梭物的铁/亚铁氰化物。通过引用并 入本文的美国专利号5,508,171也公开了其中采用两种介体的一些系统。
发明概述
通过使用精心选择的铁氰化物盐，本申请提供了与铁氰化钾介体相关的许多问 题，特别包括含有该试剂的测试条的贮存稳定性的解决方案。因此，在第一个方面，本申请 涉及干燥试剂组合物，其包含：
(a)活性氧化还原酶，其氧化/还原作为特异性底物的分析物，以产生失活形式的 酶；和
(b)铁氰化物盐，其中所述铁氰化物盐由铁氰根和带正电的抗衡离子组成，所述 带正电的抗衡离子经过选择，从而使得铁氰化物盐在水中可溶至分析物在样品中的最大分 析浓度的至少两倍但小于铁氰化钾的溶解度，和/或从而使得铁氰化物盐在100mM的浓度 下具有小于100mM铁氰化钾的更低的E0eff。
E0eff可以就铁氰化物盐整体，或仅对于其晶相进行测量。示例性铁氰化物盐是铁 氰化铷和铁氰化四甲基铵。
‘最大分析浓度’是对于给定传感器设计的动态范围的上端。在血糖的情况下，这 个值通常为600mg/dL。
干燥试剂也可以含有另外的一种或多种电子转移介体、缓冲剂和湿润剂。在优选 实施方案中，与此类另外试剂相关的阳离子至少大部分与铁氰化物盐的带正电的抗衡离子 相同，且优选全部相同。
本发明还涉及包含金属电极和本发明的干燥试剂组合物的电化学测试条。本发明 的这种干燥试剂实质上且令人惊讶地增加电化学测试条在样品应用前的贮存期限，而不损 害获得的测试结果的质量。依照本发明的这个方面，用于检测样品中的可氧化分析物(例如 葡萄糖)的电化学测试条包含：
(a)第一和第二非反应电极；
(b)用于接受液体样品的样品池，其中放置在所述样品池内的液体样品与第一和 第二电极接触；和
(c)依照本发明的干燥试剂。
干燥试剂的放置使得在液体样品应用于测试条后，干燥试剂溶解于样品池内的样 品中。
本发明还提供了包含在水性液体载体中的本发明试剂的液体组合物。当液体样品 例如血液引入测试条的样品室内时，或当液体载体在应用于测试条前与试剂混合时，获得 此类液体组合物。在制造过程中，此类组合物还可以用于在用于贮存和分配的后续干燥前， 将试剂组合物递送至测试装置。
本发明还提供了通过将样品应用于本发明的测试条而检测液体样品中的分析物 的方法，其中干燥试剂中的酶选择为对于分析物是特异性的；并且随后将外部信号应用于 测试条以生成指示样品中的分析物的量的信号。在具体实施方案中，外部信号是在第一和 第二电极之间施加的电位，并且指示分析物的量的信号是电流。
本发明还提供了配制用于在分析物的电化学检测中使用的贮存稳定试剂的方法。 该方法包括步骤：
(a)选择氧化还原酶，其氧化/还原作为特异性底物的分析物；
(b)选择铁氰化物盐，其中所述铁氰化物盐由铁氰根和所选带正电的抗衡离子组 成，所述带正电的抗衡离子经选择，从而使得铁氰化物盐在水中可溶，并且铁氰化物盐或铁 氰化物盐的晶相所具有的在水中的溶解度是分析物在样品中的最大分析浓度至少两倍，但 小于铁氰化钾的溶解度，和/或从而使得铁氰化物盐在100mM的浓度下具有小于100mM铁 氰化钾的更低的E0eff；和
(c)组合所选酶和所选铁氰化物盐，以形成用于在分析物的检测中使用的贮存稳 定的电化学测试试剂。
附图简述
图1显示当将足够的电位施加于电极时，依照本发明的第一个实施方案在含有干 燥试剂的测试条中发生的一组反应。
图2A、2B和2C显示当将足够的电位施加于电极时，依照本发明的第二个实施方案 在含有干燥试剂的测试条中时可发生的可选反应组。
图3显示依照本发明的测试条。
图4显示对于使用含有葡萄糖氧化酶、铁氰化钾和Os(dmbpy)2PicCl的干燥试剂制 备的测试条，作为葡萄糖浓度的函数的电流。老化条件是将测试条保持在50℃下的干燥器 小瓶中；老化时间如图中所示。
图5显示对于使用含有葡萄糖氧化酶、TMA铁和Os(dmbpy)2PicCl的干燥试剂制备 的测试条，作为葡萄糖浓度的函数的测量电流。老化如图4所述。
图6显示对于不同铁氰化物盐，作为老化时间的函数的基线电流(在测试液体中无 葡萄糖)的变化。老化如图4所述。
图7显示来自在干燥器小瓶中在50℃下保持的测试条的基线电流与在那些测试条 的试剂中的铁氰化物盐的饱和溶解度之间的关联。
图8显示对于在干燥器小瓶中在50℃下保持的测试条，基线电流随着老化时间的 发展。试剂如实施例15中所述。
图9显示通过ORP电极测量的化学电位与铁相对于亚铁的浓度比的对数的曲线。
图10显示作为铁氰化物浓度的函数的铁氰化钾在420nm的吸光度强度。
图11显示均以800:1稀释的多种饱和铁氰化物溶液的UV/Vis光谱的实例。
图12显示多个缓冲液类型对含TMA铁的干燥试剂中的酶稳定性的作用。
图13显示多个缓冲液类型对基线电流的作用。
图14证实稳定测定所需的活性酶的最小量。
图15证实在加速老化过程中在含有本发明试剂的测试条中的酶活性的稳定性。
图16和17显示在用超过优选阈值的酶量制备的测试条中的斜率和基线的稳定性 和一致性。
发明详述
本申请涉及用于在分析物检测中使用的试剂组合物和包括该组合物的电化学测 试条。
定义
如本申请的说明书和权利要求中使用的，可应用下述术语定义：
一般而言，术语“分析物”指样品中待测定其存在或其量的目的物质。在本申请的 情况下，术语分析物具体指这样的化合物：其(a)在小于1V的电位差下，在水溶液中的金 属电极或其他非反应电极处不可直接氧化或还原；和(b)在水溶液中通过氧化还原酶可直 接氧化或还原。已公开了用于通过“生物传感器”检测的符合这些特征的多种分析物，包括 但不限于葡萄糖、胆固醇和表1中列出的那些其他分析物。虽然本申请中的实例是指其为优 选分析物的葡萄糖，但可以替换成其他分析物和相应酶，而不脱离本发明的范围，并且其中 采用葡萄糖的任何实例或结构完全可应用于其他分析物，伴随酶和电活性种类中的合适变 化。
术语“活性氧化还原酶”指处于氧化还原态的酶，所述氧化还原态允许它氧化或还 原作为特异性底物的所选分析物。这种氧化或还原产生失活形式的酶，所述酶不再能够执 行这种功能。在依照本发明的任何给定试剂中，酶都经过选择而将所需分析物作为特异性 底物。分析物/酶对的实例在表1中列出，所述表1部分基于美国专利号4,225,410的表I，所 述专利通过引用并入本文。
术语“电子转移介体”指具有从通过与分析物反应形成的失活酶再生活性氧化还 原酶的能力的化学化合物。电子转移介体必须在应用于测试条的样品(通常为水介质例如 血液、尿或唾液)中具有足够的电化学电位，从而氧化或还原失活形式的酶以再生活性形 式。因此，目标分析物控制酶的选择，并且酶控制试剂中电子转移介体的选择。
术语“测试条”指包括电极和适合于电化学检测至少一种分析物的试剂，和用于将 测试条连接至测量计的连接器的部件集合。测试条可以具有用于多重分析物或用于相同分 析物的多重测定的多个电极组和试剂。在具体实施方案中，测试条是单次使用的一次性元 件。
术语“测量计”指与测试条结合的电子装置，以在样品应用于与测量计结合的测试 条时，提供用于测定样品中的一种或多种分析物的整合测试单元。一般而言，测量计将电位 施加于测试条以刺激电化学反应，并且检测且分析所得到的信号。然而，测量计可以仅执行 这些功能的部分，例如电位施加和信号检测，其中分析在分开部件中执行。
术语“TMA铁”、“TMA亚铁”和“TMA耦”分别指铁氰化四甲基铵、亚铁氰化四甲基铵、 以及在共同溶液中作为氧化还原耦的TMA铁和TMA亚铁的组合。
术语“足够电位”指足够大以导致在电极处的铁氰化物耦(例如TMA耦)的氧化和还 原的电极间电位差。电压可以施加于一个或两个电极，以产生在电极之间的电位差。
术语“溶解度”指可以溶解于水中的化合物量。它可以以多种方式表达(例如以实 际单位定义或表示为%值的化合物质量/水质量、化合物质量/水体积)，但用于本公开内容 中的比较，至少对于铁氰化物盐的比较，最有价值的单位是化合物摩尔数/升(摩尔，M)，因 为这允许直接比较铁氰化物含量。适当地，比较铁氰化物盐在常规温度的溶解度，所述常规 温度，例如25℃，与测试条的贮存和使用相关。
当应用于在本发明中使用的铁氰化物盐时，术语“在水中可溶”指示足以在水性样 品(例如血液中)达到适合于执行电化学测定的浓度的溶解程度。对于大多数目的，这意指 足以达到至少80mM的浓度的溶解度，尽管操作测试条装置中的实际浓度无需这么高。溶解 度的下限由氧化介体浓度设定，所述氧化介体浓度是在负极处确保电流受限于正极处的还 原种类浓度所必须的；这种限制取决于通过最大浓度的分析物生成的还原种类量。对于葡 萄糖，葡萄糖氧化还原酶一般仅催化β-D-葡萄糖的氧化，所述β-D-葡萄糖占总葡萄糖的 64%，并且生成2摩尔亚铁氰化物/摩尔葡萄糖，因此对于600mg/dL(即33.3毫摩尔(mM))的 最大分析血糖浓度，将生成42.7mM亚铁氰化物。在试剂中希望至少两倍这个浓度的铁氰化 物(即85.4mM)，以在形成亚铁氰化物后具有剩下的过量，从而使得在正极处的亚铁氰化物 的氧化保持电流限制。对于铁氰化钾，这将对应于至少28.1g/L的溶解度，并且对于具有比 钾更高的重量的阳离子，该溶解度甚至更大。相比之下，US7,135,100指示具有低水溶性的 化合物具有20g/L的最大溶解度。
术语“E0eff”指在目的浓度和在目的离子的存在下，对于给定电活性种类的电极电 位。铁氰化物的电极电位是由下述化学半反应代表的平衡状态的表示：
(Fe(CN)6)3-+e-→(Fe(CN)6)4-
铁氰化物+电子→亚铁氰化物
电化学家认识到标准电极电位E0可以用于方程如能斯特方程中，以测定在任何特 定化学电位E时两个化学种类的比例：
E=E0+(RT/nF)ln{[铁]/[亚铁]}
其中R为气体常数，T为绝对温度(以开尔文绝对温度表示)，n为在半反应中转移的 电子数目(其对于铁氰化物为1)，F为法拉第常数，[铁]为铁氰根离子(Fe(CN)6)3-的浓度，并 且[亚铁]为亚铁氰根离子(Fe(CN)6)4-的浓度。这个方程设定下述预期：化学电位E不依赖于 系统中的阳离子性质，并且标准电极电位E0可以由其中[铁]=[亚铁]的溶液的化学电位 测定。还预期相反情况：E0可以用于由电极电位测量预测其他浓度比例，或相反地由[铁]/ [亚铁]的比例预测电极电位。然而，电化学家还认识到随着浓度的增加，浓度值的直接使用 导致误差，并且这些应由热力活性取代。
除了理想的能斯特方程外，通过Hanania等人(J.PhysChem1967，71，第2022- 2030页)的研究已探究了铁氰根和亚铁氰根离子与溶液中的阳离子形成络合物或离子对的 想法。这个工作已设定相对于标准氢电极E0=356mV的常用数据手册值，这是在无限稀释 时的极限，并且还已详细探究了在更高浓度的钾离子、铁氰化物和亚铁氰化物之间存在的 平衡。此外，还简要探究了其他盐(碱金属和四烷基铵盐)对电极电位的影响。Hanania等人 报告尽管四烷基铁氰化铵盐得到更低的电极电位，但添加“天然盐如KBr和NaCl……得到还 原电位中的立即显著上升”。因此，E0的任何测定将不仅取决于浓度还取决于可能存在的具 体络合物。术语E0eff是可应用于在还原和氧化种类的特定总浓度时的特定盐的E0形式。
在本发明的干燥试剂中，当试剂中存在包括阳离子抗衡离子的另外的盐时，优选 这种阳离子抗衡离子至少大部分与采用的铁氰化物盐中的带正电的抗衡离子相同。术语 “大部分相同”意指在作为整体的干燥试剂中，小于25%的带正电的抗衡离子不同于铁氰化 物的抗衡离子。应当理解如果采用的另外材料的量在摩尔基础上相对于的铁氰化物盐量很 小，则另外的材料的基本上所有的抗衡离子不同于铁氰化物盐的抗衡离子，并且应当理解 保持抗衡离子的增加与另外材料的相对量增加相同的重要性。在具体实施方案中，小于10% 且更优选小于5%的带正电的抗衡离子不同于铁氰化物的抗衡离子。
在一些实施方案中，与另外材料相关的“基本上所有”的阳离子抗衡离子与采用的 铁氰化物盐中的带正电的抗衡离子相同。如这个背景下使用的，术语“基本上所有”不要求 不存在其他可检测的抗衡离子，而是将任何此类抗衡离子视为加入的另外材料中的杂质。 在具体实施方案中，另外材料的纯度是对于包括与铁氰化物盐中的带正电的抗衡离子相同 的抗衡离子的化合物，具有至少98%纯度的盐。
术语“贮存稳定的试剂”指干燥试剂，其在与金电极接触时，具有的贮存期限大于 在相同条件下其中铁氰化钾用作铁氰化物组分的在其他方面相同的组合物的贮存期限。贮 存期限可以使用加速老化技术进行评估，且基于与在任何测量系统中用含葡萄糖液体(例 如参考标准)实现的结果比较而进行测量，或基于在氧化和还原介体在电极间穿梭的系统 中的本底电流(在样品室内没有葡萄糖输入测量的)的变化而进行测量。
术语“抗衡离子”指离子化合物中平衡用于实施。因此，在TMA铁中，铁氰根离子提 供电子转移功能，并且TMA是阳离子抗衡离子。
术语“基线信号”指在使用所述试剂测试不含分析物的样品时发生的信号。在用含 有铁氰化钠或钾的试剂制备的生物传感器中，当基线信号对于贮存的干燥试剂增加时，这 显示已生成或正在生成亚铁氰化物(因为所检测的正是该分子)。导致基线增加的最终电子 来源无需是确定的，但它通常与试剂中氧化还原酶的存在相关。
术语“非反应电极”指不有意参与用于在分析条件下检测分析物的电化学反应的 电极。非反应电极的实例包括金属电极(金、铂、钯等)和碳电极，其接受或释放电子，而不改 变电极的化学性质。这与反应电极例如Ag/AgCl形成对比，在所述反应电极中发生银/银离 子的反应，以支持可测量信号的生成。
干燥试剂组合物
依照第一个方面，本发明提供了包含下述的干燥试剂组合物：
(a)活性氧化还原酶，其氧化/还原作为特异性底物的反应物，以产生失活形式的 酶；和
(b)铁氰化物盐，其中所述铁氰化物盐由铁氰根和带正电的抗衡离子组成，所述 带正电的抗衡离子经过选择，从而使得铁氰化物盐在水中可溶，具有的在水中的溶解度是 分析物在样品中的最大分析浓度至少两倍，但小于铁氰化钾的溶解度，和/或从而使得铁氰 化物盐在100mM的浓度下具有小于100mM铁氰化钾的更低的E0eff。
如下文进一步讨论的，通过由钾变为其他抗衡离子可以增强试剂稳定性和贮存期 限的机制并不显而易见。最初由本发明人考虑的一种可能性是具有更低E0eff导致铁氰化物 至亚铁氰化物的转换更少，并且因此减少基线随贮存时间的增加。然而，当考虑到铷盐的 E0eff时，变得显而易见的是这种解释与实验结果不一致。最终，本发明人发现盐在水中的溶 解度和观察到的效应之间存在关联。事后看来，这可以基于如下所述的结晶热力学加以解 释。然而，不能排除单独或与溶解度因素组合的足够低的E0eff未实现相同效应，并且本发明 因此无需限制于仅一种机制理解。
图1显示在含有此类试剂组合物的测试条中发生的一组反应，其中葡萄糖作为示 例性分析物，葡萄糖氧化酶作为示例性酶并且TMA铁作为示例性铁氰化物盐。葡萄糖与氧化 的酶葡萄糖氧化酶(GOX(氧化型))反应，以产生葡萄糖酸和还原型酶(GOX(还原型))。GOX(还原型)与TMA 铁反应，以再生GOX(氧化型)和TMA亚铁。这些反应可以在没有在电极10，11施加的电位时发生。 当足够电位V施加于电极10，11时，电子可以从电极11转移12到邻近电极11的TMA铁，以形成 TMA亚铁，而电子由邻近电极10的TMA亚铁分子转移13，以产生TMA铁。这种电子转移反应产 生可测量的电流。电流也通过在TMA亚铁从电极11扩散14到电极12后的相同转移13生成，其 中任一可以用于提供葡萄糖浓度的指示。用于分析这些电流的众多方法是本领域已知的 (例如来自美国专利号7,501,052，6,284,125；5,942,102；5,352,351；和5,243,516，以及美 国公开号US-2005-0265094-A1，其通过引用并入本文)，并且可以使用任何类型的分析来分 析由使用这种干燥试剂组合物而产生的电流。
待采用的铁氰化物盐可以基于溶解度进行选择；盐必须在水中可溶，并且具有低 于铁氰化钾的溶解度，或基于相对于在100mM溶液中的铁氰化钾E0eff的E0eff值。表2列出了 关于多种铁氰化物盐的E0eff和溶解度的实验值。可见，铁氰化钠和铁氰化铯的E0eff值和溶解 度都大于铁氰化钾，并且它们因此在本发明的范围之内。另一方面，铁氰化铷和铁氰化四甲 基铵具有更低的溶解度，并且在本发明的范围内。此外，四甲基铵盐具有基本上更低的E0eff值。
其他合适的铁氰化物盐是铁氰化三铵及其他铵或烷基铵盐。烷基在大小和数目方 面经过选择，从而使得盐是水溶性的。一般而言，烷基铵离子的烷基含有1-3个碳原子。烷基 铵离子中的烷基可以全部相同或可以是不同的。因此，烷基铵离子的具体另外实例包括四 乙基铵、三甲基铵、三乙基胺、二甲基乙基铵、正丙基铵。铁氰化物盐中的离子可以全部相 同。如本申请中使用的，术语“全部相同”指实际而不是绝对限制，并且不排除杂质量的其他 抗衡离子，将其通过成本可接受的纯化技术去除是不实际的。其中铁氰化物的离子并非全 部相同的混合离子种类也在本发明的范围内。
溶解度测定用于指导实验设计，以改变铁氰化物盐中的阳离子，从而使得与通常 的铁氰化钾相比较，热力学有利于在试剂干燥过程中铁氰化物的较早结晶。与其进行广泛 配制实验，此类盐可以通过下述容易地鉴定：测量任何铁氰化物盐在水中的溶解度且将其 与铁氰化钾的溶解度比较，或使用手册值例如可得自Messinger等人ADictionaryof ChemicalSolubilities，Bound1941，可从GoogleBooks在线获得的那些。虽然这可以通过 多种方法实现，但有效方法是比较两种饱和溶液的吸光度谱：具有铁氰化钾的一种溶液和 区别仅在于由目的离子取代钾离子的另一种相似的溶液。在420nm处的吸光度峰是铁氰根 离子的特征，并且基本上没有来自亚铁氰化物的干扰，尽管可以应用使用在320nm处的吸 光度强度的对于亚铁氰化物的校准。或者，如果Eoeff是已知的并且测量了溶液的电极电位， 则可以由能斯特方程确定在起始样品中铁氰化物与亚铁氰化物的比例。测定电极电位的方 法呈现于实施例4和5中，其去除原材料中的许多不确定性，并且产生Eoeff(100mM)的估计 值，即根据能斯特方程从试验数据(其中[铁]+[亚铁]=100mM，即在浓缩溶液中)确定 的有效电极电位。
在试剂中，使用具有比铁氰化钾更低的溶解度和/或更低Eoeff(100mM)的铁氰化 物盐是实现基线中的改善稳定性的一种方法。然而，这仍可以进一步改善。技术的关键是确 保铁氰化物在试剂干燥时结晶并且不留下具有更高溶解度的其他一些铁氰化物盐残余物。 不需要的盐可以通过两种方法中的任一种排除。
首先，如果试剂的其他组分含有可以形成不需要的盐的阳离子，则应寻求仅含有 在所需铁氰化物盐中选择的阳离子的替代方案。其他离子通常见于在例如所包含的用于给 予试剂pH控制的缓冲剂盐。在铁氰化铷制剂中的乙酸盐缓冲液的情况下，例如缓冲原液应 仅使用乙酸配制且不使用具有乙酸钠或乙酸钾的乙酸。随后，通过用氢氧化铷滴定乙酸达 到所需的pH水平，由此形成可以用于制剂中的不含钠或钾离子的乙酸盐缓冲液的原液。排 除不希望的阳离子的其他制备方法将是本领域技术人员熟悉的，并且在本发明的范围内。 通过排除不希望的阳离子，可以结晶的唯一铁氰化物盐将是需要的盐，并且由此实现期望 的稳定相。
其次，在特定情况下，可以使不希望的阳离子存在，只要它们不形成显著量的不希 望的铁氰化物盐晶体。这可以由于不同相的溶解度而实现，并且一些阳离子的选择可以有 助于此。例如，铁氰化四甲基铵在室温下仅可溶至约0.158M的浓度，而铁氰化钾在室温可 溶至1.11M。因此，种植铁氰化物晶核的第一个相是铁氰化四甲基铵，并且这随后将是在快 速蒸发的条件下的优选晶相。然而，应当理解与不希望离子的排除相比，这是有效性较低的 方法，并且只有在不希望离子以小浓度存在时，通常可以是可靠的。
本发明的干燥试剂可以任选进一步包含不是铁氰化物盐的电子转移介体。这种电 子转移介体在水介质中具有足以氧化的失活还原形式的酶以再生活性氧化还原酶的电化 学电位。适合于此目的的众多化合物是本领域已知的，包括US5,378,628、US5,393,903、 US5,437,999、US5,410、059、US5,589,326、US5,846,702、US6,605,201、US6,676, 816、US7,074,308和US7,090,756中所述的那些，以上文献都通过引用并入本文。在具体 实施方案中，电子转移介体是锇配位络合物例如Os(dmbpy)2PicCl或Os(dmbpy)2Im2Cl。这 些介体不具有阳离子抗衡离子。然而，如果介体具有阳离子抗衡离子，则希望这种抗衡离子 至少大部分与铁氰化物盐的带正电的抗衡离子相同。
图2A-2C显示当含有TMA铁和电子转移介体的干燥试剂用于测量葡萄糖时可发生 的反应组。在图2A中，介体耦和铁氰化物盐(例示为TMA铁)能够在施加于电极10和11之间的 电位下被氧化且还原。因此，通过扩散过程14和23，两种组分都充当主要电流来源。在图2B 中，介体的还原反应21在电极10处发生，但介体的反氧化不在电极11处发生。因此，由于电 极间扩散的大多数电流14通过铁氰化物盐的氧化和还原而生成。在图2C中，介体通过使用 铁氰化物盐的氧化还原反应24再生。电流完全是在电极处铁氰化物盐的氧化和还原的结 果。
其他电子转移反应物例如充当介体和TMA铁之间的电子转移中间物的催化剂也可 以包括在本发明的试剂中。(参见美国专利公开号20070295616的图8)。然而，一般而言，本 发明人已观察到增加干燥试剂中此类材料的数目对干燥试剂的稳定性具有负面影响。
本发明的干燥试剂(含或不含电子转移介体)也可以包括任选的缓冲剂，以使酶促 反应的活性最佳化。在具体实施方案中，这种缓冲剂是包含带正电的缓冲抗衡离子和缓冲 共轭碱的两性离子缓冲剂。合适的共轭碱的具体实例是3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基 丙磺酸(TAPSO)的共轭碱、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)的共轭碱、4-(2-羟基乙 基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)的共轭碱和N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)的共轭碱。 在具体实施方案中，带正电的缓冲抗衡离子包含与铁氰化物盐相同的抗衡离子，大部分与 铁氰化物盐的抗衡离子相同，或使基本上所有的带正电的缓冲抗衡离子与铁氰化物盐的抗 衡离子相同。
在本发明的具体实施方案中，所述干燥试剂组合物包含：
(DR1)(a)活性氧化还原酶，其氧化作为特异性底物的分析物，以产生失活还原 形式的酶；和
(b)铁氰化物盐，其中所述铁氰化物盐由铁氰根和带正电的抗衡离子组成，所述 带正电的抗衡离子经过选择，从而使得铁氰化物盐在水中可溶，并且从而使得铁氰化物盐 或铁氰化物盐的晶相具有在水中的溶解度和/或在100mM的浓度下具有低于铁氰化钾的 E0eff。
(DR2)段落(DR1)的干燥试剂，其中所述铁氰化物盐包括作为带正电的抗衡离子 的烷基铵离子。
(DR3)段落(DR2)的干燥试剂，其中所述烷基铵离子的烷基含有1-3个碳原子。
(DR4)段落(DR3)的干燥试剂，其中所述铁氰化物盐包括作为带正电的抗衡离子 的四甲基铵离子。在一些优选实施方案中，由铁氰化物盐引入的所有带正电的抗衡离子都 是四甲基铵离子。
(DR5)段落(DR1)的干燥试剂，其中所述铁氰化物盐包括作为带正电的抗衡离子 的铷离子。
(DR6)段落(DR1)到(DR5)中任一项的干燥试剂，其中所述铁氰化物盐中的带正电 的抗衡离子都是相同的。
(DR7)段落(DR1)到(DR6)中任一项的干燥试剂，其中所述试剂还包含不是铁氰化 物盐的电子转移介体，所述电子转移介体在水介质中具有足以氧化失活还原形式的酶以再 生活性的氧化还原酶的电化学电位。
(DR8)段落(DR7)的干燥试剂，其中所述电子转移介体是锇配位络合物。
(DR9)段落(DR8)的干燥试剂，其中所述锇配位络合物是Os(dmbpy)2PicCl。
(DR10)段落(DR8)的干燥试剂，其中所述锇配位络合物是Os(dmbpy)2Im2Cl。
(DR11)段落(DR7)到(DR10)中任一项的干燥试剂，其还包含还原形式的电子转移 介体，其中相对于氧化形式的电子转移介体，所述还原形式的电子转移介体的量使得试剂 的溶液具有与稳态基线信号可比的基线，所述稳态基线信号在不存在还原形式的电子转移 介体的情况下通过老化干燥试剂的溶液产生。
(DR12)段落(DR1)到(DR11)中任一项的干燥试剂，其还包含亚铁氰化物盐，所述 亚铁氰化物盐由亚铁氰根和与铁氰化物盐相同的带正电的抗衡离子组成，其中相对于铁氰 化物，亚铁氰化物量使得干燥试剂的溶液具有与稳态基线信号可比的基线，所述稳态基线 信号通过仅含有干燥试剂的铁氰化物和酶组分的老化干燥试剂的溶液产生。
(DR13)段落(DR1)到(DR12)中任一项的干燥试剂，其还包含盐形式的一种或多种 另外化合物，其中存在于所述另外化合物中的阳离子基本上与铁氰化物盐中的阳离子相 同。
(DR14)段落(DR1)到(DR13)中任一项的干燥试剂，其还包括两性离子缓冲剂，所 述两性离子缓冲剂包含带正电的缓冲抗衡离子和缓冲共轭碱。
(DR15)段落(DR14)的干燥试剂，其中所述缓冲共轭碱是3-[N-三(羟甲基)甲氨 基]-2-羟基丙磺酸的共轭碱。
(DR16)段落(DR14)的干燥试剂，其中所述缓冲共轭碱是N-三(羟甲基)甲基-2-氨 基乙磺酸的共轭碱。
(DR17)段落(DR14)到(DR16)中任一项的干燥试剂，其中所述带正电的缓冲抗衡 离子包含与铁氰化物盐相同的抗衡离子。
(DR18)段落(DR14)到(DR16)中任一项的干燥试剂，其中基本上所有的所述带正 电的缓冲抗衡离子与铁氰化物盐中的抗衡离子相同。
(DR19)段落(DR1)到(DR18)中任一项的干燥试剂，其还包含两性离子湿润剂，所 述两性离子湿润剂包含包括胺和磺酸盐的亲水头部基团，和10-16个碳原子的疏水脂肪族 尾部。
(DR20)段落(DR19)的干燥试剂，其中所述两性离子湿润剂的疏水尾部是12个碳 原子的尾部。
(DR21)段落(DR1)到(DR20)中任一项的干燥试剂，其中所述酶是葡萄糖氧化酶。
液体组合物
如上所述的干燥试剂可以与水性液体组合，以形成依照本发明的液体组合物。
在一些实施方案中，所述水性液体是待测试分析物的样品，例如体液例如血液、间 隙液、尿或唾液。干燥试剂在水性液体中是基本上溶剂化且分散的，从而使得如图1和2A-2c 中所述的电子转移反应可以发生。
当液体组合物形成或引入用于测量分析物的测试条的样品池内时，水性液体中的 酶浓度优选为18mg/ml或更大，并且更优选27mg/ml或更大。
当试剂含有Os(dmbpy)2PicCl，并且液体组合物形成或引入用于测量分析物的测 试条的样品池内时，Os(dmbpy)2PicCl适当地以0.5-2.0mg/ml且更优选0.8-1.0mg/ml的 浓度存在。
当缓冲剂存在于试剂中时，缓冲剂适当地在液体组合物中具有足以提供至pH6.8 的缓冲能力的超过22mM的浓度。当缓冲剂包含3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸 (TAPSO)的共轭碱时，缓冲剂的浓度适当地是50-200mM。适当地，缓冲剂维持液体组合物的 pH在与大多数酶相容的pH7-8的范围中。
依照本发明的液体组合物也可以用于测试条的制造过程中。将含有试剂的液体组 合物置于电极上或样品室内且允许其干燥。当样品体积加入测试条时，液体组合物中的试 剂浓度足以递送实现操作水平的酶、铁氰化物盐和电子转移介体(如果存在的话)的试剂 量。
因此，在一些实施方案中，本发明的液体组合物包含：
(LC1)段落(DR1)到(DR21)中任一项的试剂和水性液体载体，例如血液、间隙液、 尿或唾液。
(LC2)段落(LC1)的液体组合物，其中所述水性液体载体中的酶浓度为27mg/ml 或更大。
(LC3)段落(LC1)或(LC2)的液体组合物，其中所述试剂含有浓度在0.8-1.0 mg/ml的Os(dmbpy)2PicCl。
(LC4)段落(LC1)到(LC3)中任一项的液体组合物，其中在试剂中存在缓冲剂，并 且所述缓冲剂在液体组合物中具有足以提供在pH6.8的缓冲能力的超过22mM的浓度。
(LC5)段落(LC4)的液体组合物，其中所述缓冲剂包含3-[N-三(羟甲基)甲氨基]- 2-羟基丙磺酸的共轭碱，并且所述缓冲剂的浓度为50-200mM。
(LC6)段落(LC1)到(LC5)中任一项的液体组合物，其中所述缓冲剂维持组合物的 pH在pH7-8、优选7.6-7.8的范围中。
测试条
本发明还提供了掺入如上所述的干燥试剂的测试条。如图3中所述，所述测试条包 含：
(a)在测试条结构32的一个部分中的第一电极31和在测试条结构的第二部分中 的第二电极33；
(b)通过装配条38形成的用于接受液体样品的样品池35，其中放置在样品池35内 的液体样品与第一和第二电极31、33接触；和
(c)在装配前放置在暴露的电极31上的干燥试剂；和
(d)允许对电极31和33作出电接触的暴露表面36。
干燥试剂的放置使得在液体样品应用于测试条后，所述干燥试剂溶解于样品池内 的样品中。例如，如所示且在商购可得的测试条中是常规的，所述干燥试剂可以在液体样品 应用前放置在样品池内。
第一和第二电极适当地由具有合适传导性的惰性材料例如碳或金属例如金、钯或 铂制成。在使用碳电极的一些实施方案中，碳以可丝网印刷的墨的形式制备。在一些实施方 案中，第一和第二电极中的至少一个包含钯。在一些实施方案中，第一和第二电极都包含 钯。在其他实施方案中，第一和第二电极中的至少一个包含金，或第一和第二电极都包含 金。电极可以具有相等或不同的尺寸，并且可以由相同或不同材料制成。
电极可以处于如图3中所示的对向配置(facingconfiguration)，但还可以处于 共面配置。当处于面对配置时，干燥试剂可以适当地如US-2005-0258036A1(其通过引用 并入本文)中所述放置在一个电极上，并且在U形配置中沿着池壁向上延伸。
为了使执行测试所需的样品量最小化，样品池优选是非常小的，例如具有小于1μ l、优选小于500nl、更优选小于300nl的体积。此类样品体积是已知的，并且用于常规商购 可得的测试条中，与将样品体积减少至使对于经历测试的个人的疼痛降到最低的可能程度 的充分了解的目标一致。
在本发明的一些实施方案中，测试条包含：
(TS1)(a)第一和第二非反应电极；
(b)用于接受液体样品的样品池，其中放置在样品池内的液体样品与所述第一和 第二电极接触；和
(c)依照权利要求1-21中任一项的干燥试剂，其中所述干燥试剂的放置使得在液 体样品应用于测试条后，所述干燥试剂溶解于所述样品池内的样品中。
(TS2)段落(TS1)的测试条，其中所述干燥试剂在液体样品应用前放置在样品池 内。
(TS3)段落(TS1)或(TS2)的测试条，其中所述第一和第二电极是金属电极。
(TS4)段落(TS1)到(TS3)中任一项的测试条，其中所述第一和第二电极中的至少 一个包含钯。
(TS5)段落(TS4)的测试条，其中所述第一和第二电极都包含钯。
(TS6)段落(TS1)到(TS3)中任一项的测试条，其中所述第一和第二电极中的至少 一个包含金。
(TS7)段落(TS6)的测试条，其中所述第一和第二电极都包含金。
用于测试分析物的方法
本发明的进一步方面是用于测试液体样品中的分析物的方法。该方法包括步骤：
(a)将液体样品应用于掺入如上所述的干燥试剂的测试条；其中所述干燥试剂中 的酶选择为对于所述分析物是特异性的；
(b)将外部信号应用于测试条以生成指示样品中的分析物的量的信号。
在本发明的具体实施方案中，所述液体样品是血液。在本发明的具体实施方案中， 所述分析物是葡萄糖，并且所述酶是葡萄糖氧化酶。
在本发明的具体实施方案中，所述外部信号是在测试条的第一和第二电极之间应 用的电位，并且测量电流作为指示样品中的分析物的量的信号。用于进行这类测量的方法 在本领域中是已知的，例如来自上述专利和出版物，并且可以被称为安培计测量。电量分析 涉及电流测定法，其中测量在一段时间中经过的总电荷(电流信号的积分)。
在本发明的其他实施方案中，应用的信号是电流，并且测量的是电位。(参见通过 引用并入本文的美国专利号5,413,690和美国公开2010/0025265)。
在一些实施方案中，本发明的方法是：
(MT1)用于测试液体样品中的分析物的方法，其包括步骤：
(a)将液体样品应用于依照段落(TS1)到(TS7)中任一项的测试条；其中所述干燥 试剂中的酶选择为对于所述分析物是特异性的；和
(b)将外部信号应用于测试条以生成指示样品中的分析物的量的信号。
(MT2)段落(MT1)的方法，其中所述外部信号是在测试条的第一和第二电极之间 应用的电位，并且测量电流作为指示样品中的分析物的量的信号。
(MT3)段落(MT1)或(MT2)的方法，其中所述液体样品是血液。
(MT4)段落(MT1)到(MT3)中任一项的方法，其中所述分析物是葡萄糖，并且所述 酶是葡萄糖氧化酶。
用于形成贮存稳定的试剂的方法
在进一步方面，本发明提供了形成用于在测试分析物(例如葡萄糖)中使用的贮存 稳定试剂的方法。由于金电极与试剂相互作用的潜力，当所述试剂贮存于具有金电极的测 试条中时，这是特别相关的。
在具体实施方案中，本发明的这个方面包括：
(SS1)形成用于在分析物检测中使用的贮存稳定的电化学测试试剂的方法，其包 括步骤：
(a)选择氧化还原酶，其氧化/还原作为特异性底物的分析物；
(b)选择铁氰化物盐，其中所述铁氰化物盐由铁氰根和所选带正电的抗衡离子组 成，所述带正电的抗衡离子经过选择，从而使得铁氰化物盐在水中可溶，并且从而使得铁氰 化物盐或铁氰化物盐的晶相具有在水中的溶解度，和/或在100mM的浓度下具有低于铁氰 化钾的E0eff；和
(c)组合所选酶和所选铁氰化物盐，以形成用于在分析物检测中使用的贮存稳定 的电化学测试试剂。
(SS2)段落(SS1)的方法，其中所选的铁氰化物盐包括作为带正电的抗衡离子的 烷基铵离子。
(SS3)段落(SS2)的方法，其中所述烷基铵离子的烷基含有1-3个碳原子。
(SS4)段落(SS3)的方法，其中所述铁氰化物盐包括作为带正电的抗衡离子的四 甲基铵离子。
(SS5)段落(SS3)的方法，其中所述铁氰化物盐包括作为带正电的抗衡离子的铷 离子。
(SS6)段落(SS1)到(SS5)中任一项的方法，其中所选的铁氰化物盐中的带正电的 抗衡离子都是相同的。
(SS7)段落(SS1)到(SS6)中任一项的方法，其中所述试剂还包括以下的步骤：选 择不是铁氰化物盐的电子转移介体，所述电子转移介体在水介质中具有足以还原/氧化失 活还原形式的酶以再生活性的氧化还原酶的电化学电位，和在试剂中包括所选的电子转移 介体。
(SS8)段落(SS7)的方法，其还包括在试剂中包括还原形式的电子转移介体的步 骤，其中相对于氧化形式的电子转移介体，所述还原形式的电子转移介体的量使得试剂的 溶液具有与稳态基线信号可比的基线，所述稳态基线信号在不存在还原形式的电子转移介 体的情况下通过老化干燥试剂的溶液产生。
(SS9)段落(SS7)或(SS8)的方法，其中所述电子转移介体是锇配位络合物。
(SS10)段落(SS9)的方法，其中所述锇配位络合物是Os(dmbpy)2PicCl。
(SS11)段落(SS9)的方法，其中所述锇配位络合物是Os(dmbpy)2Im2Cl。
(SS12)段落(SS1)到(SS11)中任一项的方法，其还包括在干燥试剂中包括亚铁氰 化物盐的步骤，所述亚铁氰化物盐由亚铁氰根和与铁氰化物盐相同的带正电的抗衡离子组 成，其中相对于铁氰化物，亚铁氰化物量使得干燥试剂的溶液具有与稳态基线信号可比的 基线，所述稳态基线信号通过仅含有干燥试剂的铁氰化物和酶组分的老化干燥试剂的溶液 产生。
(SS13)段落(SS1)到(SS12)中任一项的方法，其还包括向所述试剂添加两性离子 缓冲剂的步骤，所述两性离子缓冲剂包含带正电的缓冲抗衡离子和缓冲共轭碱。
(SS14)段落(SS13)的方法，其中所述缓冲共轭碱是3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2- 羟基丙磺酸的共轭碱。
(SS15)段落(SS13)的方法，其中所述共轭碱是N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸 的共轭碱。
(SS16)段落(SS13)到(SS15)中任一项的方法，其中所述带正电的缓冲抗衡离子 包含与所选的铁氰化物盐相同的抗衡离子。
(SS17)段落(SS13)到(SS15)中任一项的方法，其中所述带正电的缓冲抗衡离子 基本上由与所选的铁氰化物盐相同的抗衡离子组成。
(SS18)段落(SS1)到(SS17)中任一项的方法，其还包括向所述试剂添加两性离子 湿润剂的步骤，所述两性离子湿润剂包含包括胺和磺酸盐的亲水头部基团，和10-16个碳原 子的疏水脂肪族尾部。
(SS19)段落(SS18)的方法，其中所述两性离子湿润剂的疏水尾部是12个碳原子 的尾部。
(SS20)段落(SS1)到(SS19)中任一项的方法，其中所述酶是葡萄糖氧化酶。
本发明的缓冲组合物
在本发明的进一步方面，提供了包含缓冲剂的缓冲溶液，所述缓冲剂由3-[N-三 (羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸，和3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸的共轭碱的 四甲基铵盐形成。
本发明的益处
铁氰化物盐(一般为铁氰化钾)是充分了解且相对廉价的电子转移介体，其持续用 于多种商业测试条中，特别是用于葡萄糖的测量。然而，如上所述，铁氰化钾具有问题。本发 明克服了这些问题，并且因此促进铁氰化物在这种能力中的继续使用。
图4显示在不同加速老化期后，对于使用含有葡萄糖氧化酶、铁氰化钾和Os (dmbpy)2PicCl的干燥试剂制备的测试条(参见实施例11)，作为葡萄糖浓度的函数的测量 电流。可见，在任何给定浓度测量的电流基本上随着老化时间而增加。图5显示含有代替铁 氰化钾的TMA铁的测试条中的相同实验的结果。与老化时间无关，测量的电流量没有变化。
不期望受任何具体机制束缚，认为电流的这种变化起因于在老化过程中部分铁氰 化物至亚铁氰化物的转化。这导致甚至在样品中不存在葡萄糖的情况下发生的电极间的基 线电流。图6显示这种基线电流对于不同盐的关系。TMA铁明显是测试的盐中最佳的。然而， 铁氰化铷也是优良的，因为基线电流中的增加趋于比钾盐更低的水平，使得更容易补偿由 于老化的变化。在50℃下老化14天后的基线和盐的饱和溶解度之间的关系显示于图7中。再 次，不期望受任何具体机制束缚，认为这些结果显示当湿润试剂的最后部分变干时，在试剂 中形成玻璃相；这个玻璃相中截留的铁氰化物量取决于铁氰化物盐的溶解度，并且设定部 分的这种铁氰化物转换为亚铁氰化物以得到基线信号，直至达到极限的铁:亚铁比例。
在测试条贮存期限过程中改变的基线信号是测试条性能中的误差的主要来源。这 种误差可以通过指定测试条的更弱的性能耐受或产品的更短贮存期限进行管理。因此，益 处不仅在于具有对最高基线的下限，还来自于在测试条贮存期限过程中基线仅有小的变 化。根据老化实验如图4、5和6的那些，可以确定基线上升的限制，这通常通过在50℃下14天 而稳定。因此，在制备测试条前将亚铁氰化物引入湿润试剂中是有利的，从而使得新鲜制备 的测试条的基线在测试条寿命开始时已处于这个水平。或者，不同还原剂可以加入溶液中， 以原位生成亚铁氰化物。如果这种还原剂是试剂已鉴定的组分中的另一种，则这是有利的， 因为这防止引入杂质。如果该组分是用于酶的电子转移介体例如Os(dmbpy)2PicCl，则这是 特别有利的，因为还原形式的这类化合物在制备上更易于处理(还原形式的此类复合物通 常具有更低溶解度，因此更容易分离，并且由于其电子构型，它们的纯度可以通过n.m.r.的 标准分析技术确定，而氧化形式则不能)。可以通过比较其中已在试剂中使用还原介体的测 试条与其中相同试剂已首先用PbO2氧化以迫使基线电流更低的测试条相比较，从而检查基 线稳定性。这在实施例15中描述，并且效应在图8中说明，其显示试剂中还原组分的存在得 到来自传感器的更稳定的基线电流。
此外，本发明的试剂在测试条老化时经历更少的酶活性丧失。这允许在每个测试 条中使用更少的酶，同时能够维持高水平的性能。
实施例1：铁氰化四甲基铵的合成
将Dowex50WX2-200(H)离子交换树脂加入DI水中，并且振荡以形成浆料。将这种 浆倾入具有多孔玻璃料和PTFE活塞的玻璃柱内。柱还用UV过滤塑料包裹。加入更多浆料并 且液体流出直到树脂深度沉降，以得到58ml的柱体积。柱用DI水冲洗：最初洗脱液是橙色 的，但冲洗继续直至洗脱液澄清运行。加入20ml1MHCl，并且运行通过柱：这引起柱体积 缩减到45ml。酸冲洗离开柱直到洗脱液的pH为~pH6(在pH试纸上测量)，此时柱体积也已 通过树脂的膨胀恢复至58ml。装配25个收集罐，各自具有体积>10ml，并且各自装有400 ul25重量%的氢氧化四甲基铵水溶液。将8ml1M铁氰化钾加入柱中；当所有8ml都已运行 进入柱内时，在底部洗出的洗脱液显示黄色调并为pH~4。洗脱液的收集在第一个收集罐中 起始，并且立即形成沉淀物，并且这随着管内容物变成酸性而溶解。每当内容物变成酸性 时，洗脱液收集转到下一个罐，并且对于前八个罐全部观察到当内容物变成酸性时溶解的 沉淀物。第九到15个罐变成酸性，而没有沉淀物的完全溶解，并且上清液是绿色和非常浓缩 的。这个颜色对于第十六个罐是淡黄色，并且到第十七个罐时，没有形成沉淀物，并且洗脱 液变得越来越淡。收集在这个点时停止，并且合并所有罐的酸化内容物；它们随后用更多的 25重量%的氢氧化四甲基铵水溶液中和，并且中和所需的氢氧化物总体积计算为8.6ml (包括17个收集罐的内容物)。这等于2.15g氢氧化四甲基铵，即23.58毫摩尔，其与由原始 铁氰化钾溶液交换的24毫摩尔钾离子良好比较。铁氰化四甲基铵的中和黄色溶液在冰浴中 冷却，并且晶体作为絮片生长，所述絮片通过吸滤分离并且在真空干燥器中干燥，基于二氢 化物的得率为2.517g，67%。通过在盐冰浴中冷却可以获得更高得率(2小时后>80%)。
实施例2：铁氰化铷的合成
离子交换柱如实施例1中制备，并且制备具有3-10ml体积的20个收集罐，各自装 有200ul50重量%的氢氧化铷水溶液。加入10ml铁氰化钾且运行到柱内。在配备UV吸收盖 的荧光灯下进行洗脱液的收集。洗脱液收集用第一个罐开始，并且每当通过pH试纸监控的 内容物变成酸性时，转到下一个罐。罐溶液是澄清和黄色的，除非当内容物变得极端酸性 时，在这种情况下内容物变成绿色。这种黄色对于第十八个罐是淡黄色，并且到第十九个罐 时，洗脱液已变得越来越淡。收集在这个点时停止，并且合并所有罐的酸化内容物；它们随 后用更多的50重量%的氢氧化铷水溶液中和，并且中和所需的氢氧化物总体积计算为3.4 ml(包括17个收集罐的内容物)。这等于28.87毫摩尔氢氧化铷，其与由原始铁氰化钾溶液 交换的30毫摩尔钾离子良好比较。铁氰化铷的中和黄色溶液通过在加热板上轻轻加热进行 浓缩，直至几乎煮沸的溶液显示晶体形成的最初证据(在约12ml时)，并且冷却浓缩溶液允 许橙色铁氰化物晶体缓慢形成。晶体通过吸滤分离并且在真空干燥器中干燥。基于铁氰化 铷的468.39g/mol的MWt，铁氰化铷的得率为约3.66g，78%。
实施例3：亚铁氰化铷的合成
将来自实施例2的滤液与乙醇混合，以生成50:50乙醇水溶液，其立即生成淡黄色 的沉淀物。将这种溶液加热至煮沸并且随后缓慢允许醇馏出得到澄清溶液，允许所述澄清 溶液缓慢冷却过夜，以得到淡黄色晶体。晶体通过吸滤分离并且在真空干燥器中干燥，以得 到1.05g亚铁氰化铷三水合物，基于607.87g/mol的rmm为1.72毫摩尔，并且进一步回收 17.2%的最初铁氰化物。
实施例4：测量铁氰化钾的有效电极电位
制备铁氰化钾(在10ml中0.3293g，100mM，标记为‘A’)和亚铁氰化钾(在10ml中 0.4224g三水合物，100mM，标记为‘B’)的原液。测量出4ml原液A，并且使用ORP电极测量溶 液的化学电位。在加入原液B的下述等分试样后进行进一步的ORP测量：40ul、46ul(即总 共86ul)、100ul(总共186ul)、214ul(总共400ul)、460ul(总共860ul)、1000ul (总共1860ul)、2140ul(总共4000ul)。类似地，测量出4ml原液B，并且使用ORP电极测量 溶液的化学电位。在加入原液A的下述等分试样后进行进一步的ORP测量：40ul、46ul(即 总共86ul)、100ul(总共186ul)、214ul(总共400ul)、460ul(总共860ul)、1000 ul(总共1860ul)、2140ul(总共4000ul)。将每种溶液中A和B的总体积和各自的ORP读 数的数据输入电子数据表用于拟合至能斯特方程。原液的浓度不假定为纯的：原液A假定具 有未知浓度‘a’mM的铁氰化物，并且因此在电子数据表中设置100-amM的亚铁氰化物浓度 和a=99.9mM的初始值。类似地，原液B假定具有未知浓度‘b’mM的亚铁氰化物，并且因此 在电子数据表中设置100-bmM的铁氰化物浓度与b=99.9mM的初始值。随后对于每种混 合物计算铁氰化物和亚铁氰化物的浓度，并且标绘ORP读数相对于log([铁]/[亚铁])的曲 线图。改变‘a’和‘b’的值直至曲线图变成线性，并且混合物的斜率接近于59.4mV/浓度比 变化10倍。测定ORP轴在log([铁]/[亚铁])=0时的截距，并且这是根据能斯特方程的标准 电极电位，但在[铁]+[亚铁]=100mM处测量的Eo(100mM)的测量值。结果显示于图9 中。
实施例5：测量铁氰化四甲基铵的有效电极电位
制备铁氰化四甲基铵(在10ml中0.470g二水合物，100mM，标记为‘A’)和亚铁氰化 四甲基铵(在10ml中0.4964g，100mM，标记为‘B’)的原液。测量原液的化学电位。还测量下 述原液混合物的ORP读数{0.3mlA+2.7mlB}、{0.15mlA+2.85mlB}、{0.3mlA +2.7mlB}、{0.75mlA+2.25mlB}、{1.5mlA+1.5mlB}、{2.25mlA+0.75 mlB}、{0.3mlA+2.7mlB}。如实施例4中所述，将每种溶液中A和B的总体积和各自的 ORP读数的数据输入电子数据表用于拟合至能斯特方程，并且结果显示于图9中。
实施例6：校准铁氰化钾的吸光度
通过在水中溶解1.6463g铁氰化钾，在容量瓶中补足至5mL的体积，制备1M铁氰 化钾原液。将1mL这种溶液置于100mL容量瓶中，并且通过用水将体积补足至100mL而稀 释至10mM。在试管中制备这种10mM溶液的稀释物，以涵盖从0.025到4.5mM的浓度范围， 并且在溶液一经制备，立即记录稀释物的UV/Vis光谱。扣除水样品的吸光度，以校准基线吸 光度。由基线扣除的光谱测量在420nm处峰的吸光度强度，并且针对试管溶液的浓度进行 标绘。检查曲线图以测定吸光度的线性范围，并且由在这个线性范围内的数据测定每摩尔 铁氰化物的吸光度如图10中所示。
实施例7：测量铁氰化四甲基铵的饱和浓度
将铁氰化四甲基铵晶体的样品置于一片铝箔上，并且将箔折叠起来以覆盖样品。 将其小心置于研钵中，并且通过用研棒敲打来压碎晶体。将箔和压碎的晶体脱离研棒，并且 将压碎的晶体倾入eppendorf管内。加入少量水，并且振荡溶液以溶解尽可能多的固体，随 后静置至少一小时以平衡。检查样品以确保仍保留一些固体，并且随后用吸管提取10uL溶 液，并且混合到试管中的990uL水内。将试管置于UV/Vis分光光度计中，并且记录在200- 600nm之间的吸光度光谱。在420nm处的吸光度与实施例6的校准组合使用，以测定饱和浓 度：TMA铁吸光度在420nm处为1.5317，并且校准斜率为[铁氰化物]=1.03x吸光度，得出 对于100:1稀释度，[铁氰化物]=1.58mM，并且对于TMA铁的饱和浓度为0.158M。关于通 过这种方法测量的多种饱和溶液的示例光谱显示于图11中。
实施例8：TAPSO缓冲液，pH7.5的TMA盐的合成
在100ml烧瓶中称量5.18g3-[N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)， 并且加入30ml水以溶解固体。加入足够的25重量%的氢氧化四甲基铵以使pH达到7.5，并且 随后将烧杯的内容物倾入50ml容量瓶内。冲洗烧杯以确保所有TAPSO都转移到容量瓶内， 并且用更多的水使溶液体积达到50ml。
TMA-TAPSO缓冲液代表本发明的进一步方面。
实施例9：用于测试条的试剂的配制方法
将3.66mlDI水测量到20ml烧杯内，并且加入1.25mLTAPSO缓冲液pH7.5(其 已根据实施例8的方法使用选择的阳离子调整至该pH)，随后加入90uL5%Zwittergent 312溶液。加入5mg双-4,4-二甲基二吡啶锇(II)氯化吡啶甲酸酯，并且称重出5毫摩尔的所 需铁氰化物盐并加入溶液中，随后将所述溶液搅拌5分钟。称重出135mg葡萄糖氧化酶(黑 曲霉(Aspergillusniger)，由BBIEnzymes供应，目录号GO3A)，并且小心加入缓慢搅拌的 溶液，允许所述溶液轻轻搅拌进一步的5分钟。溶液通过5um滤器过滤到具有螺旋塞盖的不 透明的黑色塑料样品管内。检查pH，并且如果发现碱性过大，则使用小量1MHCl酸化至pH 7.5。
实施例10：测试条构建
将葡萄糖传感器制备为一次性使用的测试条，其中样品室由通过0.085mm厚的粘 性间隔物保持彼此面对的两个钯电极1.5x2.0mm形成，以形成传导池。样品室具有255nl 的标称体积。将来自实施例9的300nl试剂溶液在构建过程中引入样品室内且干燥。
实施例11：使用测试条的分析物测量
将在磷酸盐缓冲盐水溶液中不同浓度的葡萄糖溶液引入实施例10的测试条内。将 300mV的电位施加于电极。通过在电极间引入样品而触发电位的施加。测量在施加电位后5 秒发生的稳定的稳态电流。
将测试条实施置于干燥器中在50℃下的加速老化条件直14天的时期。图4显示在 不同加速老化期后，对于使用含有葡萄糖氧化酶、铁氰化钾和Os(dmbpy)2PicCl的干燥试剂 制备的测试条，作为葡萄糖浓度的函数的测量的电流。图5显示含有代替铁氰化钾的TMA铁 的测试条中的相同实验的结果。
实施例12：使用测试条的基线测量
铁氰化物至亚铁氰化物的转换可以导致基线上升，因为两种离子的互换即使在样 品中不存在任何最初分析物的情况下也可以发生。制剂对基线上升的敏感性通常是轻微 的。然而，随着两年或更多年的贮存期限，即使对上升基线的微小的倾向性也可以导致在传 感器寿命过程的传感器性能中的急剧改变。因此，为了能够评价制剂对基线上升的敏感性， 重要的是有加速基线上升率的方法。此类加速老化通常通过将贮存的传感器置于温度升高 的环境中而实现。
在老化时的测试条基线中的变化显示于图6中，所述图6呈现由传感器收集的数 据，所述传感器如实施例9中所述用由一系列阳离子制备的试剂制成。图7中显示了作为铁 氰化物盐的溶解度的函数的在第0天到第14天之间的见于在这些制剂中的基线变化。如图7 中可见的，具有低于钾盐溶解度的所有盐都具有改善的基线稳定性，而具有更高溶解度的 盐具有更差的基线稳定性。这证实溶解度作为选择合适铁氰化物以给出制剂中的低基线上 升，以及显示对于此类制剂具有的基线的影响的方法的实用性。
实施例13：缓冲剂对试剂稳定性的作用
已完成研究以鉴定简单有机化合物，其提供亲水环境以限制酶不稳定性，并且本 发明人已发现对于在铁氰化钾的存在下稳定葡萄糖氧化酶，丙氨酸酐是特别合适的。然而， 在向铁氰化四甲基铵的转变中，必须对此进行检查。TMA+离子提供比K+更少的离子环境，并 且本发明人已发现简单亲水稳定剂提供比之前更低的稳定性。稳定性可以通过增加试剂的 离子性质得到改善，但避免碱金属阳离子的需要限制了选择。一系列两性离子已证明是有 效的，可能是因为它们增加试剂的离子性质，而不引入额外的游离阳离子。
本发明人已测定在试剂中缓冲液的存在将有助于总体试剂稳定性，所述缓冲液在 pH7-8之间具有良好的缓冲能力，并且在性质上是两性离子的。这两种性质描述由Good 等人首次鉴定的用于稳定生化反应的一系列缓冲液(N.E.Good，G.D.Winget，W.Winter， T.N.Connolly，S.Izawa，和R.M.M.Singh，Biochemistry，1966，5，467-477)。已证明其作 为干燥试剂中的酶稳定剂价值的两种“良好缓冲液”是TAPSO和TES。
为了测试TMA-TAPSO和TMA-TES在维持干燥试剂中的酶稳定性中的功效，用27mg/ ml葡萄糖氧化酶、1mg/mlOs(dmbpy)2PicCl、100mMTMA铁、2.6mg/ml表面活性剂10G和 如表3中所示的缓冲液/稳定剂制备一系列试剂制剂。由每种制剂制成的测试条与实施例10 的那些类似，但其采用金电极，并且将其在50℃下老化直到40天。
因为酶活性的丧失导致校准曲线(信号相对于葡萄糖浓度)的斜率变化，所以在整 个老化过程中定期取出测试条且用于生成校准曲线。测定作为老化的结果的校准曲线的斜 率变化。表3包括在14天老化时关于斜率变化量的数值。图12显示以图解形式的斜率，并且 图13显示截距。TMA-TAPSO优于TMA-TES，并且两者都远远优于比较稳定剂。
实施例14：最小酶量
制备两种基本制剂如下：(1)100mMK铁、100mM磷酸钾pH6.2、1mg/mlOzPic、 2.6mg/ml表面活性剂10G、50mM丙氨酸酐、1重量%二氧化硅分散体；(2)100mMTMA铁、 100mMTAPSOpH7.5、1mg/mlOzPic、0.9mg/mlZwittergent312。将不同量的葡萄糖氧 化酶加入每种基本制剂中，并且将最终制剂掺入测试条内，所述测试条类似于实施例10的 那些，但采用金电极。含葡萄糖样品在测试条中进行评估。图14显示电流相对于葡萄糖浓度 的斜率(基本上校准曲线)对葡萄糖氧化酶浓度的依赖性。
这两种制剂是非常不同的，并且两者仍显示到约18mg/mlGOx时达到斜率中的平 台的相同一般形式。因此，这是稳定性能所需的活性酶的最小量，并且必须加入过量以补偿 随着测试条寿命过程而丧失的活性。
单一测试条中的活性酶量是难以测量的，但可以使用自动滴定器以监控通过酶产 生的酸速率作为酶活性的相对测量值。图15中显示了对于保持在50℃的干燥器小瓶中的测 试条，这种酶活性的测量值如何随着时间而变化的曲线图。测试条中的试剂含有100mMTMA 铁、1mg/mlOzPic、27mg/mlGOx100mMTAPSOpH7.5和2.6mg/ml表面活性剂10G。
测试条件的敏感性提供了读数的不确定性程度，但很可能酶活性在贮存期中的丧 失是非常有限的。在图16中在50℃下56天的研究期可以等于在30℃的一般贮存温度上限时 乘以11倍的等价时间，这表明这个加速老化期等于经过1年零8个月的实际贮存期限，而无 酶活性的显著丧失。然而，在实际贮存期限的评估中，必须对不确定性进行适当考虑。
相应地，考虑到由于贮存时老化而高达25%酶损失，以及在制造中实际分配至测试 条的酶量的变化，希望用足够的酶配置测试条，以当酶溶解于样品室中的最大体积时，产生 至少27mg/ml的起始浓度。
如图16和17中所示，对于超过这个最小量的制剂，不存在老化时斜率或截距的发 展，并且对于超过这个最小值的酶浓度的所有斜率和基线重叠，表明至少在本文研究的浓 度下，过量酶不改变测试条的性能。
实施例15：在湿润试剂中的氧化程度对干燥试剂的基线的作用
使用如实施例9之一的试剂，按照实施例10中所述制备一批测试条，并且因此试剂 含有1mg/mL的介体双-4,4-二甲基二吡啶锇(II)氯化吡啶甲酸酯；如通过ORP电极测量的 溶液电位相对于Ag/AgCl为308mV。制备其他三批测试条，第一种使用一部分相同试剂，但 通过与PbO2一起搅拌将其氧化直至电极电位上升至384mV。制备类似于第一种的第二种试 剂，但其仅含有0.7mg/mL介体，并且它的溶液电位相对于Ag/AgCl为314mV，并且其一部分 用PbO2氧化直至电极电位上升至390mV；剩下两批测试条使用这两种试剂。测试条在干燥 器小瓶中在50℃下老化，并且通过定期测试(在第0、28和56天时)跟踪基线信号的进展；结 果显示于图8中。
表1
分析物 酶 葡萄糖 葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶 尿素(BUN) 尿素酶 肌酸酐 肌酸酶 尿酸 尿酸酶 胆固醇 胆固醇氧化酶 乳酸/丙酮酸 乳酸脱氢酶(LDH)
表2
存在的阳离子 在0.1 M [铁] + [亚铁]时，相对于Ag/AgCl的E0eff 在室温下的溶解度 钠 238 1.31 M 钾 228 1.09 M 铷 248 1.05 M 铯 255 1.40 M TMA 191 0.170 M
表3
制剂名称 缓冲液/稳定剂 试剂pH 在50℃下经过14天的斜率下降(uA/mM葡萄糖) 丙氨酸酐pH 7.0 50 mM丙氨酸酐 7.0 0.83 木糖醇pH 7.0 50 mM木糖醇 7.0 0.86 TAPSO pH 6.5 100 mM TAPSO 6.5 0.26 TAPSO pH 7.0 100 mM TAPSO 7.0 0.00 TAPSO pH 7.5 100 mM TAPSO 7.5 0.30 TES pH 6.5 100 mM TES 6.5 0.25 TES pH 7.0 100 mM TES 7.0 0.21