OsFLA19蛋白在调控植物叶夹角中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103923916 A (43)申请公布日 2014.07.16 CN 103923916 A (21)申请号 201310009507.9 (22)申请日 2013.01.10 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院植物研究所 地址 100093 北京市海淀区香山南辛村 。

2、20 号中国科学院植物研究所 (72)发明人 种康 陈丽萍 马岩 徐云远 王晓夏 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 OsFLA19 蛋白在调控植物叶夹角中的应用 (57) 摘要 本发明公开了 OsFLA19 蛋白在调控植物叶夹 角中的应用。本发明提供了沉默或失活目的植物 中 OsFLA19 蛋白编码基因表达的物质在调控植物 叶夹角中的应用 ； 所述 OsFLA19 蛋白的氨基酸序 列为序列表中的序列 2。所述调控植物叶夹角为 增大植物叶夹角。 本发明的实验证明， 本发明发现 的 OsFLA19 编码基因部分特异序列组成的 DNA。

3、 分 子构建到目的载体 pTCK303 中， 得到 RNA 干扰载 体， 利用农杆菌介导法将 RNA 干扰载体转化水稻 Kitaake 愈伤组织， 得到 OsFLA19 的 RNAi 株系， 该 植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显叶夹 角增大的特性， 说明沉默 OsFLA19 表达与提高水 稻叶夹角密切相关。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103923916 A CN 103923916 A 1/。

4、1 页 2 1. 沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋白编码基因表达的物质在调控植物叶夹角中的 应用 ； 所述 OsFLA19 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述 OsFLA19 蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列 1。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋白编码基因表达的物质为如下 1） -3） 中的至少 一种 ： 1） RNA 分子， 为如下 （a） 或 （b） ： （a） 序列表的序列 4 所示的 RNA 分子 ； （b） 与序列表的序列 4 反。

5、向互补的 RNA 分子 ； 2） 编码所述 RNA 分子的 DNA 分子 ； 3） 含有所述 DNA 分子的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述 DNA 分子的核苷酸序列为序列表中的序列 3 或序列表中的序列 3 自 5 末端第 16-1199 位核苷酸 ； 所述重组载体为将所述 DNA 分子插入表达载体中， 得到的载体。 5. 根据权利要求 1-4 中任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。 6. 一种培养转基因植物的方法， 包括如下步骤 ： 沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋 白编码基。

6、因表达， 得到转基因植物， 所述转基因植物的叶夹角大于所述目的植物 ； 所述 OsFLA19 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 OsFLA19 蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列 1。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述沉默或失活目的植物中OsFLA19蛋白编码基因表达为将权利要求3-5中任一所述 应用中的所述 DNA 分子导入目的植物中。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述将权利要求 3-5 中任一所述应用中的所述 DNA 分子通过权利要求 3-5 中任一所述 应用。

7、中的所述重组载体导入目的植物。 10. 根据权利要求 6-9 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。 权 利 要 求 书 CN 103923916 A 2 1/8 页 3 OsFLA19 蛋白在调控植物叶夹角中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种 OsFLA19 蛋白在调控植物叶夹角中的应 用。 背景技术 0002 水稻是全世界重要的粮食作物之一， 占全球谷类作物种植面积的1/3。 随着人口迅 速增长， 全球粮食危机日益严重。我国城市化进程、 水资源限制等导致耕地面积减少， 加上 种植结构调整， 我国的水稻实际种植面积已有下降趋。

8、势， 要满足巨大人口增长对稻米的需 求， 解决粮食安全问题， 必须实现水稻育种上的新突破。 20世纪60年代， 我国选育出综合性 状良好的矮秆抗倒品种， 开创了我国水稻矮化育种的新纪元， 矮秆水稻品种的选育和推广 成为水稻育种实践中非常重要的研究课题。 因此， 发掘和鉴定影响水稻矮化的基因， 开展矮 化相关基因的定位、 克隆及作用机理等方面的研究， 实现对于水稻株高的定向改良， 具有十 分重要的理论意义和应用价值。 0003 矮化作为水稻的一种优良性状， 具有抗倒伏和增产的作用， 并且水稻矮秆基因的 发掘和育种利用已为人类粮食生产做出了巨大贡献。然而， 中国矮秆资源十分贫乏、 矮秆 基因单一化。

9、以及可利用的矮源比较稀少， 遗传研究表明， 生产上应用的矮秆和半矮秆品种 绝大多数是带有sd1的品种及其衍生品种， 但是由于sd1基因与不良农艺性状的连锁， 使其 在生产上广泛利用潜伏着由遗传单一而带来的风险 （Yu et al.,2005） 。因此创建、 筛选非 sd1 矮源， 以扩大水稻矮秆基因的遗传基础， 增加遗传多样性或者作为矮秆基因的储备是极 为重要和必要的， 该项研究受到广大水稻育种工作者和种质资源工作者的高度重视 ； 到目 前为止 , 已发现多种矮化突变体 , 而大多数突变体都过度矮化或不具备实用的农艺性状。 因此挖掘新的矮杆资源， 通过多种途径探求对育种具有应用价值的新矮源， 。

10、无论在理论上 还是在育种实践上都将具有非常重要的实用价值。 0004 水稻植株矮化一般认为是矮秆基因的作用导致水稻植株形态学或细胞学上的变 化， 如节间变短和细胞数目减少等 ； 同时， 基因的表达还受到外部环境以及内源条件的影 响。 近年来， 对水稻矮化相关基因的遗传学、 矮化突变体的激素调控以及矮化相关基因的克 隆和利用等方面开展了广泛而深入的研究， 尤其在利用基因工程手段控制水稻株高方面取 得了很大的进步。植物激素几乎参与水稻生长发育的整个过程 , 植物矮化突变与植物赤霉 素 (Gibberellin,GA) 和油菜素类固醇 (Brassinosteroid,BR) 有关 ; 少数植物矮化。

11、突变与 生长素 (Auxin,IAA) 有关。水稻矮化突变体 dwarfl(d1) 是 GA 钝感型突变体， 表现为矮化、 叶宽且呈墨绿色、 花序紧密。研究表明， 水 f 稻 1G 基 Adwar 因编码的是结合蛋白， 该蛋白在 植物的生长发育中发挥着重要作用 f1GTP(Ashikari et al.,1999)。Sasaki 等分离的水稻 矮化突变体 gid2 也是 GA 钝感突变体 , 因抑制 GA 的信号传导 , 导致植株矮化 （Sasaki et al.,2003） 。 水稻brd1突变体是是一种BR缺陷型矮化突变体， 外源施加BR能恢复到正常表 型。该突变体叶鞘短、 叶片短而弯曲、。

12、 分蘖少、 不育。内源 BR 含量分析发现 BR 合成过程中 的 BR-6- 氧化酶减少 (Mori et al.,2002)。Hong 等研究发现 , 矮化突变体 d2 是 BR 敏感 说 明 书 CN 103923916 A 3 2/8 页 4 型突变体 , 外源施加 10-6M 的 BL(BR 的一种活性形式 ), 能使突变体的表型恢复到野生型 , 利用 d2 突变体克隆了 D2 基因 , 该基因编码细胞色素 P450 家族中一个新成员 , 属于与 BR 合成酶高度相似的 CYP90D 家族 (Hong etal.,2003)。随着 RFLP、 RAPD、 AFLP、 SSR 等分子标 。

13、记技术的开展及广泛应用， 许多控制株高性状的基因已得到了定位和克隆， 利用这些基因 控制 GA 或者 BR 的生物合成或者信号传导从而获得适合的株高， 将是未来生产的重要手段 （Mori et al.,2002 ； Hong et al.,2003 ； Hedden et al.,2003 ； Sakamoto et al.,2003） 。 0005 水稻产量与它的株型密切相关， 除了株高， 还包括分蘖数目、 分蘖角度、 花形态和 叶夹角等。直立叶片株型和密植相结合是目前获得水稻增产的新策略， 拥有直立叶片的植 株能够吸收更多的阳光促进光合作用和种子灌浆， 从而提高整株的产量。水稻对油菜素内 。

14、酯(BR)响应的一个重要形态特征就是产生直立叶片的表型。 多年来科学家们对水稻中BRs 合成和信号转导分子机制的研究投入了极大的热情， 越来越多的水稻 BRs 合成和信号转导 的关键元件被克隆和印证。BR 合成减少的突变体以及信号减弱的突变体表现出矮化、 叶片 直立、 种子变小等特征， 例如 brd2、 d2、 d11、 brd1、 d61， 相反， 超表达合成基因或者信号转导 的正调控因子能够增大叶夹角的角度， 例如超表达BZR1。 因此， 分离水稻油菜素内酯信号元 件， 不仅完善了水稻油菜素内酯信号传递的分子机制， 而且对于改良水稻株型、 提高水稻产 量也有重要意义。 0006 具有类成束。

15、蛋白结构域 （Fasciclin-like domain）的阿拉伯半乳聚糖蛋白 （Arabinogalactan proteins， AGP） 是阿拉伯半乳聚糖蛋白家族中的一类， 它不仅包含有类 AGP的糖基化区域， 而且还存在l-2个fasciclin-like结构域， 该类蛋白被许多实验证明行 使分子粘连的功能。Faik 等通过生物信息学的方法分析了水稻和小麦中的 FLA 基因， 结果 发现， 这些谷物类的 FLA 蛋白与拟南芥的有相同的结构， 包含 fasciclin-like 和 AGP-like 结构域。这些基因中的 70% 也被推测含有 GPI- 锚定序列。RNAgel blot 。

16、分析发现大多数 FLA 基因在种子和根中微弱表达， 而且大多数小麦 FLA 基因的表达因非生物条件的胁迫而 下调 (Faik et al.， 2006)。到目前为止， 水稻基因组中 FLA 基因家族已有 29 个成员被鉴 定出来。在拟南芥基因组中已经报道的 FLA 类基因一共有 24 个成员。目前关于植物 FLA 蛋白的功能还知之较少， 己有的证据表明， FLA 蛋白可能在细胞伸长、 细胞粘连和次生壁成 熟的过程中起作用。拟南芥一个 sos5(fla4) 突变体生长在高盐浓度的培养基上时， 表现出 根尖膨胀、 根的伸长受到了抑制， 测序结果显示突变位点位于该基因内的 fasciclin-lik。

17、e 结构域中， 因此， FLA4 是细胞增殖所必需的 (shi et al.， 2003)。拟南芥另一个 FLA 基因 AtFLA11， 其 mRNA 在花序茎和荚果的厚壁组织 (sclerenchyma) 中特异表达， 且表达强度随 着果实的成熟不断增强， 推测 AtFLA11 可能促进次生细胞壁的木质化， 对次生细胞壁的成 熟有重要的作用 (Ito et al.， 2005)。 0007 目前， 虽然人们对 AGP 类基因家族蛋白的研究已经取得了一定的进展， 但在水稻 中的研究还比较少， 该类基因参与的生物学过程还不清楚。 发明内容 0008 本发明的一个目的是提供沉默或失活目的植物中 O。

18、sFLA19 蛋白编码基因表达的 物质的用途。 0009 本发明提供了沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋白编码基因表达的物质在调控 说 明 书 CN 103923916 A 4 3/8 页 5 植物叶夹角中的应用 ； 所述 OsFLA19 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。 0010 上述应用中， 所述 OsFLA19 蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列 1。 0011 上述应用中， 所述沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋白编码基因表达的物质为如 下 1） -3） 中的至少一种 ： 0012 1） RNA 分子， 为如下 （a） 或 （b） ： 0013 （a） 序列表的。

19、序列 4 所示的 RNA 分子 （单链 RNA 或双链 RNA） ； 0014 （b） 与序列表的序列 4 反向互补的 RNA 分子 （单链 RNA 或双链 RNA） ； 0015 2） 上述 RNA 分子的 DNA 分子 ； 0016 3） 含有所述 DNA 分子的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 0017 上述应用中， 所述 DNA 分子的核苷酸序列为序列表中的序列 3 或序列表中的序列 3 自 5 末端第 16-1199 位核苷酸 ； 0018 所述重组载体为将所述 DNA 分子插入表达载体中， 得到的载体， 在本发明的实施 例中， 表达载体具体为载体 pTCK303。 00。

20、19 上述应用中， 所述调控植物叶夹角为增大植物叶夹角。 0020 上述应用为将所述 DNA 分子导入目的植物中， 得到转基因植物， 所述转基因植物 的叶夹角大于所述目的植物 ； 0021 所述叶夹角具体为剑叶夹角或剑叶下第一叶夹角 ； 0022 上述应用中， 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物 ； 所述单子叶植物具体为 水稻。 0023 本发明的另一个目的是提供一种培养转基因植物的方法。 0024 本发明提供的方法， 包括如下步骤 ： 沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋白编码基 因表达， 得到转基因植物， 所述转基因植物的叶夹角大于所述目的植物 ； 所述 OsFLA19 蛋白 的氨基。

21、酸序列为序列表中的序列 2。 0025 上述方法中， 所述 OsFLA19 蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列 1。 0026 上述方法中， 所述沉默或失活目的植物中 OsFLA19 蛋白编码基因表达为将上述应 用中的所述 DNA 分子导入目的植物中， 得到转基因植物。 0027 上述方法中， 所述将上述应用中的所述 DNA 分子通过上述应用中的所述重组载体 导入目的植物。 0028 所述叶夹角为剑叶夹角或剑叶下第一叶夹角。 0029 上述方法中， 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物 ； 所述单子叶植物具体为 水稻。 0030 本发明的实验证明， 本发明发现的 OsFLA19， 将其编。

22、码基因部分特异序列组成的 DNA 分子构建到目的载体 pTCK303 中， 得到 RNA 干扰载体， 利用农杆菌介导法将 RNA 干扰载 体转化水稻 Kitaake 愈伤组织， 经潮霉素筛选和 PCR 检测， 得到 OsFLA19 的 RNAi 株系， 该植 株与未转入该基因的水稻相比表现出明显叶夹角增大的特性， 说明沉默 OsFLA19 表达与提 高水稻叶夹角密切相关。 附图说明 0031 图 1 为 RT-PCR 方法扩增到 OsFLA19 的全长 cDNA 中较特异的序列 说 明 书 CN 103923916 A 5 4/8 页 6 0032 图 2 为 RNAi 表达载体 OsFLA1。

23、9RNAi 的部分结构示意图 0033 图 3 为转基因水稻的 Real-time-PCR 鉴定 0034 图 4 为 OsFLA19RNAi 转基因水稻叶夹角变大表型观察 具体实施方式 0035 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0036 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0037 实施例1、 干扰OsFLA19编码基因表达载体OsFLA19RNAi的构建及干扰DNA分子的 获得 0038 1、 干扰 OsFLA19 编码基因表达的靶片段的获得 0039 根据在 GenBank 提交的水稻基因序列， 找到编码 OsFLA19 。

24、基因， 其完整读 码 框 序 列 GenBank 号 为 NM_001053180（序 列 1 ； 编 码 的 蛋 白 命 名 为 OsFLA19， 其 氨 基酸序列为序列表中序列 2） ， 据此设计正反向引物， 5端引物 ： 5 -CGG GGTACC ACTAGTCAATAAGGAGCACAAGAAG-3 ( 下划线序列为 Kpn 、 Spe 位点 )， 3端引物 ： 5 -CGCGGATCC GAGCTC CTGAGTGAATCATCATCAACA-3 ( 下划线序列为 BamH 、 Sac 位 点 )，以 三 叶 期 Kitaake 水 稻 (Oryza sativaL.cv.Kita。

25、ake， Qu et al.,J.Exp. Bot.2008,59:24172424, 公众可从中国科学院植物研究所获得， 以下简称为野生型水稻。 ） 幼苗总 RNA 反转录的 cDNA 为模板， 采用 RT-PCR 方法扩增到 OsFLA19 全长 cDNA 中 316bp 的 特异序列。具体操作过程如下 ： 0040 水稻总 RNA 的提取 ： 选取三叶期 Kitaake 水稻。幼苗 100mg 为材料， 在液氮中研 磨， 将液氮中研碎的冻干粉转入到含 1ml Trizol 试剂 （Invitrogen） 的 1.5ml 离心管中， 充 分混匀 ； 室温 25放置 5 分钟 ； 每管中加入。

26、 0.2ml 新鲜氯仿， 剧烈振摇 15 秒， 25温育 23 分钟 ； 12,000rpm， 4， 离心15分钟 ； 把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中， 加 0.5ml 异丙醇， 室温放置 10 分钟使 RNA 沉淀 ； 12,000rpm， 4， 离心 10 分钟 ； 去上清， 将 RNA沉淀用1ml75%乙醇清洗2次， 超净台吹至半干 ； 用50l DEPC-ddH2O重悬沉淀， 60水 浴 10 分钟， 以溶解 RNA 沉淀。将此 RNA 溶液分装后 -70保存， 备做反转录的模板。 0041 RT-PCR ： 取 1l 上述 RNA 样品， 用 DEPC-ddH。

27、2O 稀释 100 倍， 用分光光度计测定 RNA 浓度。参照 RT-PCR 试剂盒 （Promega）说明书， 根据 RNA 的定量结果， 取 2g 该 RNA， 加 1.0gOligo dT 引物， 用 DEPC-ddH2O 补充至 15l， 混匀后 70变性 5 分钟， 冰浴 5 分 钟。短暂离心后， 加入 25l 反转录混合物 （5l M-MLV5ReactionBuffer， 6l dNTP Mixture(2.5mM)， 1l M-MLV Reverse Transcriptase， 0.5l RNaseInhibitor， 12.5l DEPC-ddH2O） 。 混匀后， 42水。

28、浴1小时完成反转录过程 ； 75水浴10分钟使反转录酶失活， 得到含有第一链 cDNA 的混合物。 0042 取 1l 上述第一链 cDNA 作为 PCR 的模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 0.2l LATaq （5U/l） 、 10l2GC buffer， 1.8l dNTPs,0.5l5端引物 (10M)， 0.5l3 端引物 (10M)， 加 ddH2O 终体积 20l。引物序列如前， PCR 程序为 ： 94 C 预变性 3 分钟 后进入 PCR 循环， 循环参数为 94 C30 秒变性 58 C30 秒复性 72 C1 分钟延伸 ,30 个循环后在 72 C 继续合成 10。

29、 分钟。 0043 扩增的 PCR 产物经过 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳分离， 结果如图 1 所示， 从图中可 说 明 书 CN 103923916 A 6 5/8 页 7 以看出， 得到分子量大约 0.3kb 的条带， 用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收该片断得到 20l 回收产物。进行测序分析， 测序结果 316bp 的 PCR 片段具有序列表中序列 1 自 5 末 端第 713-1028 之间的核苷酸， 将该 PCR 片段命名为 A。 0044 克隆载体的构建和纯化 ： 取 3.5l 上述回收片段， 加入 T4-DNA 连接酶 1l（3U/ l） 、 2 连接酶缓冲液 5l、。

30、 pGEM-T Easy 载体 （Promega） 0.5l（50mg/ml） 4连接过 夜， 将连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到转 化子， 得到质粒 pTeasy-A。 0045 经过测序， 质粒 pTeasy-A 为将序列表中序列 1 自 5 末端第 713-1028 之间的核苷 酸插入 pGEM-T Easy 载体中得到的质粒。 0046 2、 OsFLA19RNAi 表达载体的构建 0047 pTCK303 载 体 酶 切 ： 用 限 制 性 内 切 酶 Spe 和 Sac 双 酶 切 载 体 pTCK303 （pTCK303 记 载 在 如。

31、 下 文 献 中 ： Wang Z,Chen C,Yunyuan Xu,et al.2004.A Practical Vectorfor Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice(Oryza sativa). PlantMolecularBiology reporter22:1-9. ； 公众可从中国科学院植物研究所获得） ， 酶切 体系为 ： 质粒 10l、 10 x 酶切缓冲液 5l、 Spe 1l（10U/l） 、 Sac I0.8l（10U/ l） ， 加 ddH2O 补充反应体系至 50l， 37酶切 4 小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶。

32、切产物进 行分离， 回收 14621bp 线性化的 pTCK303 大片段， 溶于 20l ddH2O 中。 0048 正向片段和反向片段的获得 ： 用限制性内切酶 Spe 和 Sac 同样条件双酶切 pTeasy-A 并回收 316bp 酶切产物， 命名为 OsFLA19F（正向片段） 。同样， 用限制性内切酶 BamHI 和 KpnI 对载体 pTeasy-A 进行双酶切并回收 316bp 酶切产物， 命名为 OsFLA19R（反 向片段） 。 0049 OsFLA19RNAi 表达载体 ： 取回收的 316bp 的 OsFLA19F 产物 10l、 回收的载体 pTCK303 溶液 6l。

33、， 与 T4DNA 连接酶 2l(3U/l)、 10 x 连接酶缓冲液 2l 混和， 16连接 16 小时， 得到连接产物， 将连接产物转入大肠杆菌中， 得到转化子。提取转化子的质粒， 送 去测序 , 将该质粒命名为 OsFLA19F/pTCK303。测序成功的该质粒用限制性内切酶 KpnI 和 BamH进行双酶切， 酶切体系为 ： 质粒10l、 10 x酶切缓冲液5l、 KpnI1l （10U/l） 、 BamH I0.8l （10U/l） ， 加 ddH2O 补充反应体系至 50l， 37酶切 4 小时。用琼脂糖凝胶电泳 对酶切产物进行分离， 回收14937bp线性化的OsFLA19F/p。

34、TCK303大片段， 溶于20l ddH2O 中。取回收的 316bp 的 OsFLA19R 产物 10l、 回收的载体 OsFLA19F/pTCK303 溶液 6l， 与 T4DNA 连接酶 2l(3U/l)、 10 x 连接酶缓冲液 2l 混和， 16连接 16 小时， 得到连接产 物， 将连接产物转入大肠杆菌中， 得到转化子。提取转化子的质粒， 送去测序。 0050 该质粒为将序列表中的序列3所示的DNA分子插入pTCK303载体的Spe和BamH 间得到的质粒， 即为含有正反向插入目的片段 OsFLA19F 和 OsFLA19R 的重组载体， 命名为 OsFLA19RNAi（OsFLA。

35、19RNAi 载体结构图谱如图 2 所示） 。 0051 序列3所示的DNA分子由正向片段、 内含子和反向片段组成， 正向片段为序列表中 序列 3 自 5 末端第 884-1199 位核苷酸 （即为序列表中序列 1 自 5 末端第 713-1028 的核苷 酸） ， 内含子序列表中序列 3 自 5 末端第 394-871 位核苷酸 ； 反向片段为序列表中序列 3 自 5 末端第 16-331 位核苷酸。序列 3 所示的 DNA 分子编码的 RNA 为单链 RNA 或者双链 RNA， 该 RNA 为序列表的序列 4 所示的 RNA 分子或与序列表的序列 4 反向互补的 RNA 分子。 说 明 书。

36、 CN 103923916 A 7 6/8 页 8 0052 实施例 2、 干扰 OsFLA19 编码基因表达转基因水稻的获得及表型研究 0053 一、 干扰 OsFLA19 编码基因表达转基因水稻的获得 0054 1、 干扰 OsFLA19 编码基因表达转基因水稻的获得 0055 遗传转化 ： 参照电激仪 （EasyJecT Plus 电激仪， 英国 EquiBio 公司）操作指 南， 将质粒 OsFLA19RNAi 用电击法转化农杆菌 EHA105（Biovector Co.,LTD 公司目录号 Biovec-11） ， 经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的 RNAi 工程菌， 命名为。

37、 EHA105/ OsFLA19RNAi。 0056 水稻阳性苗的筛选 ： 将 EHA105/OsFLA19RNAi 导入水稻 Kitaake（Oryza sativa L.cvKitaake， 野生型水稻） 的愈伤组织， 将该愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤 4-5 遍， 无菌滤纸吸干后转至 N6D2S1培养基 （在附表中） 上， 筛选一代。两周后， 转移至 N6D2S2 培养基 （见表 1） 上筛选二代 （2 周 / 代） 。取出经过 3 代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织， 转移 至预分化培养基 （见表 1） 上， 在分化培养箱 （12 小时光周期， 白天 28， 夜晚 25） 。

38、中培养 7 天 ； 然后转移至分化培养基上， 在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮 苗培养基 （见表 1） 上生根壮苗。待小苗长至 10 厘米左右时， 打开容器封口膜， 炼苗 2-3 天， 然后将小苗移入人工气候室栽培， 获得 7 个共 21 棵 T0 代转 OsFLA19RNAi 水稻株系。 0057 表 1 水稻组织培养和转化过程中使用的培养基及其成分 0058 说 明 书 CN 103923916 A 8 7/8 页 9 0059 0060 2、 转基因水稻的鉴定 0061 1） GUS 组织化学染色 （pTCK303 载体上有 GUS 基因） ： 将由上述 1 获得的 2。

39、1 棵 T0 代转 OsFLA19RNAi 水稻的 2-3mm 长的根段分别放到 GUS 染色液中， 抽气几分钟， 然后置于 37温育过夜， 染色后的组织用 70% 乙醇脱色。根均呈蓝色的植株即为阳性转基因材料。 GUS 染色液 （pH7.0） 组分为 ： 100mM Na3PO4(pH7.0)， 0.1%TritonX-100， 10mM EDTA， 0.5mM 亚 铁氰化钾， 0.5mM 铁氰化钾， 1mg/ml X-Gluc。结果共鉴定出 5 个株系合计 15 棵阳性 T0 代转 OsFLA19RNAi 水稻， 将此幼苗移至温室栽培， 按照不同株系收种， 得到 T1 代转 OsFLA19。

40、RNAi 水稻种子， 在次基础上经过繁种得到纯合 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻种子。在以后的实验中 选取 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻 （R1） 、（R3） 和 （R6） 的纯合种子 T2 为材料。 0062 2） 定 量 PCR 鉴 定 ：从 编 号 为 R1、 R3 和 R6 的 T2 代 转 OsFLA19RNAi 水 稻 的 幼 苗 中 提 取 mRNA， 并 分 别 转 录 获 得 cDNA（参 照 实 施 例 1 中 的 方 法） ， 以 野 生 型 水 稻 （水 稻 kitaake）为 对 照。 利 用 荧 光 实 时 定 量 PCR 法， 以 cDNA 。

41、为 模 板， 以 5 端 引 物 (10M)(5 -ACGCTGCTCCGCCTCCTCAA-3 )， 3 端 引 物 (10M) (5-GCCGTCGTAGGTGGTCTTCA-3)为引物对转基因植株中OsFLA19的表达丰度进行检测。 用于定量分析的试剂为 SYBR Green Real-time PCR Master Mix（TOYOBO） 。所用仪器为 美国 Stratagene 公司实时荧光定量 PCR 仪 Mx3000P。吸取 1l 第一链 cDNA 溶液， 稀释 50 倍作为模板， 按以下体系进行PCR反应 ： 10l SYBR Green Realtime PCRMaster 。

42、Mix,4l 模版 ,1l5端引物 1(10M)， 1l3端引物 1(10M)， 加 ddH2O 终体积 20l。 0063 用Ubiqutin作为内参， 其5端引物 ： 5-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3， 3端引 物为 ： 5 -ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3。PCR 程序为 ： 预变性 2 分钟 , 进入 PCR 循环， 循环参 数为 94 C15 秒 57 C15 秒 72 C15 秒， 共 40 个循环。 0064 结果如图 3 所示， 在 Ubiqutin 基因作为内参的情况下， 与野生型水稻 （WT） 相比， R1、 R3和R6的T2代转OsFLA19。

43、RNAi水稻幼苗中OsFLA19的表达丰度有了不同程度的下调， 说明目的基因连接的载体已经成功转入水稻， 其干扰了水稻中 OsFLA19 基因的表达。 0065 采用同样的方法将空载体 pTCK303 转入野生型水稻中， 得到转空载体水稻， 播种 收种直到得到 T2 代转空载体水稻， 采用上述定量 PCR 鉴定， 结果与野生型无显著差异。 0066 二、 干扰 OsFLA19 编码基因表达转基因水稻的表型研究 0067 将野生型水稻、 编号为 R1 和 R6 的 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻和 T2 代转空载体水 稻的种子播在花卉营养土和蛭石的混合物里 （两者的混合比例为 9:1）。

44、 ， 30萌发后放在温 室里 （25） 培养至三叶期， 经过室外壮苗后， 5 月中旬移栽到室外水稻网室中进行培养至 抽穗期。 0068 每个株系 8 株， 实验重复三次， 结果取平均值。 0069 观察叶夹角 （剑叶夹角和剑叶下第一叶夹角） 发育表型结果如下 ： 0070 拍照观察， 结果如图 4A， 其中野生型水稻 WT（Kitaake） 、 T2 代转 OsFLA19RNAi 水 稻 （R1、 R6） ， 可以看到 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻明显的叶夹角变大的表型。 0071 在播种后约 80 天统计叶夹角 （剑叶夹角为剑叶与茎秆的夹角 ； 剑叶下第一叶夹 角为剑叶下第一叶与。

45、茎秆的夹角） ， 野生型水稻剑叶夹角、 剑叶下第一叶夹角分别为 41.0、 说 明 书 CN 103923916 A 9 8/8 页 10 28.8（度） ； 编号为 R1 的 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻叶夹角、 剑叶下第一叶夹角分别为 80.0、 50.0（度） ， 编号为 R6 的 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻 R6 叶夹角、 剑叶下第一叶夹角分别为 56.0、 34.0（度） 。 0072 计算相对叶夹角， 相对叶夹角为 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻与野生型叶夹角的比 值， 将野生型水稻叶夹角记作 1， 结果如图 4B 所示， 可以看出， 野生型水稻。

46、的剑叶相对叶夹 角、 剑叶下第一叶相对叶夹角和剑叶下第二叶的相对叶夹角均为 1， 编号为 R1 的 T2 代转 OsFLA19RNAi水稻的剑叶相对叶夹角、 剑叶下第一叶相对叶夹角为1.95、 1.74， 编号为R6的 T2 代转 OsFLA19RNAi 水稻的剑叶相对叶夹角、 剑叶下第一叶相对叶夹角为 1.37、 1.18。T2 代转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。 0073 说明干扰水稻 OsFLA19 基因的表达可以提高叶夹角。 说 明 书 CN 103923916 A 10 1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103923916 A 11 2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 103923916 A 12 3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 103923916 A 13 4/4 页 14 序 列 表 CN 103923916 A 14 1/2 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103923916 A 15 2/2 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 103923916 A 16 。