水稻株高主效QTL qPH6位点的分子标记及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103820444 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103820444 A (21)申请号 201410114121.9 (22)申请日 2014.03.25 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 梁国华 袁媛 周勇 裔传灯 龚志云 杜佩娜 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 水稻株高主效QTL qPH6位点的分子标记及其 应用 (57) 摘要 本发明涉及水稻株高。

2、主效 QTL qPH6 位点的 分子标记及其应用。所述的分子标记是 S6-334 和S6-10 ； 这两个分子标记与qPH6位点紧密连锁， 可应用于鉴定和选育水稻矮秆品种。本发明所提 供的水稻株高主效 QTL 位点 qPH6 的分子标记方 法， 在国际上首次定位了位于第 6 染色体长臂上 来自于 Balilla 的控制株高的主效 QTL 新位点 qPH6， 并获得了紧密连锁的 InDel 标记 S6-334 和 S6-10。只需检测这些标记的扩增条带特性， 可以 判断株高主效位点 qPH6 的变异存在与否， 来预测 水稻的株高表型， 用于指导水稻株高改良的育种 工作。 (51)Int.Cl. 。

3、权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103820444 A CN 103820444 A 1/1 页 2 1. 一种水稻株高主效 QTL qPH6 位点的分子标记， 是 S6-334 和 S6-10 ； 其中， S6-334 所 对应的特异性引物序列如 SEQ ID No.1-2 所示 ； S6-10 所对应的特异性引物序列如 SEQ ID No.3-4 所示。 2.权利要求1所述水稻株高主效QTL qPH6位点的分子标记S6-3。

4、34和S6-10在水稻株 高选育、 鉴定和选育水稻矮秆品种的应用。 3. 一种鉴定和选育水稻矮秆品种的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） DNA 的提取 ： 取水稻幼嫩叶片， CTAB 法提取基因组 DNA ； （2） 标准 PCR 扩增体系的建立 ： 以 S6-334 和 S6-10 中的任意一对标记引物， 对待测水 稻全基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增 ； （3） 扩增 DNA 片段检测分析 ： PCR 产物经 3% 的琼脂糖凝胶电泳检测， 如果标记 S6-334 能扩增出 340bp 片段， 说明该单株基因型为 qph6， 如果能扩增出 346bp 片段， 说明该单株。

5、基 因型为qPH6， 如果扩增出杂合带型， 说明该单株基因型为qPH6qph6 ； 用分子标记S6-10扩增 出 257bp 片段， 说明该单株基因型为 qph6， 如果能扩增出 286bp 片段， 说明该单株基因型为 qPH6。如果扩增出杂合带型， 说明该单株基因型为 qPH6qph6。 权 利 要 求 书 CN 103820444 A 2 1/4 页 3 水稻株高主效 QTL qPH6 位点的分子标记及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子遗传育种学领域， 涉及水稻株高主效 QTL 位点的分子标记方法， 专用于水稻品种株高的分子标记辅助改良、 分子标记辅助的育种和种质资源的利用。 背景。

6、技术 0002 据统计， 全球以稻米为主食的人口约占 50%， 水稻也是我国最重要的粮食作物之 一， 提高水稻单产和总产量对于保障我国的粮食安全， 具有举足轻重的作用。 优良的株型是 超高产的骨架， 而株高是水稻重要的株型组成因子， 与产量和抗倒伏性密切相关。 株高超过 一定范围易倒伏而减产， 但株高过矮， 抗倒伏性有所提高， 但植株的生长量往往又不足。通 过比较不同学者提出的水稻高产模型的具体指标和参数也可以发现， 株高始终都是最重要 的指标之一。例如， 黄耀祥院士提出的 “半矮秆丛生快长超高产株型模式” 的株高要求为 80-90cm 左右 ； 袁隆平提出的籼型杂交稻超高产品种的株高为 10。

7、0cm， 其中秆长 70cm ； 周开 达提出的 “重穗型” 模式中的株高指标为 120cm ； 另外， 我国粳型超级稻株型设计中的株高 指标为 95 105cm。我国在 20 世纪 50 年代后期利用水稻矮秆基因率先育成高产抗倒品 种， 出现了第一次 “绿色革命” 。 在这一过程中， 新品种的选育主要是围绕着以利用矮秆基因 sd1为基础， 通过株型改良而进行的。 因此， 水稻株高基因的定位、 克隆及其遗传调控的分子 机理一直是研究的热点。 0003 至今， 已报道的水稻矮秆 ( 包括半矮秆 ) 突变体超过 80 个， 通过各种途径和方法， 鉴定出的水稻株高相关基因也超过 110 个。这些基因。

8、的分离有助于研究水稻株高调控的分 子机制， 但遗传效应一般为一因多效， 而且负效应很多， 除半矮秆基因 sd1 外， 其它位点水 稻育种中应用价值几乎为零。同一矮秆基因的过度利用潜伏着由遗传单一而带来的风险， 综合性状也很难得到超越。和质量性状位点相比， 水稻株高相关的 QTL 位点研究要缓慢得 多， 而且多集中于 QTL 分析阶段， 实现 QTL 精细定位的有 qCL1、 Qph1、 qPH3、 PH1 和 qPH7 等。 张启发院士领衔的科研小组通过图位克隆的策略分离到 2 个同时控制水稻株高、 抽穗期和 每穗粒数的 QTL， 命名为 Ghd7 和 Ghd8， 分别编码一个 CCT 结构域。

9、蛋白和 CCAAT-boxbinding 蛋白复合体的一个亚基。另外， qGP5-1 编码一个包含 ATPase 结构域的 Hsp70 蛋白， 通过控 制细胞分裂同时调控水稻的株高和每穗粒数。总的来说， 水 稻株高相关 QTL 位点精细定位 和克隆的数目太少， 极大地限制了水稻株型和高产分子育种的开展， 因此， 急需加强水稻株 高相关数量性状位点的分离工作。 0004 申请者研究期间构建了以粳稻 Balilla 为受体亲本、 籼稻 Dular 为供体亲本的回 交导入群体， 利用其和受体亲本杂交自交衍生的分离群体， 开展株高的 QTL 定位， 并对主效 QTL qPH6进行遗传行为分析。 进一步。

10、将基因定位在41kb的区域内， 并找到了两个与目的基 因紧密连锁的标记。 发明内容 0005 1、 要解决的技术问题 说 明 书 CN 103820444 A 3 2/4 页 4 0006 本发明的目的是提供水稻株高主效 QTL 位点的分子标记方法。通过检测与株高主 效基因位点连锁的分子标记， 可以确定有无控制株高的主效基因位点导入到育种品系中， 提高水稻株高和产量的目的性与有效性 ； 提高该性状的选择效率、 加快育种进度。 0007 2、 技术方案 0008 本发明的与水稻株高 QTL qPH6 紧密连锁的分子标记， 即水稻株高主效基因位点 qPH6 的分子标记是 S6-334 和 S6-1。

11、0， 其对应的引物如表 1 ： 0009 表 1 0010 0011 本发明还提供了与水稻株高QTL qPH6紧密连锁的分子标记在水稻株高选育、 鉴定 和选育水稻矮秆品种中的应用。 0012 本发明还公开了一种鉴定和选育水稻矮秆品种的方法， 包括步骤如下 ： 0013 （1） DNA 的提取 ： 取水稻幼嫩叶片， CTAB 法提取基因组 DNA。 0014 （2） 标准 PCR 扩增体系的建立 ： 以表 1 中的任意一对标记， 对待测水稻全基因组 DNA 为模板， PCR 扩增。 0015 （3） 扩增 DNA 片段检测分析 ： PCR 产物经 3% 的琼脂糖凝胶电泳检测， 如 果标记 S6-。

12、334 能扩增出 340bp 片段， 说明该单株基因型为 qph6， 如果能扩增出 346bp 片段， 说明 该单株基因型为 qPH6， 如果扩增出杂合带型， 说明该单株基因型为 qPH6qph6 ； 用分子标记 S6-10 扩增出 257bp 片段， 说明该单株基因型为 qph6， 如果能扩增出 286bp 片段， 说明该单 株基因型为 qPH6。如果扩增出杂合带型， 说明该单株基因型为 qPH6qph6。 0016 该基因位点位于水稻基因组第 6 染色体长臂的分子标记 S6-334 和 S6-10 之间 的区域内。本发明在对 Balilla 携带优良性状进行遗传解析的过程中， 从 Bali。

13、lla 和 Dular 为亲本的高世代回交导入群体中筛选出一个株高比受体亲本巴利拉显著增加的株系 (C33084)。利用 C33084 与 Balilla 杂交， 利用衍生的 F2分离群体将 qPH6 初步定位在分子 标记 S6-7 和 S6-10 之间。接着扩大分离群体 （F4） 利用 1264 个隐性矮秆单株将其定位在 S6-334和S6-10之间 （图4） 。 S6-334和S6-10均有两个交换株， 交换率为99.9%。 根据NCBI Primer-Blast 的结果， S6-334 和 S6-10 之间在粳稻品种日本晴上物理距离为 41-kb。与水 稻株高 QTL qPH6 之间的遗。

14、传距离均在 1cM 以下， 可用于分子标记辅助选择育种。 0017 筛选上述标记的过程如下 ： 0018 （1） 本实验构建了以 Balilla 为受体亲本， Dular 为供体亲本的回交导入群体， 在 BC4F4世代发现了一个与轮回亲本 Balilla 存在显著差异的株系 C33084， Balilla 的平 均株高为 87.85cm， 而株系 C33084 的平均株高为 115.34cm， 比 Balilla 高约 31.3%( 图 1)。 说 明 书 CN 103820444 A 4 3/4 页 5 C33084 与 Balilla 杂交， 利用衍生分离群体进行基因的定位， 2010 年。

15、扬州夏季， 对 179 个 F2 单株进行遗传分析显示， 高秆与矮秆分离比符合3:1的分离比(2=0.53820.05,1=3.84) 说明该基因受单个孟德尔因子控制， 且高杆对矮秆为显性。后续的定位工作表明基因位于 水稻第 6 染色体上， 将其命名为 qPH6。 0019 （2） 根据网上公布的 400 个 SSR 标记， 对 Balilla 和 Dular 基因组 DNA 进行多态 性筛选， 共筛选到 93 个多态性标记。利用这些多态标记对 F2群体的高杆基因池和矮秆基 因池进行分析， 结果有 5 对 SSR 标记在两个基因池间呈现多态性。随后利用上述 5 对可能 与目标基因连锁的标记分别。

16、对 F2群体的部分高杆和矮秆单株进一步进行群体检测， 将基因 定位在 RM6395 和 S6-20 之间。我们继续在初步定位的目标区域设计新的 InDel 标记。根 据网上公布的日本晴和93-11的基因组序列比对差异， 设计InDel标记引物， 在双亲间进行 多态性分析， PCR 反应体系和反应程序同上述的 PCR 扩增体系， 获得 5 对多态性标记。利用 F2群体中 527 个隐性单株 将基因定位在 S6-7 和 S6-10 之间， 接着扩大分离群体 （F4） 利用 1264 个隐性矮秆单株将其定位在 S6-334 和 S6-10 之间 （图 4） 。 0020 本发明首次发现了与水稻株高主。

17、效QTL qPH6紧密连锁的分子标记， 通过检测与株 高主效基因位点连锁的分子标记， 可以确定有无控制株高的主效基因位点导入到育种品系 中， 借助分子标记辅助选择技术可以有目的的筛选不同株型水稻， 提高该性状的选择效率、 加快育种进度。 0021 3、 有益效果 0022 本发明所提供的水稻株高主效QTL位点qPH6的分子标记方法， 在国际上首次定位 了位于第 6 染色体长臂上来自于 Dular 的控制株高的主效 QTL 新位点 qPH6， 并获得了紧密 连锁的 InDel 标记 S6-334 和 S6-10。只需检测这些标记的扩增条带特性， 可以判断株高主 效位点 qPH6 的增效变异存在与。

18、否， 来预测水稻的株高表型， 用于指导水稻株高改良的育种 工作。分子标记不仅在苗期就能区分水稻品种的基因型， 而且能够方便、 快捷、 直接地实现 了目标基因在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定， 极大的降低了劳动成本、 节约时间且 不受环境及人为因素的影响。 附图说明 0023 图 1 ： Balilla 与 C33084 的表型图。A 为实物照片， B 为柱形图。 0024 图 2 ： 为 2010 年扬州 F2群体中株高分布图。结果表明株高的分布呈连续性分布， 证明群体中株高属于数量性状。 0025 图 3 ： 分子标记引物 （S6-334 和 S6-10） 对 F2代单株扩增的部分结果。泳。

19、道 1-10 为 F2代中株株型高的单株的 PCR 扩增产物 ； 泳道 11-20 为 F2代中株株型矮的单株的 PCR 扩 增产物。 0026 图 4 ： 水稻株高主效 QTL 位点 qPH6 的定位分析过程， 其中 qPH6 定位于 InDel 标记 S6-334 和 S6-10 之间的 41-kb 的区域。 具体实施方式 0027 下述实施例中涉及的水稻品种 Balilla 为常规粳稻品种， Dular 为常规籼稻品种 均可从市场购得。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 说 明 书 CN 103820444 A 5 4/4 页 6 0028 实施例 1 与水稻株高主效基因 q。

20、PH6 紧密连锁的分子标记的获得及应用 0029 （一） 定位群体与试验方法 0030 1. 本实验构建了以 Balilla 为受体亲本， Dular 为供体亲本的回交导入群体， 在 BC4F4世代发现了一个与轮回亲本 Balilla 存在显著差异的株系 C33084， 与 Balilla 杂交， 利用衍生的 F2进行性状调查与基因的初步定位。获得初步定位结果后， 利用连锁分子标记 从高秆单株中筛选杂合基因型单株， 单株收获种植， 进一步获得大的定位群体 F4。 0031 2.DNA 提取与 PCR 扩增 ： 单株取幼嫩叶片， 用 CTAB 法提取个体 DNA。PCR 反 应 ： 10buff。

21、er2.5L(Tris-HCl10mmol/L， PH8.3， KCl50mmol/L， 明胶 0.001%)、 1.5mM MgCl22.5L、 引物对 （4pmol/L） 2.5L、 2.5mM dNTPs2L、 Taq 酶 （5U/L） 0.2L、 模板 DNA20ng， 加水至 25L。PCR 反应程序为 ： 95预变性 5 分钟后， (95变性 30 秒 ,53退 火 30 秒 ,72延伸 30 秒 ) 循环 35 次 , 最后 72延伸 10 分钟。在 PCR 仪上进行 PCR 扩 增， 扩增产物在 3% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。 0032 （二） 分子标记获得与开发 0033 。

22、根据网上公布的均匀分布于水稻 12 条染色体上的 400 对 SSR 标记， 对 Balilla 和 Dular 进行多态性筛选， 获得有多态性的 93 对标记。利用这些多态标记对 F2群体的高杆 基因池和矮秆基因池进行分析， 结果有 5 对 SSR 标记在两个基因池间呈现多态性。随后利 用上述 5 对标记分别对 F2群体的部分高杆和矮秆单株进一步进行群体检测， 将基因定位在 RM6395 和 S6-20 之间。在目标区域设计新的 InDel 标记。根据网上公布的日本晴和 93-11 的基因组序列比对差异， 设计 InDel 标记引物， 在双亲间进行多态性分析， PCR 反应体系和 反应程序同。

23、上述的 PCR 扩增体系， 获得 5 对多态性标记， 用于基因的精细定位。 0034 （三） 定位结果 0035 2010 年利用 F2群体中 527 个矮秆隐性单株进行基因的初步定位， 将基因定位在 S6-7与S6-10之间， 分别有1个交换株。 通过分子标记检测， 筛选目的区域杂合的单株收获 种植， 扩大定位群体。利用加密的分子标记分析 F4群体中 1264 株隐性单株， 结果表明在标 记 S6-334 和 S6-10 处分别有 2 个交换株， 交换率均为 0.16%。 0036 （四） 结果与分析 0037 在定位的过程中， 以标记 S6-7 与 S6-10 筛选了 50 个杂合单株构建。

24、 F4定位群体， 杂合单株分单株收获种植， 每个株系均出现了株高分离， 其筛选准确率达到 100%。 0038 通过检测与株高主效基因位点连锁的分子标记， 可以确定有无控制株高的主效基 因位点导入到育种品系中， 提高了水稻株高改良的目的性与有效性， 提高了该品种的选择 效率、 加快育种进度。 利用与qPH6紧密连锁的进行单标记选择， 选择效率可达99.84%， 双标 记选择准确率高达 100%。 0039 本发明的亲本 Balilla 与 Dular 为已知共用多年的品种， 可以自由获取。本发明 在实施时并不局限于以上案例的 2 个亲本， 而可以是现有的任何品种。 说 明 书 CN 103820444 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103820444 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 103820444 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103820444 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103820444 A 10 。