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1、(10)申请公布号 CN 103725771 A (43)申请公布日 2014.04.16 CN 103725771 A (21)申请号 201310352410.8 (22)申请日 2013.08.13 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 无锡中德伯尔生物技术有限公司 地址 214174 江苏省无锡市惠山区堰新路 311 号 5 号楼 (72)发明人 李林 杨晓慧 许恒毅 徐波 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和 不产呕吐毒素蜡样芽。
2、孢杆菌试剂盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明属于微生物检测领域， 公开了一种快 速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒 素蜡样芽孢杆菌的方法。针对蜡样芽孢杆菌编码 呕吐毒素的cesB和蜡样芽孢杆菌的16SrRNA设计 特异性引物， 采用叠氮溴化丙锭 （PMA） 消除食品 中蜡样芽孢杆菌死菌的干扰， 沸水浴方法提取食 品中活菌 DNA， 进行多重 PCR 检测。添加非竞争性 的扩增内标 （IAC） 指示 PCR 体系中可能存在的假 阴性结果。本方法避免分子生物学方法检测常有 的假阴性和假阳性结果干扰， 使检测结果更加准 确， 同时本方法与传统培养方法相比， 检测时间更 短。 (51)In。
3、t.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103725771 A CN 103725771 A 1/1 页 2 1. 一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试 剂盒， 其特征在于含有引物分别为 ： 从 5 -3 为 cesB-F: ACCCATCTTGCGTCATT cesB-R: CAGCCAAGTGAAGAATACC 16S-F: GCGGCGTGCCTAATACATGC 16S-R: CT。
4、CAGGTCGGCTACGCATCG IAC-F: CCTACGGGAGGCAGCAGT IAC-R: CGTTTACGGCGTGGACTAC 。 2. 根据权利要求 1 所述的一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕 吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒， 其特征在于还含有叠氮溴化丙锭 PMA， PBS 磷酸盐缓冲液， Taqmix。 3.根据权利要求1或2所述的一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕 吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒的检测方法， 其特征在于包含下列步骤 ： （1） 取食物样本， 以按质量体积比 1: 9 加无菌缓冲液， 充分混匀， 离心， 取上清得菌悬 液 ； （2） 取制。
5、备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液， 使叠氮溴化丙锭 PMA 的终质量浓度为 5 g/mL， 混匀后室温避光 5 min， 每隔 30 s 摇匀一次， 曝光， 光照交联时样品置于冰上， 交联 后的悬浮液离心， 所得沉淀用沸水浴法提取 DNA ； （3） 所得 DNA 进行 mPCR， 体系包含总共 20 L 反应液， 其中， 3 L 制备的模板 DNA 溶 液， 10 L 2 Taqmix，cesB引物的浓度是0.4 M，16S rRNA引物的浓度是0.1 M， 扩增 内标的浓度为 0.25 M; 反应条件是 ： 95 10 min， 接着 40 个循环 （94 30 s， 51 30 s， 72。
6、 30 s） ， 最后 72 延伸 10 min ； （4） mPCR 反应结束后， 进行目的菌检测分析。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于步骤 （1） 所述的缓冲液为 PBS 磷酸盐缓冲液。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 （4） 所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝 胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有 475 bp 条带， 则指示反应体系正常 ； 若没有出现 475 bp 条 带， 则反应体系有 PCR 抑制剂或者 PCR 操作出现错误， 需要重新进行 PCR ； 扩增产物有 475 bp 条带的前提下， 若有 267 bp 条带和 154 bp 条带， 则说。
7、明有产呕吐 毒素蜡样芽孢杆菌 ； 若仅有 267 bp 条带， 则说明有不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌。 权 利 要 求 书 CN 103725771 A 2 1/6 页 3 同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素 蜡样芽孢杆菌试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明属于微生物检测领域， 尤其涉及一种快速同时检测食品中产呕吐毒素和不 产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌活菌的方法。 技术背景 0002 蜡样芽孢杆菌是一种能产芽孢的革兰氏阳性菌， 广泛分布于空气、 污水和各类生 熟食品中。目前， 从多种食品中分离出该菌， 包括炒米饭、 肉类、 乳类和鱼等， 是常见的食源 性致病菌， 极有可能危害人。
8、们的健康。在我国蜡样芽孢杆菌引起的中毒事件比较严重， 在 1993 2003 十年间， 蜡样芽孢杆菌中毒者高达 1758 人。蜡样芽孢杆菌引起的中毒症状主 要有呕吐和腹泻， 由肠毒素引起腹泻的食源性疾病研究较多， 检测方法比较成熟并已经商 业化， 然而关于蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的研究相对较少， 但是呕吐型蜡样芽孢杆菌引发的 食物中毒， 尤其是米饭类的中毒事件时有发生。 在美国， 食用炒米饭发生中毒的主要原因是 其中污染了产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌。目前， 蜡样芽孢杆菌已被挪威和荷兰认定为食品 中最容易检出的病源微生物。蜡样芽孢杆菌主要造成食物和饮水不卫生的人群中毒， 其中 使用受污染的食物是造成蜡。
9、样芽孢杆菌感染的主要途径。 0003 目前检测蜡样芽孢杆菌的方法主要是通过传统的培养方法。传统 方法具有劳动 强度高、 耗时、 费用高等缺点， 且特异性差， 易造成大量错误识别。因此快速、 准确地检测蜡 样芽孢杆菌的方法至关重要。 0004 蜡样芽孢杆菌的 cesB 是呕吐毒素合成酶结构基因的一个亚基， 能够编码蜡样芽 孢杆菌的呕吐毒素。本发明采用 cesB 作为靶基因设计引物进行检测， 特异性强， 能用于对 蜡样芽孢杆菌进行准确检测。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种能消除假阴性和假阳性且能同时检测产呕吐毒素和 不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的方法。 该方法可用于食品样本中活的产呕吐毒。
10、素和不产呕吐 毒素蜡样芽孢杆菌的初筛检测， 其操作快速、 结果客观准确， 避免了现有方法操作繁琐、 费 时费力和成本高昂的缺点。 0006 本发明是通过以下技术方案实现的。 0007 一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的 试剂盒， 其特征在于含有引物分别为 ： 从 5 -3 为 0008 cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT 0009 cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC 0010 16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC 0011 16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG 0012 IAC-F:CCTACGG。
11、GAGGCAGCAGT 说 明 书 CN 103725771 A 3 2/6 页 4 0013 IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。 0014 所述的试剂盒还含有叠氮溴化丙锭 PMA， PBS 磷酸盐缓冲液， Taq mix。 0015 本发明涉及一种叠氮溴化丙锭处理结合多重 PCR 快速同时检测食品中活的产呕 吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒的检测方法， 包括如下步骤 ： 0016 （1） 取食物样本， 按质量体积比 1:9 加 PBS 缓冲液， 充分混匀， 离心， 取上清得菌悬 液 ； 0017 （2） 取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液， 使 PMA 的终质量浓度为。
12、 5g/mL， 混 匀后室温避光培养， 卤素灯曝光， 光照交联时样品置于冰上， 交联后的悬浮液离心， 所得沉 淀用沸水浴法提取 DNA ； 0018 （3） 所得 DNA 进行 mPCR， 体系包含总共 20L 反应液， 其中， 3L 制备的模板 DNA 溶液， 10L2Taq mix， cesB 引物的浓度是 0.4M， 16S rRNA 引物的浓度是 0.1M， 扩 增内标的浓度为 0.25M ； 反应条件是 ： 95 10min， 接着 40 个循环 （94 30s， 51 30s， 72 30s） ， 最后 72延伸 10min ； 0019 （4） mPCR 反应结束后， 进行目的菌。
13、检测分析。 0020 步骤 （1） 所述的缓冲液为 PBS 磷酸盐缓冲液。 0021 步骤 （3） 所述引物分别为 ： 从 5 -3 为 0022 cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT 0023 cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC 0024 16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC 0025 16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG 0026 IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT 0027 IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC 0028 步骤 （4） 所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若。
14、有 475bp 条带， 则指示反应体系正常 ； 若没有出现 475bp 条带， 则反应体系有 PCR 抑制剂或者 PCR 操 作出现错误， 需要重新进行PCR。 扩增产物有475bp条带的前提下， 若有267bp条带和154bp 条带， 则说明有产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌 ； 若仅有 267bp 条带， 则说明有不产呕吐毒素蜡样 芽孢杆菌。 0029 与现有技术相比， 本发明有如下有益效果 ： 0030 针对蜡样芽孢杆菌编码呕吐毒素的cesB和蜡样芽孢杆菌的16S rRNA设计特异性 引物， 采用叠氮溴化丙锭 （PMA） 消除食品中蜡样芽孢杆菌死菌的干扰， 沸水浴方法提取食品 中活菌 DNA， 进。
15、行多重 PCR 检测。添加非竞争性的扩增内标 （IAC） 指示 PCR 体系中可能存在 的假阴性结果。本方法避免分子生物学方法检测常有的假阴性和假阳性结果干扰， 使检测 结果更加准确， 同时本方法与传统培养方法相比， 检测时间更短。具体如下 ： 0031 1、 能同时检测产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌， 速度快， 可以在 4 小时 内得到结果。 0032 2、 只检测活菌， 消除假阳性结果， 效率更高。 0033 3、 能消除由于食品基质等原因造成的假阴性结果。 0034 4、 本发明涉及的特异性引物， 灵敏度高， 高效地检测目的菌， 操作简便， 结果判定 简单， 降低了检测成本。 说 。
16、明 书 CN 103725771 A 4 3/6 页 5 附图说明 0035 图 1 多重 PCR 检测 PMA 处理过的死的产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌 （编号 JDZ102Y） 电泳结果。M ： DL2000DNA Marker ； 泳道为 PMA 未处理的死菌扩增条带， 死菌浓度为 4.0106 4.0102CFU/mL ； 1 6 泳道为 PMA 处理死菌后的扩增情况。 0036 图 2 多重 PCR 检测 PMA 处理过的活的产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌电泳结果。M ： DL2000DNA Marker ； 泳道为 PMA 未处理的活菌扩增条带， 活菌浓度为 7.5107 7.5100CFU/m。
17、L ； 1 8 泳道为 PMA 处理活菌后的扩增情况， 和 9 泳道为阴性对照。 0037 图 3 多重 PCR 检测污染食品中产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌 （编 号 NC0084LY）并获取 PMA 处理后的检测限。蜡样芽孢杆菌污染面条、 米饭和香肠浓度 为 4.3106 4.3100CFU/g ； 产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌污染的浓度为 3.6106 3.6100CFU/g。 0038 图4多重PCR检测污染食品中杂菌存在条件下的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样 芽孢杆菌。面条、 米饭和香肠中杂菌 （金黄色葡萄球菌 PSAV021、 沙门氏菌 ATCC） 的浓度为 1.0105CFU/g，。
18、 蜡样芽孢杆菌的浓度为 103CFU/g。泳道 1 和为面条样品， 泳道 2 和为 米饭样品， 泳道 3 和为香肠样品。 具体实施方式 0039 下面结合具体实施例， 进一步阐释本发明， 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法， 通常按照常规条 件中的条件， 按照制造厂商的 建议条件， 实施例中涉及的菌株均属于现有技术， 本领域的 技术人员可很容易地从公开商业渠道获得。 0040 实施例 1 0041 一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的 试剂盒， 其特征在于含有引物分别为 ： 从 5 -3 为 00。
19、42 cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT 0043 cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC 0044 16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC 0045 16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG 0046 IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT 0047 IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。 0048 所述的试剂盒还含有叠氮溴化丙锭 PMA（购于美国 Biotium 公司） ， PBS 磷酸盐缓 冲液， Taq mix（购于日本 TaKaRa 公司） 。 0049 具体检测方法如下 ： 0050 步骤 1， 食物样本。
20、预处理 0051 称取1g的食物样本， 加入9mL的PBS， 充分混匀， 900g离心5min， 取上清 （该过程必 须无菌操作） 。 0052 步骤 2， PMA 处理 0053 1g PMA 溶解于 1mL 二甲亚砜 (DMSO) 中， 配制成 1mg/mL 的 PMA 溶液， -20避光保 说 明 书 CN 103725771 A 5 4/6 页 6 存。取 400L 步骤 1 上清液置于 1.5mL 微量离心管中， 加入 2L1mg/mL 的 PMA 溶液， 使 PMA的终质量浓度为5g/mL ； PMA与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5 min， 利用 500W的卤素灯曝光5m。
21、in， 光照交联时样品置于冰上(避免过热)， 且在距光源20cm处， 交联 后的悬浮液于 9000g 离心 5min， 所得沉淀用于 DNA 的提取。 0054 步骤 3， 基因组 DNA 的提取 0055 经步骤 2 获得的样品以 9000g， 4离心 5min， 弃上清， 并小心吸走残余液体， 加入 30L 无菌的去离子水 100煮沸 10min， 待冷却后 12000g， 4条件下离心 5min， 取上清作 为 mPCR 反应模板， 制备的模板应立即用于 PCR 检测。 0056 步骤 4， 选取靶点及设计引物 0057 多重 PCR 之所以难做， 问题的关键是多个靶点扩增条件不兼容。每。
22、个靶点都需要 两边的引物同时配合。因此， 本发明分别选取产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌特 异性基因， 采用Oligo7软件设计多重PCR引物， 调整各对引物之间的退火温度， 并调节引物 对之间的扩增配合程度， 使各对引物的退火温度尽量一致， 扩增速度尽量相等。 并通过实验 来用产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌作模板来验证多重 PCR 的扩增效果， 选取条件最优的引物对 来作为下面检测用引物。并采表 1 提供的菌株进行引物特异性验证， 菌株的编号和来源见 表 1。 0058 表 1 供试菌株及检测结果 0059 说 明 书 CN 103725771 A 6 5/6 页 7 0060 a JX-CDC。
23、, 江西省疾病预防与控制中心， 中国 ； 0061 b NCTC, 国家典型菌种保藏中心， 英国 ； 0062 c ATCC, 美国典型菌种保藏中心， 美国 ； 0063 d CMCC, 中国药物菌种保藏中心， 中国。 0064 步骤 5， mPCR 反应体系及反应参数 0065 本多重 PCR 体系包含总共 20L 反应液， 其中， 3L 制备的模板 DNA 溶液， 10L2Taq mix， cesB引物的浓度是0.4M， 16S rRNA引物的浓度是0.1M， 扩增内标的 浓度为 0.25M ； 反应条件是 ： 95 10min， 接着 40 个循环 （94 30s， 51 30s， 72。
24、 30s） ， 最后 72延伸 10min ； 0066 其中引物分别为 ： 从 5 -3 为 0067 cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT 说 明 书 CN 103725771 A 7 6/6 页 8 0068 cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC 0069 16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC 0070 16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG 0071 IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT 0072 IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。 0073 步骤 6， mPCR 扩增结果检测 0074 mPCR 。
25、反应结束后， 用枪头吸取 5L 反应液， 加到 2% 琼脂糖凝胶的上样孔里， 85V 电泳 30min， 取出凝胶块， 在紫外成像系统中观察电泳条带， 并拍照记录。确定样品中是否 有目的菌的具体标准为 ： 用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果， 若有 475bp 条带， 则指示反 应体系正常,可以通过其它条带判定是否有目的菌 ； 若没有出现475bp条带， 则反应体系有 PCR 抑制剂或者 PCR 操作出现错误， 需要重新进行 PCR。扩增产物有 475bp 条带的前提下， 若有267bp条带和154bp条带， 则说明有产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌 ； 若仅有267bp条带， 则 说明有不产呕吐毒。
26、素蜡样芽孢杆菌。 0075 结果讨论 0076 传统检测方法操作繁琐、 周期长和特异性不强， 而 PCR 技术被认为是蜡样芽孢杆 菌检测最准确的方法。本发明利用 PCR 技术结合 PMA 消除死菌对检测的影响， 有效检测了 活的蜡样芽孢杆菌 ； 同时， 本发明在 PCR 体系中添加的一对非竞争性扩增内标有效地消除 扩增过程中的抑制因子以及操作失误等造成的影响。因此， 本发明首次利用特异性的引物 能对蜡样芽孢杆菌进行检测， 且能同时消除假阴性和假阳性的结果， 检测结果特异性强、 灵 敏度高。 说 明 书 CN 103725771 A 8 1/2 页 9 SEQUENCE LISTING 无锡中德。
27、伯尔生物技术有限公司 一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌 试剂盒及其检测方 6 PatentIn version 3.3 1 17 DNA cesB-F 1 acccatcttg cgtcatt 17 2 19 DNA cesB-R 2 cagccaagtg aagaatacc 19 3 20 DNA 16S-F 3 gcggcgtgcc taatacatgc 20 序 列 表 CN 103725771 A 9 2/2 页 10 4 20 DNA 16S-R 4 ctcaggtcgg ctacgcatcg 20 5 18 DNA IAC-F 5 cctacgggag gcagcagt 18 6 19 DNA IAC-R 6 cgtttacggc gtggactac 19 序 列 表 CN 103725771 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103725771 A 11 2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103725771 A 12 。