技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一组以细菌体为靶标的SELEX(指数富集的配体系统进化技术)技术筛选获得的与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体，可用于临床样本中创伤弧菌的快速检测诊断和水体、食品中创伤弧菌的监测。
背景技术
创伤弧菌是常见的弧菌属致病菌，革兰阴性短杆菌，亲水嗜盐，有鞭毛。在全世界的沿海区域均有感染病例报道。它是水域中固有菌群的组成部分，在海洋、湖泊以及水生动物体内均可分离得到。创伤弧菌是重要的海洋致病菌，在美国食品药品监督管理局出具的报告中，1992年至2007年间，美国共有459例创伤弧菌感染病例，且致死率高，达到51.7％。创伤弧菌的最佳生长温度是30℃，因此大部分的感染发生在温暖的夏季(北半球的五月至十月)。患者多是通过摄入带菌食物感染，在所有食用海鲜导致的感染死亡病例中，创伤弧菌感染占95％。伤口直接接触带菌的海水也可导致感染，患有慢性肝病的中年男性患者更易被感染。感染症状发生很快，可引起蜂窝组织炎、败血症、肠胃道症状等。摄入或接触后最快4小时即可发病，有感染24小时内死亡的病例。如果在3天内没有得到妥善治疗，患者的死亡率可达到100％。因此，对水域内和食品中的创伤弧菌进行监控对于食品安全、环境安全是有重要意义的，临床上对创伤弧菌进行快速诊断更是对患者的诊疗有着重要的意义。
目前，我国现行的鉴别诊断临床样本和食品样本中创伤弧菌的方法需要先增菌，后鉴定。首先使用碱性蛋白胨水或效果更好的蛋白胨-NaCl-纤维二糖(PNC)肉汤进行增菌，继而转种固体选择性培养基，如TCBS培养基，再通过生化试验对可疑菌落进行鉴别检验。然而，有研究发现，TCBS培养基筛选得到的阳性菌落中仅有51％是弧菌属细菌，准确率较低。全自动分析仪也可检测创伤弧菌，如生物梅里埃公司出产的全自动细菌鉴定及药敏分析系统和布鲁克·道尔顿公司出产的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。这些方法也需要初步的微生物鉴定结果，通常需要3-4天才能得到最终鉴定到种的结果，费时较久。在临床上使用这些手段，难以给予患者及时的，针对性的治疗方案。不但如此，基于培养的方法无法诊断出活的非可培养条件(VBNC)下的创伤弧菌，而VBNC状态下的创伤弧菌依然具有致病性。尽管通过PCR的手段，可以针对性扩增创伤弧菌特异性基因vvhA，16SrRNA等基因，对108以上的VBNC细菌进行检测，但是在自然界中，VBNC状态下的细菌很难达到这样高的数量，有研究发现100个细菌即可引发感染。因此，需要有一种快速、敏感的检测方法可以直接与创伤弧菌结合，指示它的存在。
近些年来，研究者们开始探索可以用于检测细菌的，与细菌直接结合的分子。单链的核苷酸链单链构象多态性，可以折叠成构象特殊且稳定的结构，是检测细菌的理想选择。适配体是可以特异性与靶物质结合的单链核苷酸，可以是ssDNA或ssRNA，结合的靶物质可以是金属离子，小分子，毒素，药物蛋白甚至是整个细胞。适配体是核酸分子，没有毒性和免疫源性，非常适合于开发成为检测检验工具和靶向治疗的元件。核酸单链可以批量地合成，可以按照需求在3’端或5’端添加荧光基团和其他的功能基团，而且可以很方便地固化在许多基质上，这些特性都使得它适合于定量检测。与抗体相比较，适配体的分子更小，更稳定，可以在更大的温度范围中保持特性。此外，适配体可以在体外快速地、批量地低成本合成，无批间差异，也不涉及动物源性材料，既避免了传染源和免疫活性，也维护了动物福利。
但是关于一种与创伤弧菌具有高特异性、高亲和力结合的适配体目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供能够与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体。本发明的第二目的在于提供通过截短的方法对该适配体进行优化，得到的TV8和TV13同样能够特异性结合创伤弧菌的适配体。本发明的再一目的是提供上述适配体在临床分离菌株的鉴定中、在食品安全的监控中、在海水浴场水质的监控中等多方面的应用。
本发明的主要技术方案是：利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以完整的创伤弧菌活菌菌体为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配体V8、V13。经鉴定，V8和V13的随机区域具有同样的性质。可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体修饰成为报告适配体，用于临床血液样品、食品、水体中创伤弧菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。
本发明的第一方面，提供一组特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，具有如下所示的通式：
5’-AGTATACGTATTACCTGCAGC-N25-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3’；
其中N代表脱氧核糖核酸碱基中A，T，C，G中任一个，N25代表长度为25个碱基的随机序列。
优选的，所述的寡核苷酸适配体其长度为66个碱基，随机区长度为25个碱基，对引物区进行添加、去除、修饰对其功能没有任何影响。
优选的，所述的寡核苷酸适配体其5’端或3’端可以标记FITC、生物素等，修饰后的适配体可与其他传感器联用对创伤弧菌进行分析检测。
优选的，所述的寡核苷酸适配体为单链DNA适配体，选自以下序列中的任一条：
V8:如SEQ ID NO：1所示；
V9：如SEQ ID NO：2所示；
V11：如SEQ ID NO：3所示；
V12：如SEQ ID NO：4所示；
V13：如SEQ ID NO：5所示；
V18：如SEQ ID NO：6所示；
V20：如SEQ ID NO：7所示；
V28：如SEQ ID NO：8所示；
V31：如SEQ ID NO：9所示；
V38：如SEQ ID NO：10所示；
V39：如SEQ ID NO：11所示；
V40：如SEQ ID NO：12所示；
V41：如SEQ ID NO：13所示；
V44：如SEQ ID NO：14所示；
V49：如SEQ ID NO：15所示；
V53：如SEQ ID NO：16所示；
V59：如SEQ ID NO：17所示；
V69：如SEQ ID NO：18所示。
本发明的第二方面，提供以上述单链DNA适配体为基础，通过截短的方法进行优化得到序列更短，成本更低的特异性结合创伤弧菌的适配体，命名为TV8，如SEQ ID NO：19所示；TV13，如SEQ ID NO：20所示。
所述的TV8，TV13适配体，在其5’端或3’端可以进行生物素、荧光分子、同位素、电化学、酶或巯基等化学修饰。
本发明的第三方面，提供上述寡核苷酸适配体在制备创伤弧菌检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。所述的试剂、试剂盒或传感器可用于检测食品、水体、临床样本中的创伤弧菌。
本发明还提供了上述寡核苷酸适配体与流式细胞技术联用的应用。联用后的生物传感器空白限是7CFU/mL，理论检测限是29.7CFU/mL，可靠的检测限为100CFU/mL，线性范围是500-500,000CFU/mL，检测时间<1h。
本发明以创伤弧菌为靶标，采用以细菌为靶标的-SELEX技术筛选与创伤弧菌高特异性、高亲和力结合的适配体，稳定性高、可体外合成、易标记功能基团和报告分子，有潜力被开发成为更加灵敏的，检测限更低的生物传感器，与现有的方法相比可以更有效率地完成复杂的临床、食品样本、海水样本中创伤弧菌的检测检验，为食品安全和患者诊疗提供帮助。
因此，本发明的适配体面向实际应用具有巨大的潜力。
本发明优点在于：
1、与抗体相比，单链寡核苷酸更加稳定，适配体可在体外合成，易于标记各种功能基团和报告分子，耐受各种温度，易于保存，保质期长。
2、该组序列是从结构显著、与创伤弧菌的结合具有不同亲和力和特异性的18条适配体序列中选取出的亲和力和特异性均较强的一组适配子序列。
3、目前创伤弧菌特异性抗体无商品化产品，获取困难，难以量产，创伤弧菌核酸适配体获取十分方便，应用前景良好。
4、目前创伤弧菌的检测方法基于培养，而创伤弧菌存在活的非可培养条件(viable but non-culturable state,VBNC)，这个状态下的细菌不能增殖但可致病，培养法检测会造成假阴性。创伤弧菌适配体可以与活的非可培养条件下的创伤弧菌直接结合，不基于培养即可准确检测。
附图说明
图1是创伤弧菌适配体的以全细菌体为靶标的SELEX筛选流程图。
图2是创伤弧菌适配体V8，V13，TV8，TV13序列的二级结构预测图。
图3是创伤弧菌适配体V8，V13，TV8，TV13的亲和力曲线。
图4是创伤弧菌适配体的特异性鉴定结果。
图5是创伤弧菌适配体与不同生长状态下的创伤细菌结合的流式细胞术结果。
图6是创伤弧菌适配体与不同的创伤细菌菌株结合、在不同结合环境下与创伤弧菌结合的流式细胞术结果。
图7是创伤弧菌适配体与创伤细菌、白色念珠菌，金黄色葡萄球菌结合的激光共聚焦荧光显微镜镜下观察的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下是通过以细菌体为靶标的SELEX技术筛选高特异性、高亲和力的创伤弧菌适配体及它在创伤弧菌快速检验中的应用。
实施例1.随机ssDNA文库及其引物的构建
选用长度为61个碱基的随机ssDNA文库。两侧为固定的引物区序列，中间包含25个碱基长度的随机区序列，理论的库容量为425，即有1015种序列排列方式。因此，2000pmol文库理论上可以穷举序列多样性。
文库序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N25-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
上游引物：AGTATACGTATTACCTGCAGC(SEQ ID NO：21)；
下游引物(筛选用)：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Spacer18-CGATATCTCGGAGATCTTGC；
下游引物(测序用)：CGATATCTCGGAGATCTTGC(SEQ ID NO：22)；
将随机ssDNA文库和两种引物均用结合缓冲液(10mM Tris-HCl，20mM NaCl，0.25mM MgCl2，1mM KCl)配制成100μmol/L贮存液，-20℃贮存备用。
引物退火温度为57℃。
实施例2.创伤弧菌核酸适配体的筛选
创伤弧菌核酸适配体的筛选过程如图1所示。细菌的准备：创伤弧菌：菌种液注入3％NaCl的脑心浸液培养基，30℃有氧环境下培养。取对数生长早期(OD600＝0.3)、晚期(OD600＝0.8)、静止期(OD600＝1.0)的菌液，离心后收集菌体，以1:1:1的比例比例混合，用3％NaCl的脑心浸液培养基洗涤两次后，重悬于3％NaCl的脑心浸液培养基：DMSO比例为9:1的保存液中，每管分装4×108CFU。存放于-80℃冰箱内。筛选时37℃水浴溶解，结合缓冲液离心洗涤3次。副溶血弧菌：菌种液注入3％NaCl的脑心浸液培养基，37℃有氧环境下培养。离心后收集菌体，用3％NaCl的脑心浸液培养基洗涤两次后，重悬于3％NaCl的脑心浸液培养基：DMSO比例为9:1的保存液中，存放于-80℃冰箱内。筛选时37℃水浴溶解，结合缓冲液离心洗涤3次。
第1轮筛选：用结合缓冲液溶解文库，终体积为200μL，总量2000pmol。均匀混合后，用封口膜封好离心管盖，95℃水浴加热10min后立刻冰浴5min，进行充分的核酸变复性，使得序列恢复到它本身的三级结构。用文库重悬细菌，将离心管插入四维旋转混匀仪上，4℃孵育2h。孵育结束后12,000×g离心去上清，用1mL的结合缓冲液洗涤3次。
用940μL的结合缓冲液重悬菌体，再加入940μL PCR反应酶预混液、60μL正向引物和60μL带有PolyA的反向引物。将该溶液分装入PCR管中，每管50μL。同时设仅含引物和PCR mixture的空白对照，监测PCR体系是否存在模板污染。
PCR热循环参数:95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，进行20轮循环，最后4℃冷却。
PCR产物通过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离单链。8％尿素聚丙烯酰胺成分为：尿素2.52g，ddH2O 2.1m，40％丙烯酰胺1.2mL，10×TBE缓冲液0.6mL，10％过硫酸铵36μL，四甲基乙二胺9μL。将PCR产物与DNA尿素上样缓冲液1:1混合上样，230V电泳至溴酚蓝溢出胶外。将尿素聚丙烯酰胺凝胶剥离，Gel-Red核酸染料染胶10min，紫外灯下观察。检查空白对照中是否存在条带，如存在，则本轮筛选失败。若没有条带，将分子量小的条带切下，切碎后加入1.5mL DEPC水，65℃煮胶50min，使DNA从凝胶进入水中。
用凝胶提取试剂盒将ssDNA从煮胶缓冲液中提取出来，所得的溶液为次级文库。用核酸定量荧光计测定浓度，-20℃储藏备用。
第2-5个循环：创伤弧菌与200pmol的次级文库孵育，孵育之后的洗涤次数增加到4次。
第6-7个循环：创伤弧菌与150pmol的次级文库孵育，孵育之后的洗涤次数增加到5次。
第7-10个循环：次级文库先与副溶血弧菌孵育2h，离心后上清与创伤弧菌孵育2h。次级文库量为100pmol，与创伤弧菌孵育后，洗涤次数为5次。
第7-13个循环：次级文库先与副溶血弧菌孵育3h，，离心后上清与创伤弧菌孵育1h。次级文库量为100pmol，与创伤弧菌孵育后，洗涤次数为5次。
用测序用引物扩增最后一轮的次级文库，分离ssDNA后委托上海生工生物工程股份有限公司进行克隆测序。测序序列80条。
实施例3.创伤弧菌核酸适配体的初步鉴定
统计重复的序列。通过Clustal X序列比对软件，对克隆测序得到的序列进行分组，对比一级结构，分析可能的序列保守区域。同时使用线上工具The mfold web server(http://mfold.rit.albany.edu/？q＝mfold)进行二级结构模拟。根据分析结果挑选18条较有代表性的序列，委托上海生工生物工程股份有限公司进行合成，连接FITC荧光基团，准备下一步的鉴定。18条序列鉴定结果显示，V8，V13两条序列的结合效果最好，进行亲和力常数的测定。V8，V13二级结构模拟图如图2所示。
表1、18条初步鉴定的序列
亲和力测定：将V8，V13以及他们的随机区域TV8，TV13稀释为一系列浓度：0nM，25nM，50nM，75nM，100nM，200nM，300nM，终体积均为100μL。与108CFU创伤弧菌4℃孵育30min后，洗涤1次后用300μL结合缓冲液悬浮，用流式细胞仪对悬浮液进行检测，设置参数，检测20,000个有效颗粒。
记录与不同浓度核酸适配体孵育后带荧光的创伤弧菌比例。用SigmaPlot 12.5软件，根据公式y＝Bmax·x/(KD+x)绘制one site saturation曲线(其中x为核酸适配体浓度，y为对应的荧光细菌比例，Bmax为最大的荧光细菌比例)。四条序列的One site saturation曲线如图3所示。
亲和力测定结果显示，V8，V13以及其截短序列TV8，TV13的亲和力均在nM级别，如表2所示。
表2、创伤弧菌适配体V8、V13以及其截短序列TV8、TV13的解离常数KD值
实施例4.创伤弧菌核酸适配体的特异性分析
创伤弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的培养：使用含3％NaCl的脑心浸液培养基37℃有氧条件下摇床震荡培养8h，结合缓冲液洗涤3次。
金黄色葡萄球菌，产单核李斯特菌，白色念珠菌，铜绿假单胞菌的准备：1％NaCl用脑心浸液培养基37℃有氧条件下摇床震荡培养8h，结合缓冲液洗涤3次。
对照的设置：将没有经过孵育的各种细菌通过流式细胞仪检测，在FSC-SSC图中定义细菌的分布范围，设为R1。将FITC标记的ssDNA文库进行变复性，用结合缓冲液稀释至200nM。文库与4×108CFU创伤弧菌4℃孵育30min，洗涤1次后用300μL结合缓冲液悬浮，用流式细胞仪对悬浮液进行检测，设置参数，检测20,000-30,000个有效颗粒。在FITC-FSC图上向右拖动选区，使得选区内正好不纳入任何荧光颗粒，设选区为R2。
将带有FITC基团的V8，V13及其随机区域TV8，TV13进行变复性，稀释至200nM，分别与108CFU个创伤弧菌，副溶血弧菌，溶藻弧菌，金黄色葡萄球菌，产单核李斯特菌，白色念珠菌，铜绿假单胞菌4℃孵育30min，洗涤1次后用300μL结合缓冲液悬浮，用流式细胞仪对悬浮液进行检测，设置参数，检测20,000-30,000个有效颗粒。检测后将不同菌的FITC-Counts图叠加，对信号进行比较。如图4所示，创伤弧菌的荧光信号显著高于其他种属细菌，其他种属细菌信号与同荧光文库孵育的创伤弧菌荧光信号无显著差异。
实施例5.创伤弧菌核酸适配体的其他性能
1.核酸适配体与不同生长状态创伤弧菌的结合
根据绘制的生长曲线，培养对数生长早期(OD600＝0.3)、对数生长晚期(OD600＝0.7)、静止期(OD600>1)的创伤弧菌ATCC27562。活的非可培养条件下的创伤弧菌培养：含3％NaCl的脑心浸液培养基30℃培养8h，之后置于4℃下3-7d，期间每天对菌的活性进行检测，当创伤弧菌失去分裂能力后时，认为进入活的非可培养条件。
核酸适配体V8变复性后稀释至200nM，与108CFU细菌4℃孵育30min后，洗涤1次后用300μL结合缓冲液悬浮，用流式细胞仪对悬浮液进行检测，设置参数，检测20,000个有效颗粒。如图5所示，不同生长状态下创伤弧菌的荧光强度和荧光细菌比例无显著差异。
2.核酸适配体与不同来源的创伤弧菌菌株的结合
在筛选过程中我们选择了质控菌株ATCC 27562作为靶标，为了验证适配体是否可与其他的创伤弧菌菌株结合，我们采用其他来源分离得到的创伤弧菌菌株进行了进一步的验证。创伤弧菌MCCC 1A08743分离自患者血清，创伤弧菌MCCC 1H00047分离自湖泊。分别用含3％NaCl的脑心浸液培养基30℃培养8h，洗涤细菌3次，取108CFU与200nM核酸适配体V8孵育30min，洗涤后用流式细胞仪对样本进行检测。设置参数，检测20,000个有效颗粒。检测后将不同菌的FITC-Counts图叠加进行比较。如图6所示，两株创伤弧菌的荧光强度和荧光细菌比例与ATCC27562结果无差异。
3.核酸适配体在复杂环境中与创伤弧菌的结合
由于血清中含有丰富的蛋白，与创伤弧菌孵育后蛋白会大量粘附在细菌表面，导致细菌在FSC-SSC图上的分布有所变化(向右上方向移动)，因此将血清用50μg/mL的蛋白酶K处理5min后进行孵育。
将同等量的108CFU创伤弧菌分别用蛋白酶K处理后血清、牡蛎浸出液和结合缓冲液重悬，与200nM核酸适配体V8孵育30min，洗涤后用流式细胞仪对悬浮液进行检测。设置参数，检测20,000个有效颗粒。检测后将不同菌的FITC-Counts图叠加进行比较。如图6所示，创伤弧菌在血清中和牡蛎浸出液中与核酸适配体结合的荧光强度和荧光细菌比例与在结合缓冲液中结合无差异。
4.激光扫描共聚焦荧光显微镜联合核酸适配体观察创伤弧菌
取过夜培养的创伤弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌分别12,000g离心5min沉淀，用结合缓冲液重悬，洗涤3次，测定OD600值。取108CFU创伤弧菌、副溶血弧菌以及创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌混悬液分别与200μL 400nM的荧光核酸适配体V8避光孵育45min。12,000g离心5min，去除上清，用200μL结合缓冲液重悬，取2μL菌悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，加入3μL结合缓冲液在载玻片上混匀液滴。盖玻片的一侧先接触液滴，然后缓缓地压平液滴，使其均匀地分布于载玻片与盖玻片之间，尽可能没有气泡。
将菌的压片置于激光扫描共聚焦显微镜下观察(激发光设置为486nm)。同一视野分别拍摄眀场视野与荧光视野。图片的叠加使用Photoshop 7.0软件(Adobe system)利用图层叠加合成，其中眀场图片透明度设置为70％，荧光视野图片的透明度设置为40％。如图7所示，创伤弧菌与均可与核酸适配体V8，V13，TV8，TV13结合，创伤弧菌与其他菌共同与核酸适配体结合时，核酸适配体可特异性地结合创伤弧菌。
实施例6.创伤弧菌核酸适配体结合流式细胞技术检测创伤弧菌
创伤弧菌适配体开发的初衷是实现快速诊断。流式细胞技术检测细菌的前处理简便，检测速度快，可以直接对样本中的细菌数量进行计数，是理想的检测平台。
FACSCalibur流式细胞技术结合核酸适配体V8检测创伤弧菌，荧光颗粒的计数结果与平板计数法对比，相关系数R2＝0.997。空白限是7CFU/mL，理论检测限是29.7CFU/mL，可靠的检测限为100CFU/mL。，线性范围是500-500,000CFU/mL，检测时间<1h。
破碎的细菌暴露出更多的细胞壁成分，可增加与核酸适配体接触的面积。通过计算，用蛋白酶K处理细菌25min后，破碎细菌与完整细菌的数量比值约为1：6.87。降低后的检测限为：7.8CFU/mL，可靠的检测限为28CFU/mL。与一般PCR法相比，检测限相似，预处理更简便，检测速度更快。与检测性能更好的流式细胞技术结合有望成为更优秀的检测创伤弧菌的生物传感器。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一组与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体及其应用
<130> /
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
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agtatacgta ttacctgcag ctgtataccc gaccgtaccg acgtaagcaa gatctccgag 60
atatcg 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agtatacgta ttacctgcag ctcaccttca cacactccct tcttcggcaa gatctccgag 60
atatcg 66
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
caatcatgac cgcccacctc actcg 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccaaccctat gcttcaacgg tcttt 25
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agtatacgta ttacctgcag c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgatatctcg gagatcttgc 20