技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌。
背景技术
杨梅果酒是以杨梅为原料，采用发酵法酿造而成的低度饮料酒。杨梅果酒迎合了消费多样化的需求，具有浓郁醇厚的风味和杨梅特有的果香味，其营养丰富，有益气调中等保健作用，是一种深受欢迎的保健果酒，市场前景广阔。
果酒发酵可以采用自然发酵，也可采用纯种发酵。由于自然发酵是将水果破碎后，不另添加酵母，任其自然发酵，存在许多弊端。为了提高果酒的品质，通常采用纯种发酵，即加入纯粹培养的发酵性能强的果酒酵母。果酒酵母能将果汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良的果酒酵母可以获得很高的发酵度，对乙醇和二氧化硫的抵抗力大，容易长期储存。酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大，要获得优良的果酒酵母，必须对其进行分离筛选。
在果酒生产过程中，发酵酵母对果酒的质量起着决定性的作用。水果种类繁多，不同水果之间的营养成分组成差别很大，导致每种果酒的发酵条件都不一样。同一种水果原料，采用不同的酵母菌种进行发酵，所产生的酒的品质和风味等方面都有一定的差异。目前，我国的果酒生产大多都采用商业化的活性干酵母粉(ADY)，它们主要是针对葡萄酒的生产应用而开发，有较强产酒精能力，但其发酵的果酒风味比较平淡、缺乏应有的原料水果的香气，针对性不强，不能满足不同水果品种的需求，开发适合不同种类水果的专用酿酒酵母是提高果酒酒体风味的重要途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种专用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌（Saccharomyces Cerevisiae）GYM-17。
本发明一种用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌，其特征在于该菌株是一株分离于湖北省来凤县古杨梅果园土壤，用于发酵杨梅果酒的酿酒酵母，对杨梅果酒发酵有较强的针对性，具有良好产酒和产香能力，起酵速度快，发酵能力强，耐受性好；已于2013年3月27日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2013107，命名为GYM-17；
本发明一种用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌在制备杨梅果酒中的应用。
本发明一种用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌在制备杨梅果酒中的应用，其特征在于所述的酿酒酵母菌GYM-17在杨梅汁中起酵快，最低生长温度为10℃，最高生长温度为38℃，最适生长温度为28℃；最适生长pH范围为3.0～4.2，耐酒精能力达15%。
本发明一种用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌在制备杨梅果酒中的应用，其特征在于所述的酿酒酵母GYM-17专用于杨梅果酒发酵，生产杨梅果酒的原料为杨梅果汁或浆，接种量为杨梅汁或浆体积的4%-10%的体积比，发酵温度为20-30℃，发酵时间为4-7天。所酿果酒杨梅果香明显，香味协调，酒香醇厚，典型性突出，能反映杨梅水果自身的特点，适合生产高品质杨梅果酒。
本发明所述酿酒酵母菌株GYM-17的培养特征为：YEPD琼脂培养基28℃培养3d，菌落呈圆形，凸起，乳白色，表面光滑，易挑，正反面颜色一致。菌落大小为（0.3-0.35）cm×（0.3-0.35）cm，生长速度快；400倍显微镜下观察细胞为卵圆形，出芽生殖，产子囊孢子，细胞大小为（2.0-2.5）μm。
本发明所述酿酒酵母菌株GYM-17在麦芽汁琼脂培养基和YEPD琼脂培养基28℃培养3d，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：本发明提供的酿酒酵母GYM-17是一株从与杨梅生长环境密切相关的杨梅果园土壤中分离筛选得到，对杨梅果酒发酵有较强的针对性，从而提高了酒体香气风味；该菌株能够以杨梅果汁为基质发酵成杨梅果酒，且具有起酵速度快，发酵能力强，耐受性好，所酿的果酒果香明显，香味协调，典型性突出，适合生产高品质杨梅果酒。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
本发明公开了一种专用于杨梅果酒发酵生产的酿酒酵母菌（Saccharomyces Cerevisiae）GYM-17；该菌株是一株分离于湖北省来凤县古杨梅果园土壤，专用于发酵杨梅果酒的酿酒酵母，具有良好产酒和产香能力，起酵速度快，发酵能力强，耐受性好；已于2013年3月27日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2013107；本发明的菌株对杨梅果酒发酵有较强的针对性，从而提高了酒体香气风味；该微生物能够以杨梅果汁为基质发酵成杨梅果酒，且所酿的果酒果香明显，香味协调，典型性突出，适合于高品质杨梅果酒的生产。
本发明中菌株筛选和性能测定中所用培养基为：
（1）活化培养基：完全培养基（琼脂2％蔗糖2％酵母1％蛋白胨1％，自然pH）。（2）增殖培养基：将成熟杨梅榨汁装入无菌三角瓶中，按30μg/ml和100单位/ml添加链霉素，青霉素，加入95%的食用乙醇使培养基酒精含量达到4%（v/v），用柠檬酸调节pH值到3.2～3.8之间。（3）分离平板培养基：完全培养基（琼脂2％蔗糖2％酵母1％蛋白胨1％，自然pH）。（4）种子培养基：杨梅汁（一般可溶固性物含量TSS为7%～9%），加蔗糖调TSS为15%，调pH值为3.2～3.8，于115℃、15min蒸汽灭菌备用。（5）发酵培养基：杨梅汁（一般可溶固性物含量TSS为7%～9%），加蔗糖调TSS为15%，调pH值为3.2～ 3.8，添加有效量为50%的K2S2O5使SO2含量为100mg/L，于115℃、15min蒸汽灭菌备用。（6）酵母菌性能测定培养基：完全液体培养基（蔗糖2％，酵母1％，蛋白胨1％，自然pH）。
本发明中菌株的筛选过程为：
（1）取分离源距地表15cm～20cm湿土壤1g，加入到增殖培养基中，在磁力搅拌器上混匀。添加链霉素，青霉素，加入95%乙醇使杨梅汁中的酒度达到4%，调节pH值，28℃让其自然发酵直至终了。（2）将增殖发酵液适当稀释后，在完全平板培养基上进行梯度稀释分离。倒置于28℃恒温培养箱中培养，待培养基表面长出单菌落，再根据其颜色、透明度、直径大小、厚薄程度、生长快慢，挑选典型菌落，接入试管培养基斜面，待长出后进行镜检确定是否为酵母，观察菌落特征、编号命名。（3）试管发酵初筛：将杨梅汁调糖，调酸后分装于无菌大试管，接入分离得到的纯种酵母菌，置于室温中发酵。观察起始发酵时间、发酵速率，每隔12hr观察产起泡状况、凝聚性等，培养5天后，品评风味。根据试验结果，初步筛选出产酒精能力较强和产香较好的酵母菌3株。（4）三角瓶发酵复筛：将发酵培养基分装入三角瓶中，蒸汽灭菌后。将初筛得到的菌株及对照菌株DV10接入种子培养基中，于28℃，115r/min的摇床上培养20小时后，接入三角瓶发酵培养基中，于室温下发酵，每隔48hr测发酵液液酒精度，固形物含量，停止发酵后进行风味品评。综合对照酵母的发酵情况，选出发酵性能最好、产香较好的一株酵母菌GYM-17，经鉴定为酿酒酵母。（5）形态特征观察：采用水浸法，在显微镜下观察选育酵母的外形、出芽情况、大小。菌落形态观察：采用平板稀释分离法，将选育酵母制成10-4、10-5、10-6三种稀释浓度的平板培养基，28℃恒温培养3天，观察菌落特征。酿酒酵母菌株GYM-17的培养特征如下：YEPD琼脂培养基28℃培养3d，菌落呈圆形，凸起，乳白色，表面光滑，易挑，正反面颜色一致。菌落大小为（0.3-0.35）cm×（0.3-0.35）cm，生长速度快；400倍显微镜下观察细胞为卵圆形，出芽生殖，产子囊孢子，细胞大小为 （2.0-2.5）μm。（6）GYM-17菌株的在麦芽汁琼脂培养基和YEPD琼脂培养基28℃培养3d，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
本发明所述的酿酒酵母菌株GYM-17性能测定方法为：
（1）最适生长温度测定：将GYM-17菌株接入完全培养基中，分别在24℃～40℃的不同温度下恒温培养10小时，于660nm定培养液的OD值大小，确定其最适生长温度。（2）温度耐性测定：将GYM-17菌株接入完全培养基中，分别于低温和高温培养10天，观察有无菌体生长。（3）最适生长pH值测定：将GYM-17菌株接入不同pH值的完全培养基中于最适生长温度恒温培养10小时，在660nm下测定OD值，依据OD值大小确定其最适pH。（4）耐酸、碱能力测定：将完全培养基按设定pH分别加入柠檬酸或NaOH调匀后接入GYM-17菌株，在最适温度下培养7天，检查是否有菌体生长。（5）耐酒精能力测定：将完全培养基按设定的浓度分别加入95％乙醇，摇匀后接入GYM-17菌株，28℃恒温培养一周，检查是否有菌体生长。（6）生长曲线测定：将GYM-17菌株接入完全培养基中。以GYM-17菌株的最适pH、最适生长温度在150r/min的摇床上振荡培养，每隔4小时取培养液在660nm下测定OD值。
本发明所述的酿酒酵母菌株GYM-17性能测定结果为：
（1）在杨梅汁发酵中发酵能力强、产酒度高、残糖低、产香好，可以作为独立发酵菌株使用。（2）在杨梅汁中起酵较快，有利于避免染菌。（3）能适应的生长温度较广，最适生长温度为28℃，最低生长温度为10℃，最高生长温度为38℃。（4）能适应的pH值范围较广，最适生长pH范围为3.0～4.2，最低生长pH值为2.5，最高生长pH值为9.0。（5）耐酒精能力较高，达到15%。
本发明中酵母菌GYM-17种子液的扩大培养工艺为：
（1）一级种子（三角瓶培养）：YEPD培养基：酵母浸膏，1.0％；蛋白胨，2.0％；葡萄糖，2.0％，PH自然。分装于容量为500ml的三角瓶内，每瓶装入 200ml。121℃下蒸汽灭菌20min。取出冷却后，在无菌条件下，用接种环挑取1至2环本发明中的酵母菌GYM-17斜面接种，28℃下，在140r/min摇床振荡培养24小时，镜检菌体生长正常，无杂菌即可使用。
（2）二级种子（10L种子罐培养）：将新鲜杨梅洗净后，打浆榨汁，用400目滤布挤压过滤，得到杨梅清汁备用。将备用杨梅汁抽入到10L种子罐内，定容7L，夹层蒸汽升温至121℃，维持15min灭菌，然后开冷水降温至28℃，按接种量8%接入酵母菌，接入酵母菌后即可开始通风搅拌培养，通风比为1:0.3。罐压要求0.03MPa，不宜过高。培养温度28℃，培养20～24h，必要时可适当延长或缩短时间。镜检菌体生长正常即可使用。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：本发明提供的酿酒酵母GYM-17是一株从与杨梅生长环境密切相关的杨梅果园土壤中分离筛选得到，对杨梅果酒发酵有较强的针对性，从而提高了酒体香气风味；该菌株能够以杨梅果汁为基质发酵成杨梅果酒，且具有起酵速度快，发酵能力强，耐受性好，所酿的果酒果香明显，香味协调，典型性突出，适合生产高品质杨梅果酒。
实施例1：本发明酿酒酵母的筛选和性能测定
1、本发明中菌株筛选和性能测定中所用培养基
（1）活化培养基：完全培养基（琼脂2％蔗糖2％酵母1％蛋白胨1％，自然pH）。
（2）增殖培养基：将成熟杨梅榨汁装入无菌三角瓶中，按30μg/ml和100单位/ml添加链霉素，青霉素，加入95%的食用乙醇使培养基酒精含量达到4%（v/v），用柠檬酸调节pH值到3.2～3.8之间。
（3）分离平板培养基：完全培养基（琼脂2％蔗糖2％酵母1％蛋白胨1％，自然pH）。
（4）种子培养基：杨梅汁（一般可溶固性物含量TSS为7%～9%），加蔗糖调TSS为15%，调pH值为3.2～3.8，于115℃、15min蒸汽灭菌备用。
（5）发酵培养基：杨梅汁（一般可溶固性物含量TSS为7%～9%），加蔗糖调TSS为15%，调pH值为3.2～3.8，添加有效量为50%的K2S2O5使SO2含量为100mg/L，于115℃、15min蒸汽灭菌备用。
（6）酵母菌性能测定培养基：完全液体培养基（蔗糖2％，酵母1％，蛋白胨1％，自然pH）。
2、本发明中菌株的筛选过程
（1）取分离源距地表15cm～20cm湿土壤1g，加入到增殖培养基中，在磁力搅拌器上混匀。添加链霉素、青霉素，加入95%乙醇使杨梅汁中的酒度达到4%，调节pH值，28℃让其自然发酵直至终了。
（2）将增殖发酵液适当稀释后，在完全平板培养基上进行梯度稀释分离。倒置于28℃恒温培养箱中培养，待培养基表面长出单菌落，再根据其颜色、透明度、直径大小、厚薄程度、生长快慢，挑选典型菌落，接入试管培养基斜面，待长出后进行镜检确定是否为酵母，观察菌落特征、编号命名。
（3）试管发酵初筛：将杨梅汁调糖、调酸后分装于无菌大试管，接入分离得到的纯种酵母菌，置于室温中发酵。观察起始发酵时间、发酵速率，每隔12hr观察产起泡状况、凝聚性等，培养5天后，品评风味。根据试验结果，初步筛选出产酒精能力较强和产香较好的酵母菌3株。
（4）三角瓶发酵复筛：将发酵培养基分装入三角瓶中，蒸汽灭菌后。将初筛得到的菌株及对照菌株DV10接入种子培养基中，于28℃，115r/min的摇床上培养20小时后，接入三角瓶发酵培养基中，于室温下发酵，每隔48hr测发酵液液酒精度，固形物含量，停止发酵后进行风味品评。综合对照酵母的发酵情况，选出发酵性能最好、产香较好的一株酵母菌GYM-17，经鉴定为酿酒酵母。
（5）形态特征观察：采用水浸法，在显微镜下观察选育酵母的外形、出芽情况、大小。菌落形态观察：采用平板稀释分离法，将选育酵母制成10-4、10-5、10-6三种稀释浓度的平板培养基，28℃恒温培养3天，观察菌落特征。
3、本发明所述的酿酒酵母菌株GYM-17性能测定方法
（1）最适生长温度测定：将GYM-17菌株接入完全培养基中，分别在24℃～40℃的不同温度下恒温培养10小时，于660nm定培养液的OD值大小，确定其最适生长温度。
（2）温度耐性测定：将GYM-17菌株接入完全培养基中，分别于低温和高温培养10天，观察有无菌体生长。
（3）最适生长pH值测定：将GYM-17菌株接入不同pH值的完全培养基中于最适生长温度恒温培养10小时，在660nm下测定OD值，依据OD值大小确定其最适pH。
（4）耐酸、碱能力测定：将完全培养基按设定pH分别加入柠檬酸或NaOH调匀后接入GYM-17菌株，在最适温度下培养7天，检查是否有菌体生长。
（5）耐酒精能力测定：将完全培养基按设定的浓度分别加入95％乙醇，摇匀后接入GYM-17菌株，28℃恒温培养一周，检查是否有菌体生长。
（6）生长曲线测定：将GYM-17菌株接入完全培养基中。以GYM-17菌株的最适pH、最适生长温度在150r/min的摇床上振荡培养，每隔4小时取培养液在660nm下测定OD值。
4、本发明所述的酿酒酵母菌株GYM-17性能测定结果
（1）在杨梅汁中起酵快、发酵能力强、产酒度高、残糖低；
（2）能适应的生长温度较广，最适生长温度为28℃，最低生长温度为10℃，最高生长温度为38℃；
（3）能适应的pH值范围较广，最适生长pH范围为3.0～4.2，最低生长pH值为2.5，最高生长pH值为9.0；
（4）耐酒精能力达到15%。
实施例2：本发明中酿酒酵母菌GYM-17种子液的扩大培养
（1）一级种子（三角瓶培养）：YEPD培养基：酵母浸膏，1.0％；蛋白胨，2.0％；葡萄糖，2.0％，PH自然。分装于容量为500ml的三角瓶内，每瓶装入200ml。121℃下蒸汽灭菌20min。取出冷却后，在无菌条件下，用接种环挑取1至2环本发明中的酵母菌GYM-17斜面接种，28℃下，在140r/min摇床振荡培养24小时，镜检菌体生长正常，无杂菌即可使用。
（2）二级种子（10L种子罐培养）：将新鲜杨梅洗净后，打浆榨汁，用400目滤布挤压过滤，得到杨梅清汁备用。将备用杨梅汁抽入到10L种子罐内，定容7L，夹层蒸汽升温至121℃，维持15min灭菌，然后开冷水降温至28℃，按接种量8%接入酵母菌，接入酵母菌后即可开始通风搅拌培养，通风比为1:0.3。罐压要求0.03MPa，不宜过高。培养温度28℃，培养20～24h，必要时可适当延长或缩短时间。镜检菌体生长正常即可使用。
实施例3：本发明中酿酒酵母菌GYM-17在杨梅果酒生产中的应用
选取成熟度较高的杨梅果实进行分选和清洗，去除霉变和腐烂的果实；去核除梗；破碎榨汁；加入60mg/L的果胶酶和50mg/L SO2；利用蔗糖调整杨梅汁糖度至20BX；接入酵母菌GYM-17种子液（安琪葡萄酒酵母作对比CK），接种量为5%（V/V）；发酵温度为20℃，发酵时间为7天；发酵结束后立即进行倒酒处理，分离出酒脚，自流酒和部分轻微压榨酒单独存贮；将分离出来的酒液满罐存贮进入陈酿；存贮6个月后进行下胶澄清，过滤沉淀；巴氏灭菌后进行无菌灌装即得到成品杨梅果酒。
从表1中可看出，二种酵母的产酒精速率相差不大，YM-17略高于安琪酵母。酵母的产酸量为安琪酵母＞YM-17，分别在第4天时达到最大值。安琪酵母可能由于前期的生长活力过强，导致酵母的大量繁殖而将营养物质消耗在细胞的生长量上，从而减少了酒精的转化率。相对而言YM-17的生长和代谢相对较为均衡，花色苷浓度较大。
从表2中可看出，对照组安琪葡萄酒干酵母所酿造的杨梅果酒口味欠佳，不能突出杨梅果汁的特有香气；而菌株GYM-17的突出优点是所酿造的杨梅果酒色泽自然，酒体澄清透明，口感醇和，香味浓郁，水果香突出，具有和谐的果香和酒香，典型性好。
表1不同酵母杨梅果酒发酵实验结果
表2不同酵母发酵杨梅果酒的感官评定