无抗药基因的酵母-细菌穿梭载体的构建和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103757048 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103757048 A (21)申请号 201310191146.4 (22)申请日 2013.05.22 C12N 15/81(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 仙奕生物科技 （南京） 有限公司 地址 210000 江苏省南京市江宁大学城鹏山 路 9 号 (72)发明人 邵蔚蓝 王洪成 (54) 发明名称 无抗药基因的酵母 - 细菌穿梭载体的构建和 应用 (57) 摘要 穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选 标记、。

2、 能够在大肠杆菌和另一种宿主细胞中独立 存在并进行复制的质粒载体。目前广泛使用的穿 梭载体都含有用作筛选标记的抗药基因， 其生物 安全性是限制微生物转基因技术推广应用的关键 因素。本发明成功利用葡萄糖胺合成酶基因取代 抗药基因， 获得酵母 - 大肠杆菌， 穿梭载体 pGFA。 新载体的特征 ： (1) 不含潜在危害性基因， 具有生 物安全性 ； (2) 筛选功能强， 能够有效维持重组表 征 ； (3) 不受微环境中富营养条件的影响 ； (4) 两 种宿主共用筛选标记， 从而精简了载体分子、 扩大 了载体容量、 提高了基因转化率。通过 pGFA 赋予 新功能的酵母细胞可以在食品发酵、 饲料添加、。

3、 环 境修复等领域得到推广应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 12 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表12页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103757048 A CN 103757048 A 1/1 页 2 1. 一种新型酵母 - 大肠杆菌穿梭载体， 其基本特征在于不含有任何用作筛选标记的抗 药基因。 2. 一种穿梭载体， 其特征在于只带有 1 个能够被不同的宿主细胞共同使用的非抗药性 筛选标记基因。 3. 一种穿梭载体， 其特征在于控制外源基因表达的启动子是来源于酵母。

4、菌 eno 基因的 强启动子。 4. 如权利要求 2 所述的穿梭载体中的筛选标记， 其特征在于是由人工设计和合成的、 能够被酵母和细菌共用的谷氨酰胺 ： 6- 磷酸果糖氨基转移酶的基因表达盒， 其组合元件依 次为 ： 酵母启动子、 大肠杆菌启动子、 核糖体结合位点、 开放阅读框、 大肠杆菌转录终止子、 酵母转录终止信号序列。 5.一种大肠杆菌载体pHsh-Sp-gfa-Ec其特征在于带有如权利要求4所述的谷氨酰胺 ： 6- 磷酸果糖氨基转移酶的基因表达盒。 6. 如权利要求 4 和权利要求 5 所述的谷氨酰胺 ： 6- 磷酸果糖氨基转移酶的基因表达 盒， 其碱基序列与 pHsh-Sp-gfa-。

5、Ec 中的 Sp-gfa-Ec 序列 (SEQ ID NO.14) 的同源性高于 80。 权 利 要 求 书 CN 103757048 A 2 1/5 页 3 无抗药基因的酵母 - 细菌穿梭载体的构建和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程领域 ； 具体涉及分子生物技术、 基因工程、 细胞工程、 环境修 复等技术领域 ； 更具体涉及 1 种不含抗药基因的酵母 - 细菌穿梭载体及其应用技术。 背景技术 0002 穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选标记、 能够在大肠杆菌和另一种宿主 细胞中独立存在并进行复制的质粒载体 ( 吴乃虎， 2001，基因工程原理 ， p.502)。大肠杆 菌是转。

6、化率最高、 质粒最容易分离的宿主细胞。 为了有效转化大肠杆菌以外的宿主细胞， 人 们首先需要在大肠杆菌中进行基因克隆和载体构建， 并通过大肠杆菌细胞制备较大量的纯 质粒 ； 因此， 所采用的质粒必须含有一套大肠杆菌的复制元件和筛选标记， 同时含有第二套 适用于另一种宿主细胞的复制元件和筛选标记。 0003 筛选标记是质粒载体所必备的基本元件。 抗药基因是微生物转基因的有效筛选标 记， 目前所使用的在不同微生物和大肠杆菌之间共用的穿梭载体都含有用作筛选标记的抗 药基因。通过这些载体转基因可能导致抗药基因的扩散， 其生物安全性问题长久以来一直 是限制微生物转基因技术推广应用的关键因素。 营养缺陷型。

7、筛选标记可以避免抗药基因的 传播， 具有生物安全性， 但是自然环境或自然培养基中富含氨基酸、 核苷酸等营养成分， 使 相关的营养缺陷型筛选标记不能够维持筛选压力。 同时， 由于细菌易于回复突变， 营养缺陷 型筛选标记在细菌如大肠杆菌中未能有效运用。 0004 谷氨酰胺 ： 6- 磷酸果糖氨基转移酶 (Gfa) 又称 6- 磷酸葡萄糖胺合成酶 (Glm) ； 它 是一种胞内酶， 催化底物谷氨酰胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸， 即氨基己 糖合成代谢途径中的第一步反应 (Bearne SL， J Biol Chem， 1996， 271 ： p.3052-7)。Gfa 几 乎存在于每个。

8、物种和组织中， 是生命活动所必需的 (Yamazaki K， et al.， Gene， 2000， 261 ： p.329-36 ； Smith RJ， et al.， J Bacteriol， 1996， 178 ： p.2320-7)。Gfa 编码基因的失活会 使细胞依赖于外源葡萄糖胺的补充。 0005 本实验室在以前的研究中， 我们首次用实验证明葡萄糖胺合成酶基因可以是一 种既适用于真菌又适用于细菌的生物安全性的筛选标记基因 (Wu G， et al.， PLoS One， 2011.6 ： p.e17082)。我们敲除了大肠杆菌 (Escherichia coli) 的 Gfa 编码。

9、基因 glmS 和粟 裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe) 的 Gfa 编码基因 gfa1， 构建了两种 gfa 缺失菌株， E.coli glmS和S.pombe gfa1 ； 这些菌株在不添加葡萄糖胺的培养基中不能正常生长。 当我们用带有glmS基因的大肠杆菌质粒pHsh-glmS转化大肠杆菌后， 含有质粒的大肠杆菌 细胞得到成功筛选。同样， 用带有 gfa1 的粟酒裂殖酵母质粒 pREP-AGCX 转化菌株 S.pombe gfa1 能够使它重新获得在不添加葡萄糖胺的培养基上生长的能力 ； 其中， pREP-AGCX 和 其他所有的穿梭载体一样 ： 至少带有 1。

10、 个用作大肠杆菌筛选标记的抗药， 如 ampr( 氨苄青霉 素抗药基因 )(Wu G， et al.， PLoS One， 2011， 6 ： p.e17082)。 发明内容 说 明 书 CN 103757048 A 3 2/5 页 4 0006 1. 发明目的 ： 0007 以 Gfa 缺失菌株为基础， 创建 1 个既能够被酵母系统又能够被大肠杆菌系统识别 和转录表达的非抗药性筛选标记， 从而构成 1 个不带有任何抗药基因的穿梭载体。本发明 的穿梭载体由生物安全性基因构成， 从而能够在基因重组菌株的应用范围方面取得突破 ： 用该质粒进行遗传改造的细胞可以直接应用于食品发酵、 饲料添加、 环境。

11、修复等复杂环境。 0008 2. 技术关键 ： 0009 将粟酒裂殖酵母基因gfa1(Sp-gfa)用着酵母-大肠杆菌穿梭载体中的筛选标记， 对 Sp-gfa 上游的转录表达元件进行重新设计和改造， 使穿梭载体中的 Sp-gfa 在大肠杆菌 和粟酒裂殖酵母都具有筛选标记功能， 不再使用抗生素筛选， 达到构建生物安全性穿梭载 体的目的。 0010 3. 技术方案 ： 0011 (1) 利用生物信息学软件分析粟酒裂殖酵母 gfa1 基因的启动子和终止信号序列 区， 并将含有自身启动子和终止信号序列的 gfa1 基因插入到一个原核载体 pHsh 中。 0012 (2) 在 pHsh-Sp-gfa 中。

12、， 删除 gfa 基因中的内含子序列， 并人工改造 gfa 基因的终 止密码子下游序列， 形成可以在大肠杆菌中使用的终止子序列。 0013 (3) 在优化过的 pHsh-Sp-gfa 载体基础上， 人工设计改造 gfa 基因的启动子序列， 加入大肠杆菌的 70启动子核心序列和核糖体结合位点 SD 序列， 并转化 E.coliglmS。 0014 (4) 将经过改造的可在大肠杆菌中发挥筛选功能的 gfa 基因序列插入到 pREP3X 中， 并删除载体中的 leu 和 amp 筛选标记基因序列， 构建成新型穿梭载体 pGFA( 图 1)。 0015 (5)验证改造后的穿梭载体在gfa缺失型菌株S.。

13、pombegfa1和E.coliglmS中 的转化和选择功能。 0016 (6) 新型穿梭载体 pGFA 克隆外源基因在裂殖酵母中进行表达试验。 0017 4. 本发明可取得的有益效果 ： 0018 (1)本发明产生的质粒pGFA是一个生物安全性的转基因载体。 这是生物工程领域 第 1 个成功剔除抗生素筛选标记基因的新型穿梭载体， 质粒的基本元件仅包含质粒复制元 件和 gfa 筛选标记， 前者广泛存在于自然界而后者是各种生物都具有的必需基因。 0019 (2)pGFA 所使用的非抗药基因筛选标记能够有效地维持筛选压力， 从而有效防止 重组基因的丢失。 0020 (3)pGFA 的筛选作用不依赖。

14、于抗菌素或其他化学品的添加， 也不受自然环境或发 酵原料中的糖、 氨基酸、 核苷酸等营养成分的影响。 0021 (4) 在 pGFA 中， 不同宿主共用同一个筛选标记， 质粒的分子得到充分精简， 外源目 标基因的容量进一步扩大， 基因转化率得到提高。 附图说明 0022 图 1. 本发明的穿梭载体 pGFA(B) 与通用穿梭载体 (A) 的结构图比较。 0023 图 2. 筛选标记 gfa 基因的起始密码子上游序列人工设计改造前后比较。 0024 图 3. 载体 pGFA 转化 E.coliglmS(A， B) 和 S.pombe gfa1 的互补验证 (C， D) ： 在不补充葡萄糖胺的培养。

15、基上， 只有带有 pGFA 的菌株才能生长 (B， D)。 0025 图4.运用载体pGFA克隆木聚糖酶基因， 使无抗药基因酵母重组菌分泌木聚糖酶。 说 明 书 CN 103757048 A 4 3/5 页 5 具体实施方式 ： 0026 本发明中所用术语， 除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解的 含义。下面的方法结合具体实施例， 并参照数据进一步详细的描述本发明。应理解实施例 只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0027 1. 所用材料与常规技术 0028 (1) 菌株及质粒 ： 0029 敲除粟酒裂殖酵母 S.pombe YHL6381 菌株 (h+。

16、， his3-D1， leu1-32， ura4-D18， ade6-M210) 中的 gfa1 基因构获得 gfa 缺失型菌株 S.pombe gfa1， 敲除 E.coli K12 菌株 中的 glmS 基因获得 gfa 缺失型菌株 E.coliglmS， 具体方法参见 Wu G， et al.(PLoS One， 2011， 6 ： p.e17082)。本研究中还用到 E.coli DH10B 菌株以及质粒 pREP3X(Maundrell， K.1993， Gene 123 ： 127-130)， pHsh-Amp(Wu H， et al.， 2010， Biotechnol Lett。

17、， 32 ： 795-801)。 0030 (2) 感受态细胞的制备及基因转化方法 ： 0031 菌株 E.coli glmS 在含有 5mM 盐酸葡萄糖胺 ( 购自 Sigma 公司， 货号 G4875) 的 LB培养基中培养(37)， 并按照标准大肠杆菌感受态制备方法制备电转化感受态细胞。 采 用电穿孔系统 (Bio-rad Gene Pulser XcellTM) 并按其操作要求进行大肠杆菌的电转化。 粟酒裂殖酵母菌株 S.pombegfa1 在含有 10mM 盐酸葡萄糖胺的 YES 培养基中培养， 按照标 准醋酸锂转化方法进行基因转化。本研究中所使用的酵母培养基 YES 和 EMM 中。

18、均添加了终 浓度为 225mg/l 的组氨酸、 亮氨酸、 腺嘌呤和尿嘧啶。 0032 (3) 其他常规 DNA 操作方法 ： 0033 实验中所使用的 T4 DNA 连接酶购自 NEB 公司，DNA 聚合酶、 DNA 聚合酶、 DNA 分子量 Marker 等常规试剂均购自大连 Takara 生物公司， DNA 片段割胶回收中所用 QG、 PE 试剂购自 Qiagen 公司。PCR 反应和 DNA 片段连接反应均按 照相应说明书要求操作。 根据Yeast Plasmid Mini Kit试剂盒操作说明， 提取酵 母质粒。基因序列的测定由上海美吉生物公司完成。 0034 2. 在酵母 gfa 基。

19、因及其表达元件中植入大肠杆菌基因表达元件 0035 (1)基因克隆 ： 根据GeneBank数据中的GeneID ： 2539622基因数据， 设计引物(SEQ ID NO.1和No.2)从粟酒裂殖酵母基因组中扩增gfa1基因及其自身带有的启动子和终止信 号序列。 得到的PCR产物长度为2,718bp， 其碱基序列列表于SEQ ID NO.3， 定名为Sp-gfa。 设计引物 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.5 扩增大肠杆菌表达载体 pHsh-Amp 的线性片段， 将它 与 Sp-gfa 连接构建成大肠杆菌表达质粒 pHsh-Sp-gfa。由于 Sp-gfa 插入 pHsh-A。

20、mp 质粒中 的 amp 基因序列与复制元件序列之间， 保证 Sp-gfa 的表达不受 pHsh-Amp 自身启动子的影 响。 0036 (2) 终止子和内含子 ： 带有自身启动子的酵母基因 gfa1 在大肠杆菌中不能够表 达， 需要经过添加大肠杆菌的终止子、 启动子， 并去除内含子。我们在 gfa1 基因编码框的下 游区设计加入不依赖 因子的终止子序列， 采用反向 PCR 方法， 以构建得到的 pHsh-SpGfa 质粒为模板， 用引物 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.7 扩增， 得到的 PCR 片段， 磷酸化处理后， 进 行连接反应得到质粒pHsh-Sp-gfa-term。。

21、 在gfa1基因中发现两个紧邻的内含子， 我们通过 说 明 书 CN 103757048 A 5 4/5 页 6 一步反向 PCR 的方法将其去除， 所用引物序列见 SEQ ID NO.8 和 SEQ ID NO.9， 所得到的质 粒命名为 pHsh-Sp-gfa-intron。 0037 (3) 启动子和核糖体结合位点 ： 为了保证 gfa1 基因在大肠杆菌中的各个生长 时期都能表达， 所以我们将其设计在组成型启动子的控制下。因此， 我们采用反向 PCR 的方法， 在 gfa1 基因的上游序列区中设计引物插入 70类型启动子的核心序列 -10 区 (5 -TATAAT-3 ) 和 -35 区。

22、 (5 -TTGACA-3 )， 所用引物序列为 SEQ ID NO.10 和 SEQ ID NO.11， 得到的质粒命名为 pHsh-Sp-gfa-70。 0038 在大肠杆菌中， 目的基因的表达除了有启动子核心序列元件外， 还要有核糖体结 合位点 SD 序列， 以便在翻译过程中使核糖体能正确结合到转录合成的 mRNA 上。采用反 向 PCR 方法， 将大肠杆菌基因 dmsC 的核糖体结合位点序列加入到 pHsh-Sp-gfa-70 中 的 gfa1 基因的前面， 所用引物为 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.13。测序正确的质粒命名为 pHsh-Sp-gfa-Ec， 启动子。

23、序列改造前后比较见图 2。经人工改造后的的 gfa1 基因及表达元 件序列见 SEQ ID NO.14。 0039 (4) 筛选标记功能验证 ： 我们用 pHsh-Sp-gfa-Ec 转化 E.coliglmS， 结果显示 gfa 缺失型大肠杆菌的转化子获得了在不添加葡萄糖胺的培养基上生长的能力， 证明一个 酵母 - 大肠杆菌共用型的非抗药基因筛选标记 Sp-gfa-Ec 已经构建成功。 0040 3. 新型穿梭载体 pGFA 的构建 0041 (1) 质粒 pREP3X 中酵母筛选标记的替换 0042 通用型穿梭载体 pREP3X 中的筛选标记基因是 leu， 适用于氨基酸 Leucine 。

24、营养缺 陷型酵母菌株， 但是在含有酵母粉或蛋白胨的培养基中无选择压力。我们为了以 gfa 筛选 标记替换 leu， 我们用引物 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 从质粒 pHsh-Sp-gfa-Ec 中扩增出 Sp-gfa-Ec ； 用引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16从穿梭载体pREP3X中扩增出删除了leu 的线性载体片段， 将其与 Sp-gfa-Ec 片段连接后， 获得穿梭载体 pRep-Sp-gfa-Ec。 0043 (2) 抗药基因 amp 的删除 0044 Sp-gfa-Ec 在大肠杆菌 E.coliglmS 中已经具备筛选标记基因的功能， 所。

25、以， 我 们除去质粒 pRep-Sp-gfa-Ec 中的筛选标记 amp， 建立无抗药基因穿梭载体 pGFA。用引物 SEQ ID NO.17 和 SEQ ID NO.18， 以质粒 pRep-Sp-gfa-Ec 为模板进行反向 PCR 扩增。对 PCR 产物进行磷酸化处理后， 用 T4 DNA 连接酶连接， 反应液转化 E.coliglmS 感受态细胞， 在 无抗生素的 LB 固体培养基平皿上培养转化子， 获得的质粒被命名为 pGFA-nmt。 0045 (3)nmt 启动子的替换 ： 0046 在穿梭载体 pGFA-nmt 中位于多克隆位点上游控制外源基因表达的启动子是裂殖 酵母 nmt 。

26、基因的启动子 ； nmt 启动子的启动转录功能受到酵母粉中的营养成分的抑制， 因 此， 本发明中将它替换为磷酸丙酮酸水合酶 eno 基因的启动子。根据 NCBI 数据库中 eno 基因信息 (SPBC1815.01)， 设计引物 SEQ ID NO.19 和 SEQ ID NO.20， 以酵母基因组 DNA 为 模板扩增 eno 基因启动子片段。同时， 以构建的质粒 pGFA-nmt 为模板， 设计引物为 SEQ ID NO.21 和 SEQ ID NO.22， 扩增载体片段。将得到的 eno 基因启动子片段和载体片段进行平 端连接后转化E.coli glmS。 获得的质粒为eno基因启动子替。

27、换nmt启动子后的质粒， 被 命名为 pGFA， 其分子大小为 7007bp( 图 1)， 序列见 SEQ ID NO.23。 0047 用 pGFA 转 化 大 肠 杆 菌 E.coliglmS 和 酵 母 S.pombe gfa1， 验 证 其 中 的 说 明 书 CN 103757048 A 6 5/5 页 7 Sp-gfa-Ec 在两种宿主中能否发挥筛选功能， 图 3 显示转化 pGFA 质粒的 gfa 缺失型菌株 E.coli glmS和S.pombegfa1均获得了正常生长的能力。 因此， 宿主菌株在不补充葡萄 糖胺的自然培养基的生长能力依赖于穿梭载体的存在， 换言之， pGFA 。

28、是一个无抗药基因而 稳定有效的生物安全性穿梭载体。 0048 4. 新型穿梭载体 pGFA 应用实例 ： 0049 实例 1. 用 pGFA 构建产生木聚糖酶的裂殖酵母 0050 为了检验构建的质粒 pGFA 的实用效果， 以本实验室之前构建的质粒 pREP-AGCX 为模板 (Wu H， et al.， 2010， Biotechnol Lett， 32 ： 795-801)， 设计引物 SEQ ID NO.24 和 SEQ ID NO.25， 得到分泌信号肽 cpy 和木聚糖酶 XynA 融合的片段序列， 并将个 PCR 片段割 胶回收和磷酸化处理。以 pGFA 为模板， 设计引物 SEQ。

29、 ID NO.26 和 SEQ ID NO.27， 扩增载 体序列。通过平端克隆方式将两片段连接到一起， 并转化 E.coliglmS， 得到的质粒命名 为 pGFA-CX。将质粒 pGFA-CX 转化 S.pombe gfa1 感受态细胞， 在 YES 培养基上筛选。挑 取裂殖酵母转化子到 EMM 液体培养基中培养， 培养 3 天后使用蛋白浓缩柱浓缩胞外分泌蛋 白， 并取相当于胞外培养液 1ml 的样品量进行 SDS-PAGE 电泳分析。木聚糖酶 XynA 的大小 为 23kD 左右， 结果如图 4 所示， 在转化 pGFA-CX 的酵母培养液中在 23kD 处有明显的目的蛋 白条带。 木聚。

30、糖酶活性的测定是以0.5燕麦木聚糖为底物， 利用对羟基苯甲酸酰肼与水解 反应产生的还原糖的显色反应进行比色， 410nm 下测定其吸收值 (Lever M， Anal Biochem， 1972， 47 ： 273-279.)。在 EMM 培养液中测得分泌表达的木聚糖酶活最高可达 30U/ml。 0051 实例 2. 用 pGFA 构建具有降低胆固醇能力的裂殖酵母 0052 根据 GeneBank 数据库中来源于 Streptomyces clavuligerus 的胆固醇氧化酶信 息 (NZ_CM000913.1) 设计引物 SEQ ID NO.28 和 SEQ ID NO.29 扩增胆固醇。

31、氧化酶基因片 段， 得到的 PCR 产物割胶并磷酸化处理。以 pGFA 为模板， 设计引物 SEQ ID NO.26 和 SEQ ID NO.27， 扩增载体序列片段。将载体序列与磷酸化的胆固醇氧化酶基因片段平端连接， 并电转化 E.coliglmS， 在无抗性 LB 培养基上筛选。挑转化子测序， 正向插入的质粒命名 为 pGFA-Clo。将质粒 pGFA-Clo 转化 S.pombe gfa1 感受态细胞， 在 YES 培养基上筛选转 化子。挑取转化子在 EMM 液体培养基中培养。收集培养的 5ml 酵母细胞， 在 5000rpm 离心 10min， 用 150l 的 PBS 缓冲液重悬细胞。

32、， 并加入 0.1mm 的酸洗玻璃珠震荡破碎酵母细胞。 将破碎的细胞混合液在12000rpm下高速离心以去除细胞残留， 取上清液进行酶活分析(季 文明， 陈毅力， 食品与生物技术， 2000， 19(3) ： 251-254)， 检测到明显酶活。 说 明 书 CN 103757048 A 7 1/12 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103757048 A 8 2/12 页 9 0003 序 列 表 CN 103757048 A 9 3/12 页 10 0004 序 列 表 CN 103757048 A 10 4/12 页 11 0005 序 列 表 CN 103757048 A。

33、 11 5/12 页 12 0006 序 列 表 CN 103757048 A 12 6/12 页 13 0007 序 列 表 CN 103757048 A 13 7/12 页 14 0008 序 列 表 CN 103757048 A 14 8/12 页 15 0009 序 列 表 CN 103757048 A 15 9/12 页 16 0010 序 列 表 CN 103757048 A 16 10/12 页 17 0011 序 列 表 CN 103757048 A 17 11/12 页 18 0012 序 列 表 CN 103757048 A 18 12/12 页 19 序 列 表 CN 103757048 A 19 1/2 页 20 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103757048 A 20 2/2 页 21 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103757048 A 21 。