一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103923899 A (43)申请公布日 2014.07.16 CN 103923899 A (21)申请号 201410160095.3 (22)申请日 2014.04.21 CGMCC NO. 8913 2014.03.12 C12N 9/88(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12P 19/26(2006.01) A61K 47/42(2006.。

2、01) (71)申请人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 李福川 韩文君 王文爽 赵梅 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 朱家富 (54) 发明名称 一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基 因与应用。糖胺聚糖裂解酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示 ； 糖胺聚糖裂解酶的编码基因的核 苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； 本发明制备的糖 胺聚糖裂解酶对透明质酸的比活为 110,000U/ mg、 对硫酸软骨素的比活为 45,000U/m。

3、g ； 酶活力 是已知商品化糖胺聚糖裂解酶 （如， CSaseABC、 CSaseAC I 和 II 等） 的几十到数百倍， 可应用于医 药及化妆品等领域， 具有广阔的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 11 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表11页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103923899 A CN 103923899 A 1/1 页 2 1. 一种糖胺聚糖裂解酶， 其特征在于， 氨基酸序列如 （a） 或 （b） 所示 ： （a） 氨基。

4、酸序列如 SEQ ID NO.2 所示 ； （b） 在 （a） 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖胺聚糖裂 解酶活性的由 （a） 衍生的蛋白质。 2. 如权利要求 1 所述的糖胺聚糖裂解酶， 其特征在于， 所述氨基酸序列 （b） 如 SEQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.4 所示。 3. 一种糖胺聚糖裂解酶的编码基因， 其特征在于， 核苷酸序列如 （i） 或 （ii） 所示 ： （i） 核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； （ii） 在严格条件下与 （i） 限定的 DNA 序列杂交且编码具有糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白 质的 DNA 分子。 4. 如权。

5、利要求 3 所述的编码基因， 其特征在于， 所述核苷酸序列 （ii） 中所述严格条件 下， 是指 ： 在含0.5%SDS的6SSC缓冲液中， 在65下杂交， 然后用含0.1%SDS的2SSC缓冲液 和含 0.1%SDS 的 1SSC 缓冲液各洗膜一次。 5. 如权利要求 4 所述的编码基因， 其特征在于， 所述核苷酸序列 （ii） 如 SEQ ID NO.5 或 SEQ ID NO.6。 6. 一种重组表达载体， 在表达载体中插入了权利要求 3 所述的糖胺聚糖裂解酶的编码 基因。 7. 如权利要求 6 所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述表达载体选自大肠杆菌表达 载体、 酵母表达载体、 枯。

6、草杆菌表达载体、 乳酸菌表达载体、 链霉菌表达载体、 噬菌体载体、 丝状真菌表达载体、 植物表达载体、 昆虫表达载体、 或哺乳动物细胞表达载体。 8. 一种重组菌或转基因细胞系， 在宿主细胞或细胞系中插入了权利要求 3 所述的糖胺 聚糖裂解酶的编码基因。 9. 如权利要求 8 所述的重组菌或转基因细胞系， 其特征在于， 所述宿主细胞或细胞系 选自大肠杆菌宿主细胞、 酵母菌宿主细胞、 枯草杆菌宿主细胞、 乳酸菌宿主细胞、 放线菌宿 主细胞、 丝状真菌宿主细胞、 昆虫细胞或哺乳动物细胞。 10. 权利要求 1 所述糖胺聚糖裂解酶在糖胺聚糖类寡糖制备及其自身作为增强药物的 吸收或递送成分在制备药物中。

7、的应用。 权 利 要 求 书 CN 103923899 A 2 1/9 页 3 一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用， 属于基因工程技术领域。 背景技术 0002 糖胺聚糖 （Proteoglycans， GAG）又称为粘多糖， 是重复二糖单位组成的直链多 糖。主要包括透明质酸 （Hyaluronic Acid， HA） ， 肝素 / 硫酸乙酰肝素 （Heparin/Heparan Sulfate， Hep/HS） ， 硫酸软骨素 / 硫酸皮肤素 （Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate， C。

8、S/DS） ， 硫酸角质素 （Keratan Sulfate， KS） 。 除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳 糖和 N- 乙酰葡糖胺组成以外， 其它糖胺聚糖的二糖单位均是由己糖醛酸 （D- 葡萄糖醛酸 / L- 艾杜糖醛酸） 与己糖胺 （N- 乙酰氨葡萄糖胺 /N- 乙酰半乳糖胺） 组成。其中透明质酸结 构相对简单， 由 D- 葡萄糖醛酸和 N- 乙酰葡糖胺组成的二糖单位经 -1,4- 糖苷键连接而 成。其它糖胺聚糖则由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂， 主要表现在糖链中不同 部位羟基 （-OH） 和氨基 （-NH2） 的硫酸化， D- 葡萄糖醛酸在 C5- 差向异构酶的作用下转变。

9、为 L- 艾杜糖醛酸， 己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖糖链结构的这种高度复杂性不是随 机发生的， 而是具有高度的时空特异性， 是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的 不同发育阶段表达调控水平所致， 不同的结构使其具有不同的功能， 结构的复杂性赋予其 功能的多样性。 0003 糖胺聚糖广泛存在于动物细胞细胞表面和细胞基质中， 通过与各种蛋白的特异相 互作用参与了细胞的增值和分化、 细胞间的识别、 细胞转移、 组织形态发生、 癌变等各种生 理和病理过程 (Knudson and Knudson1993,Perrimon and Bernfield2000,Karbownik and Now。

10、ak2013) 糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子， 在 医药及功能食品中得到广泛应用， 如肝素、 硫酸软骨素、 透明质酸 (Noble2002,Jiang,Liang et al.2007) 等。但由于糖胺聚糖结构的不均一性， 特别是硫酸化糖胺聚糖结构的高度复 杂性， 使不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上存在很大差异 (Sugahara,Mikami et al.2003)。近年来的大量研究表明， 糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结 构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的， 同一多糖链中存在不同结构的功能区， 与不同的蛋白相互作用可以行使不同。

11、的功能， 因此可以通过选择性部分降解糖胺聚糖多糖 链， 制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖用于医药及功能食品， 该类产品不但结构 和活性确定， 而且还由于分子量小利于吸收而大大提高了利用率。 0004 糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖构效关系的重要工具酶， 主要包括微生物来源的 裂解酶系和动物来源的水解酶系。根据底物的不同可分为透明质酸酶、 硫酸软骨素 / 硫酸 皮肤素降解酶、 肝素 / 硫酸乙酰肝素降解酶、 硫酸角质素降解酶四大类， 其中大部分透明质 酸酶可以同时降解非硫酸化及 N- 乙酰半乳糖胺 4 位 （CS-A） 或 6（CS-C） 位羟基硫酸化的 低硫酸化度硫酸软骨素区段， 但降解速。

12、度远低于降解透明质酸。如来自绵羊和牛睾丸的透 明质酸水解酶 (Zaneveld,Polakoski et al.1973)， 可以在酸性 PH 下将透明质酸完全降解 为四糖和六糖。而来自链霉菌的透明质酸裂解酶则只能降解透明质酸， 终产物是非还原端 说 明 书 CN 103923899 A 3 2/9 页 4 带不饱和双键的四糖和六糖 (Ohya and Kaneko1970)。在动物体内一直未发现专一的硫酸 软骨素/硫酸皮肤素降解 酶家族， 越来越多的研究显示哺乳动物体内硫酸软骨素/硫酸皮 素的降解主要是由透明质酸酶家族的一些酶来完成的， 最近透明质酸酶家族成员 HYAL4 被 鉴定为一个硫酸。

13、软骨素水解酶 (Yamada,Sugahara et al.2011)。微生物来源的硫酸软骨 素裂解酶 （CSase） ， 如 CSase ABC 和 CSaseAC 都表现出一定的透明质酸降解活性， 但 CSase B 是高度专一性硫酸皮肤素降解酶， 对硫酸软骨素和透明质酸均无降解活性。利用各种糖 胺聚糖降解酶所具有的不同底物选择性和产物多样性， 可以对结构复杂的糖胺聚糖进行组 成结构和功能研究， 结合各种分离分析手段对多糖链中与靶蛋白结合的特定功能区进行鉴 定， 并最终用于高活性药用及功能寡糖的酶法制备。 0005 糖胺聚糖作为胞外基质的主要组成成分构成了细胞与外界的一道防护屏障， 保 护。

14、机体细胞免受损伤， 但是在疾病治疗中， 致密的胞外基质抑制了药物在组织中的通透性 和有效扩散， 降低了药物的起效时间和疗效， 尤其是对一些大分子药物， 如胰岛素和抗体 等蛋白类药物。多年来， 透明质酸酶被广泛应用于临床， 目前有三种美国食品与药品管理 局 （FDA） 批准的商品化透明质酸酶可以利用， 分别是牛睾丸来源的 Amphadase， 绵羊睾丸 来源的 Vitrase， 和近来刚上市的人重组透明质酸酶 Hylenex。临床上透明质酸酶的主要 用途包括 ： 作为助剂促进其它药物的吸收和扩散 (Schuller,Castonguay et al.1991) ； 用于液体皮下灌注 ； 用于透明。

15、质酸填充整形手术意外中透明质酸的降解消除 ； 用于治疗 与糖胺聚糖代谢紊乱蓄积相关的顽固性皮肤病， 如糖尿病性硬肿症、 硬皮病、 瘢痕疙瘩 等 (PCT publications WO00/38732 ； WO01/45743;and German Patent No.19963538) (Lee,Grummer et al.2010)。此外， 大量报道证明， 硫酸软骨素酶 CSase ABC 可以通过降解 硫酸软骨素促进神经损伤中神经元轴突再生 (Moon,Asher et al.2001,Bradbury,Moon et al.2002,Kwok,Afshari et al.2008,Br。

16、adbury and Carter2011)。 0006 综上所述， 糖胺聚糖降解酶不仅是糖胺聚糖结构功能研究必不可少的工具， 而且 在糖胺聚糖活性寡糖制备和疾病治疗中有着重要的应用价值。 但目前具有应用价值的高活 力糖胺聚糖降解酶很少， 因此寻找和鉴定新型高效稳定的糖胺聚糖降解酶具有重要意义。 发明内容 0007 本发明针对现有技术的不足， 提供一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。 0008 一种糖胺聚糖裂解酶， 氨基酸序列如 （a） 或 （b） 所示 ： 0009 （a） 氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示 ； 0010 （b） 在 （a） 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一。

17、个或几个氨基酸且具有糖胺聚 糖裂解酶活性的由 （a） 衍生的蛋白质。 0011 根据本发明优选的， 所述氨基酸序列 （b） 如 SEQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.4 所示。 0012 一种糖胺聚糖裂解酶的编码基因， 核苷酸序列如 （i） 或 （ii） 所示 ： 0013 （i） 核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； 0014 （ii） 在严格条件下与 （i） 限定的 DNA 序列杂交且编码具有糖胺聚糖裂解酶活性的 蛋白质的 DNA 分子。 0015 根据本发明优选的， 所述核苷酸序列 （ii） 中所述严格条件下， 是指 ： 0016 在含0.5%SDS的6SSC缓冲液中。

18、， 在65下杂交， 然后用含0.1%SDS的2SSC缓 说 明 书 CN 103923899 A 4 3/9 页 5 冲液和含 0.1%SDS 的 1SSC 缓冲液各洗膜一次。 0017 根据本发明进一步优选的， 所述核苷酸序列 （ii） 如 SEQ ID NO.5 或 SEQ ID NO.6。 0018 一种重组表达载体， 在表达载体中插入了上述糖胺聚糖裂解酶的编码基因。 0019 上述表达载体选自大肠杆菌表达载体、 酵母表达载体、 枯草杆菌表达载体、 乳酸菌 表达载体、 链霉菌表达载体、 噬菌体载体、 丝状真菌表达载体、 植物表达载体、 昆虫表达载 体、 或哺乳动物细胞表达载体。 0020。

19、 一种重组菌或转基因细胞系， 在宿主细胞或细胞系中插入了上述糖胺聚糖裂解酶 的编码基因。 0021 上述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、 酵母菌宿主细胞、 枯草杆菌宿主 细胞、 乳酸菌宿主细胞、 放线菌宿主细胞、 丝状真菌宿主细胞、 昆虫细胞或哺乳动物细胞。 0022 用于重组表达糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的重组菌或转基因细胞系， 可以是大肠 杆 菌 宿 主 细 胞 （如 Escherichia coli BL21、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli DH5 等） 、 酵 母 菌 宿 主 细 胞 （如 Saccharomyces cer。

20、evisiae、 Pichia pastoris、 Kluyveromyces Iactis 等） 、枯 草 杆 菌 宿 主 细 胞 （如 Bacillus subtilis R25、 Bacillus subtilis9920 等） 、乳 酸 菌 宿 主 细 胞 （如 Lactic acid bacteria C0CC101 等） 、 放线菌宿主细胞 （如 Streptomyces spp. 等） 、 丝状真菌宿主细胞 （如 Trichoderma viride,Trichoderma reesei,Aspergillus niger、 Aspergillus nidulans 等） 、 昆。

21、虫细胞 （如 Bombyxmori,Antharaea eucalypti 等） 或哺乳动物细胞 （如中国仓鼠卵巢细胞 CHO, 幼 小仓鼠肾脏细胞 BHK、 中国仓鼠肺细胞 CHL 等） 。 0023 上述糖胺聚糖裂解酶做为增强药物的吸收或递送成分在制备药物中的应用。 0024 有益效果 0025 本发明制备的糖胺聚糖裂解酶对透明质酸的比活为 110,000U/mg、 对硫酸软骨素 的比活为 45,000U/mg ； 酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶 （如， CSaseABC、 CSaseAC I 和 II 等） 的几十到数百倍， 可应用于医药及化妆品等领域， 具有广阔的应用前景。 附图说明。

22、 0026 图 1、 糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的蛋白质三维结构模型 ； 0027 图 2、 重组糖胺聚糖裂解酶 HCDase 表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 (SDS-PAGE) ； 0028 其中 ： M、 蛋白质分子量标准， 条带自上至下大小为 116kD， 66.2kD， 45kD， 35kD， 25kD， 18.4kD， 14.4kD ； 泳道 1、 对照菌株破壁前菌体， 上样量 10L， 泳道 2、 重组菌破壁前菌 体， 上样量 10L， 泳道 3、 重组菌破壁后上清， 上样量 10L， 泳道 4、 经镍柱纯化的 HCDase， 上样量 10L。 0029 图 3、 p 。

23、值对糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的活性影响曲线 ； 0030 图 4、 温度对糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的活性影响曲线 ； 0031 图 5、 温度对糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的稳定性影响曲线 ； 0032 图 6、 pH 值对糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的稳定性影响曲线 ； 0033 图 7、 金属离子对糖胺聚糖裂解酶 HCDase 活性的影响柱形图 ； 0034 图 8、 糖胺聚糖裂解酶 HCDase 降解透明质酸和硫酸软骨素所得产物的 HPLC 分析 说 明 书 CN 103923899 A 5 4/9 页 6 图 ； 0035 图 9、 糖胺聚糖裂解酶 HCDase 不同时。

24、间降解透明质酸所得产物的 HPLC 分析图。 具体实施方式 0036 以下实施例的阐述， 是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术， 而不是为 了限制本发明的应用范围。 发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性 （例如量， 温度， 等等） ， 但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明， 本发明中分子量 是指重均分子量， 温度是摄氏度。 0037 实施例 1、 糖胺聚糖裂解酶的获得 0038 挑取弧菌 （Vibrio sp.） FC509 菌株接种到 100mL 液体培养基中， 在温度为 28、 转数为200rpm的条件下， 摇床培养12小时， 加入硫酸软骨素使质量浓度达到0.。

25、01%， 继续培 养 48h ； 将培养液离心收集上清培养基， 上清用终浓度为 80% 的硫酸铵沉淀， 收集沉淀， 沉淀 用 PBS 缓冲液进行透析去除硫酸铵， 制得糖胺聚糖裂解酶。 0039 上述弧菌 （Vibrio sp.） FC509， 2014 年 03 月 12 日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏编号CGMCC NO.8913， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所。 0040 上述液体培养基每升组分如下 ： 0041 硫酸软骨素 5g、 胰蛋白胨 10g、 酵母提取物 5g、 NaCl30g、 KH2PO43g、 K2HPO47。

26、g、 (NH4)2SO42g、 MgSO47H205mg、 FeSO47H202mg， pH 值为 7.2。 0042 酶活力单位定义 ： 每分钟催化糖胺聚糖产生 1moL 不饱和双键所需要的酶量。 根据紫外法测糖胺聚糖裂酶酶活的方法 (Yamagata,Saito et al.1968)， 测得 Vibrio sp.FC509 菌株的液体培养基中酶活为 3,000U/mL。 0043 实施例 2、 弧菌 （Vibrio sp.） FC509 菌株基因组 DNA 的提取 0044 将弧菌 （Vibrio sp.） FC509 菌株接种至液体培养基 （同实施例 1）中， 在 30、 200rpm。

27、 的条件下， 振荡培养至 OD600=0.8 ； 取培养菌液 40mL， 在 12,000rmp 条件下离心 25min， 收集菌体沉淀， 用 20mL 的溶菌酶缓冲液 （10mM Tris-HCl pH8.0） 洗涤， 在 12,000rmp 条件下离心 25min， 收集菌体沉淀 ； 0045 上述菌体沉淀中， 每管加入溶菌酶缓冲液 12.0mL， 得到约 14.0mL 的菌液， 分别加 入浓度为 20mg/mL 的溶菌酶各 560L， 其终浓度约 800g/mL ； 冰浴 1.0h 后， 37温浴 2h， 至溶液粘稠 ； 加入 10wt%SDS0.82mL， 100mg/mL 的蛋白酶 。

28、K 溶液 60L， 52水浴 1.0h ； 加 入 Tris- 平衡过的酚 / 氯仿 / 异戊醇 （体积比 25 ： 24 ： 1） 15mL， 轻轻颠倒混匀， 至充分乳化 ； 10,000g、 4条件下离心 10min， 转移上清， 加入 2.0mL 的 NaAc-HAc（pH5.2， 3.0M） 缓冲液， 以及 17.0mL 的无水乙醇， 混匀 ； 用 1.0mL 的枪头挑出丝状 DNA， 转移至 1.5mL 的 EP 离心管 中， 以 70% 乙醇 （贮于 -20） ， 洗涤 2 次， 微离心后弃上清 ； 10,000g、 4条件下离心 3min， 彻底弃掉上清 ； 样品于无菌工作台中，。

29、 酒精灯下风吹干燥 ； 用无菌去离子水重悬溶解 DNA 样 品， 4过夜， 得到大分子量基因组 DNA。 0046 实施例 3、 弧菌 （Vibrio sp.） FC509 菌株基因组扫描及其序列分析。 0047 将实施例 2 制得的大分子量基因组 DNA 进行测序 （美吉生物公司） 。用 NCBI （National Center for Biotechnology Information,http:/www.ncb1.nlm.nih.gov/） 说 明 书 CN 103923899 A 6 5/9 页 7 上的软件对测序结果进行分析。所用到的 NCBI 分析软件是 Open Reading。

30、 Frame Finder （ORF Finder,http:/www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 和Basic Local Alignment Search Tool（BLAST,http:/blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 。 0048 NCBI 分析结果显示 Vibrio sp.FC509 菌株基因组上携带一个糖胺聚糖裂解酶基 因 hcdase， hcdase 基因编码区长 2436bp， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。与 Vibrio fischeri ES114 的全基因组序列 （NCBI 注册号。

31、 ： YP_206952.1） 中 hyaluronate lyase 基 因的 384 个氨基酸有 49% 的同源性。 0049 hcdase 基因编码的糖胺聚糖裂解酶 HCDase 由 778 个氨基酸组成， 其氨基酸序列 如 SEQ ID NO.2 所示， 蛋白质的理论分子量约为 89kD。用 Simple Modular Architecture Research Tool （SMART,http:/smart.embl_heidelberg.de/） 分析糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的结构信息， 结果显示 N 端第 1 至第 22 个氨基酸是信号肽序列， 第 23-778 位氨基酸。

32、序列属 于糖胺聚糖裂解酶超家族。 用SWISS-MODEL同源建模服务器 （http:/swissmodel.expasy. org） 对糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的蛋白质三维结构进行同源建模， 最终得到的 HCDase 蛋白 质三维结构模型如图 1 所示。 0050 在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且编码具有糖胺聚糖裂解酶活性的蛋 白质的 DNA 分子， 如核苷酸序列如 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示的 DNA 分子。 0051 将核苷酸序列如 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示的 DNA 分子在含 0.5%SDS 的 6SSC。

33、 缓冲液 （购自康为世纪公司） 中， 在 65下杂交， 然后用含 0.1%SDS 的 2SSC 缓冲液 和含 0.1%SDS 的 1SSC 缓冲液各洗膜一次。 0052 上述 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示的 DNA 分子编码的蛋白质分子， 氨基酸序列 如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示， 其中SEQ ID NO.3的蛋白质分子与SEQ ID NO.2所示 的蛋白质分子相比， 具有 2% 的区别 （氨基酸的替代） ， SEQ ID NO.4 的蛋白质分子与 SEQ ID NO.2 所示的蛋白质分子相比， 具有 3% 区别 ( 氨基酸的替代、 缺失、 插。

34、入 )。 0053 实施例 4、 HCDsae 基因在大肠杆菌中的重组表达 0054 以实施例 2 制得的大分子量基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增。引物如下 ： 0055 正向引物 HCDase-F ： GCCATGGATATGCAAGCGATGACCACCAGTTCACTG ； 0056 反向引物 HCDase-R ： GCTCGAGTCGCACTGAAAATTGATAACTTTGTCC ； 0057 正向引物下划线标注的是限制性内切酶 Nco I 位点， 反向引物下划线标注的是限 制性内切酶 Xho I 位点。Primerstar HS DNA 聚合酶购自宝生物公司， PCR 。

35、反应体系按照公 司提供的产品说明操作。 0058 PCR反应条件 ： 94预变性5min ； 94变性30s， 681.5min， 35个循环 ； 72延伸 10min。 0059 将 PCR 产物用 Nco I 和 Xho I 双酶切， 琼脂糖凝胶电泳回收酶切的 PCR 产物。将 购于美国 Novagen 公司的产物 pET-22b 载体用 Nco I 和 Xho I 双酶切， 琼脂糖凝胶电泳回 收酶切载体大片段。Nco I 和 Xho I 均购于宝生物公司， 酶与底物反应的体系、 温度和时间 均按照公司提供的产品说明操作。 0060 将经过双酶切的 PCR 产物与同样经过双酶切 pET-2。

36、2b 载体连接， 连接产物转 化大肠杆菌 DH5 菌株后涂布于含有 50g/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani 培养基 固体平板上 ,37培养 14h， 挑取单克隆 ； 将单克隆接入含有 50g/mL 氨苄青霉素的液 说 明 书 CN 103923899 A 7 6/9 页 8 体 Luria-Bertani 培养基中培养， 提取质粒 ； 将质粒用正向引物 HCDase-F 和反向引物 HCDase-R 进行菌液 PCR 验证， 结果得到大小正确的扩增产物， 初步证明构建的重组质粒正 确 ； 接着将该重组质粒送去生工生物公司测序， 结果表明， 在 pET-22b 的 Nco I 和。

37、 Xho I 酶 切位点之间插入 SEQ ID NO.1 所示的 hcdsae 基因， 且插入方向正确， 所以进一步证明构建 的重组质粒正确， 将该重组质粒命名为 pET22b-HCDase。 0061 将 pET22b-HCDase 转化大肠杆菌菌株 BL21(DE3)（购自美国 Novagen 公司） ， 然后按照该公司提供的操作步骤进行重组糖胺聚糖裂解酶 HCDase 诱导表达。并用 Ni Sepharose6Fast Flow（GE） 凝胶对 HCDase 进行纯化， 纯化条件按照 GE 公司的产品手册操 作。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的纯化情况， 结果。

38、如图 2 所 示， 纯化后的重组糖胺聚糖裂解酶 HCDase 在电泳胶上呈单一条带， 且位置与预测的分子量 相吻合。 0062 实施例 5、 重组糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的酶学性质分析 0063 pH 和温度对酶活性的影响 0064 将质量浓度为 1% 透明质酸或硫酸软骨素底物、 HCDase 酶液、 不同 pH 值的 150mM HAc-NaAc、 NaH2PO4-Na2HPO4、 Tris-HCl 缓冲液以及水 （pH 范围为 5.0 10.0） ， 按 2 ： 1 ： 3 ： 4 （体积比） 的比例混合后， 在 30反应 60min， 按前述的紫外法测酶活力。结果显示 HCDsae。

39、 在 pH8.0 时达到最大活力， 表明 HCDase 的最适反应 pH 为 8.0（如图 3） 。 0065 在最适 pH 下， 将质量浓度为 1% 透明质酸或硫酸软骨素底物、 HCDase 酶液以及 150mM NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液 （pH8.0） 按 2 ： 1 ： 3 ： 4（体积比） 的比例混合， 分别在不同温度 （0 90） 反应 10min， 按前述的紫外法测酶活力。结果显示 HCDase 在 30时达到最大 活力， 表明 HCDase 的最适反应温度为 30（如图 4） 。 0066 pH 和温度对酶稳定性的影响 0067 将在不同温度 （0 70） 下热处理 。

40、1h 后的 HCDase 酶液与质量浓度为 1% 透明 质酸或硫酸软骨素底物溶液按 2 ： 3（体积比） 的比例混合， 然后在最适温度和最适 pH 下测 定剩余酶活， 以不经过热处理的酶液酶活定义为 100% 相对活力 （relativie activity） , 结 果表明 HCDase 在低于 60的温度下具有较好的热稳定性 （如图 5） 。 0068 将在 30， 不同的 pH （pH5 10） 预孵育 1h 后的 HCDase 酶液与质量浓度为 1% 透 明质酸或硫酸软骨素底物溶液按 2 ： 3（体积比） 的比例混合， 然后在最适温度和最适 pH 下 测定剩余酶活， 以不经过pH处理的。

41、酶液酶活定义为100%相对活力 （relativie activity） , 结果显示在 pH5-9 的范围内， HCDase 酶活仍保持 60% 以上， 表明 HCDase 对 pH 值耐受范围 较广 （如图 6） 。 0069 金属离子对 HCDsae 活性的影响 0070 将质量浓度为 1% 透明质酸或硫酸软骨素底物、 HCDase 酶液、 150mM Tris-HCl 缓 冲液以及水按 2 ： 1 ： 3 ： 4（体积比） 的比例混合后， 接着向反应体系中添加不同的金属离子， 添加的离子终浓度为 1mM 或 10mM， 然后在 30反应 60min， 按前述的紫外法测酶活力。对 照组为。

42、不加任何金属离子时 HCDase 的活性 （设定为 100%） ， 结果图 7 所示。实验结果显示， K+、 Na+、 Fe2+、 Mn2+能增加 HCDase 活性， Li+、 Mg2+、 Co2+、 Ni2+、 Cr3+、 Fe3+对 HCDase 活性基本无 影响， Ag+、 Cu2+、 Ca2+、 Fe2+、 Hg2+、 Pb2+、 Zn2+等其他离子对酶活呈现抑制作用 （图 7） 。 0071 实施例 6、 HCDase 的酶活测定 说 明 书 CN 103923899 A 8 7/9 页 9 0072 将质量浓度为 1% 透明质酸或硫酸软骨素底物、 HCDase 酶液、 150mM。

43、 Tris-HCl 缓 冲液以及水按 2 ： 1 ： 3 ： 4（体积比） 的比例混合后， 在最适温度和最适 pH 下反应 2-10min， 按前述的紫外法测酶活力 (Yamagata,Saito et al.1968)， 同时用购于康为世纪公司的蛋 白质定量试剂盒测定 HCDase 酶液的蛋白含量， 结果表明重组 HCDase 对透明质酸的比活为 110,000U/mg、 对硫酸软骨素的比活为 45,000U/mg。 0073 SEQ ID NO.3所示的蛋白对透明质酸的比活为100,000U/mg、 对硫酸软骨素的比活 为 40,000U/mg ； 0074 SEQ ID NO.4 所示的。

44、蛋白对透明质酸的比活为 89,000U/mg、 对硫酸软骨素的比活 为 37,000U/mg ； 0075 实施例 7、 HCDase 降解糖胺聚糖降解产物的高效液相 （HPLC） 分析 0076 将质量浓度为1%透明质酸或硫酸软骨素底物、 HCDase酶液、 150mM Tris-HCl缓冲 液以及水按 2 ： 1 ： 3 ： 4（体积比） 的比例混合后， 在 pH8.0， 30条件下反应， 选取不同酶解时 间 （0、 0.25、 1、 5、 15、 30、 120min） 的产物进行 HPLC 分析。HPLC 分析条件为凝胶柱 ： superdex peptide10/300GL（GE） 。

45、； 流动相 ： 0.2M 碳酸氢铵 ； 流速 ： 0.4mL/min ； 检测条件 ： UV232nm。 0077 结果如图 8 和图 9 所示， 从图 9 可以看出随着降解时间的增加， 产物聚合度随降解 时间的延长而快速降低， 最终转变成二糖。该结果表明 HCDase 属于内切糖胺聚糖裂解酶， 可被用于糖胺聚糖寡糖的制备以及糖胺聚糖构效关系研究。 0078 实施例 8、 糖胺聚糖裂解酶 HCDase 在药物中的应用 0079 糖胺聚糖裂解酶 HCDase 可以用于增强药物的吸收或 / 和递送， 包括但不限于经 过皮肤途径辅助药物渗透。示例性的药物包括皮质类固醇如氢化可的松、 泼尼松龙、 倍氯。

46、 米松丙酸酯、 氟米松、 去炎松、 氯倍他索丙酸酯等 ； 镇痛药和 / 或抗炎剂如对乙酰氨基酚、 甲 灭酸、 氟芬那酸、 双氯芬酸、 双氯芬酸钠、 阿氯芬酸、 羟布宗、 保泰松、 布洛芬、 氟比洛芬、 水杨 酸、 薄荷醇、 樟脑、 萘普生等 ； 抗高血压药如吲哚洛尔、 茚诺洛尔、 心痛定等 ； 抗生素如青霉 素、 四环素、 土霉素、 新霉素、 红霉素、 氯霉素等 ； 麻醉剂如利多卡因、 苯佐卡因等以及其他药 物。 0080 通过敷布， 纱布， 或其它皮肤涂抹途径施用糖胺聚糖裂解酶。 糖胺聚糖裂解酶溶液 可以涂敷到合适的敷贴上 （如 5-6 层纱布） 。敷贴应覆盖受损区域， 且敷贴本身用蜡纸或绷。

47、 带固定。应用的制剂的量取决于损伤的面积， 通常为 5-100IU/cm2。敷贴应每天使用 12-24 小时， 连续使用 10-100 天。 0081 对于局部使用， 溶液， 悬浮液， 凝胶剂， 糊剂， 软膏， 乳膏或糖胺聚糖裂解酶的其他 配方 （有或没有另外的活性剂， 都可以使用） 。溶液等配方中包含制药和化妆品领域用于局 部使用可接受的稀释剂， 辅助剂和赋形剂的， 这些其它配方主要包括缓冲剂如磷酸盐， 柠檬 酸盐， 醋酸盐和其它有机酸盐、 抗氧化剂如抗坏血酸、 肽、 蛋白质如血清白蛋白， 明胶或免疫 球蛋白 ； 亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮， 天然的或合成的油 ； 氨基酸如甘氨酸， 谷氨酸。

48、， 天冬氨酸， 或精氨酸 ； 单糖， 二糖和其它碳水化合物， 包括纤维素或其衍生物， 葡萄糖， 乳糖， 甘露糖或糊精 ； 螯合剂如 EDTA ； 糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇 ； 无机盐， 如氯化钠， 和非离子 表面活性剂如吐温、 聚乙二醇。 0082 一种优选的， 糖胺聚糖裂解酶制剂是糖胺聚糖裂解酶 HCDase 的冻干粉末悬浮或 溶解在含有 0.1 -10蔗糖、 1 -20甘油的溶剂中， 溶液的 pH 保持在 6.5-8.5 范围内。 说 明 书 CN 103923899 A 9 8/9 页 10 0083 糖胺聚糖裂解酶组合物可以通过口服给药或肠胃外给药， 并且糖胺聚糖裂解酶组 合物可以与合。

49、适的递送载体结合后给药。 0084 可通过活性化合物与固体赋形剂的组合获得用于口服使用的糖胺聚糖裂解酶药 物制剂。选择上述的混合物加入合适的附助剂混合使用。如果需要的话， 合适的赋形剂是 碳水化合物或蛋白质， 例如糖、 纤维素、 牛血清白蛋白等。 0085 糖胺聚糖裂解酶酶与药物 （如氢化可的松， 抗生素， 维生素） 组合。以口服凝胶剂， 膏剂， 或悬浮液的形式通过静脉内， 皮下或肌内注射给药 ； 或以软膏剂， 乳膏剂， 面罩局部给 药 ； 以及用作化妆品辅助剂， 用于增强皮肤的吸收。 0086 说明书中涉及的参考文献 0087 1、Bradbury,E.J.and L.M.Carter(2011).Manipulating the glial scar:Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury.Brain Research Bulletin84(4-5):306-316. 0088 2、 Bradbury,E.J.,et al.(2002).Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.Nature416(6881):636-640. 0089 3、 Jiang,D.,et。