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1、(10)申请公布号 CN 103865850 A (43)申请公布日 2014.06.18 CN 103865850 A (21)申请号 201410093180.2 (22)申请日 2014.03.14 CCTCC M 2013638 2013.12.08 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/24(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 张龙涛 欧洋 曾绍校 郑宝东 张怡 黄旭辉 曾诚 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 。
2、蔡学俊 (54) 发明名称 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 (57) 摘要 本发明涉及一株蝙蝠弧菌 （Vampirovibrio sp.） fjfst-2013001， 已于 2013 年 12 月 8 日在中 国典型培养物保藏中心登记保藏， 其保藏编号为 CCTCC M 2013638， 以及用该菌株发酵制备琼胶酶 的方法。本发明以该菌株作为菌种， 采用碳源、 氮 源、 无机盐组成的发酵培养基， 在优化后的培养条 件下， 琼胶酶的活力达到 4.17U/ml。发酵液通过 硫酸铵进行盐析， 离心收集沉淀， 后进行透析， 取 透析液过离子交换柱及凝胶柱， 冷冻干燥即可获 得琼胶酶干粉。 (83)生。
3、物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103865850 A CN 103865850 A 1/1 页 2 1. 一株蝙蝠弧菌， 其特征在于 ： 所述的菌株为蝙蝠弧菌 （Vampirovibrio sp.） fjfst-2013001， 已于 2013 年 12 月 8 日在中国典型培养物保藏中心登记保藏， 其保藏编号 为 CCTCC M 2013638。 2. 根据权利要求 1 所述的一株蝙蝠弧菌， 其特征在于 ： 所。
4、述蝙蝠弧菌的 16S rRNA 的序 列如 SEQ ID NO.1 所示。 3. 一种如权利要求 1 所述的一株蝙蝠弧菌的用途， 其特征在于 ： 所述菌株用于制备琼 胶酶。 4. 一种如权利要求 1 所述的一株蝙蝠弧菌用于制备琼胶酶的方法， 其特征在于 ： 所述 方法包括如下步骤 ： （1） 用250mL锥形瓶装20-60mL种子培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并接种菌落， 接种 后于 20-30， 80-140rpm 摇床培养 12-24h 后得到种子发酵液 ； （2） 用 250mL 锥形瓶装 20-60mL 发酵培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并按 2%-10% 的接 种量， 将。
5、种子发酵液接入发酵培养基， 20-30培养 24-60h 后得到含琼胶酶的发酵液 ； （3） 而后将发酵培养基经过 4， 8000-10000g 冷冻离心 10-20min 之后， 取上清液 ； （4） 将上清液加入质量分数为 60%-80% 的饱和硫酸铵进行盐析， 放置冰箱过夜后， 4、 8000-10000g 离心 20-40min 取沉淀 ； （5） 沉淀置于 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液中溶解， 而后置于透析袋中透析 ； （6） 取透析后的透析液， 用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液冲过2-3床体积后， 加入5-10ml 透析液进入 Q-Sepharose Fas。
6、t Flow 中， 上样平衡后， 用 2-3 床 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液 洗去杂质， 而后用 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液含 0-2mol/L 的 NaCl 进行梯度洗脱， 收集有琼 胶酶活性的试管， 将有活性的合并， 充分透析脱盐， 进行冷冻干燥， 得粗酶粉 ； （7） 取粗酶粉 0.1g， 溶于 5ml 的 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液中， 待 0.01-0.1mol/ L PBS 缓冲液冲过 4-5 床体积之后， 加入 5ml 样液到凝胶柱 Sephacryl S-100 上， 并用含 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液洗脱， 测定。
7、并收集有琼胶酶活力的试管 ； （8） 将试管中的液体合并进行冷冻干燥， 即成琼胶酶。 5. 根据权利要求 4 所述的一株蝙蝠弧菌用于制备琼胶酶的方法， 其特征在于 ： 所述种 子培养基为 ： 海水晶 25g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母粉 1g/L， 琼脂 2g/L， 调节 pH 为 7.2-8.4， 去 离子水配制 ； 发酵培养基配方 ： 海水晶 20-30g/L， 蛋白胨 3-7g/L， 酵母粉 0.5-2.5g/L， 琼脂 1.5-2.5g/L， 调节 pH 为 7.2-8.4， 去离子水配制。 权 利 要 求 书 CN 103865850 A 2 1/4 页 3 一株蝙蝠弧菌及制备琼。
8、胶酶的方法 技术领域 0001 本发明属于食品生物技术领域， 涉及筛选一株蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） 及其 培养发酵制备琼胶酶的方法。 背景技术 0002 琼胶 (agar)， 又名琼脂， 是一种在海洋红藻中经热水提取得到的海藻多糖， 其资源 丰富， 广泛应用于食品， 医药， 生物技术等领域， 琼胶主要由中性的琼胶糖和离子性的硫琼 胶组成， 琼胶糖是由 1,3 连接的 -D- 半乳糖和 1,4 连接的 3,6- 内醚 -L- 半乳糖残基 反复交替连接的直链聚合物。 0003 琼胶酶来源广泛， 主要存在于海洋细菌中 ： 交替单胞菌属， 噬细胞菌属， 假单胞菌 属， 交替假单胞。
9、菌属， 链霉菌属， 微颤菌属， 弧菌属。 在以海藻为食的动物属中均有发现， 如 海兔属， 滨螺属， 冠海詹属等。 0004 利用微生物法制备琼胶酶已经有许多年历史了， 包括 cytophage,(Duckworth M.Turvey JR.Biochem J,1969a),(Van der Meulen HJ,Harder W.Antonie Van Le euwenhoek.1975),Agarivorans(Hu ct al.Appl Microbiol.2008)(Fu et al.Appl Microbiol Biotechnol.2008),Vibrio(Araki er al.J 。
10、Mar Biotechnol.1998a)Dong er al.Biosci Biotechnol Biochem.2007),Pseudoalteromonas(Vera et al.Appl Environ Microbiol.1998)(Schroeder et al.Microbiology.2003),Streptomyces(Bibb et al.J Gen Microbiol.1987),Alteromonas(Leon et al.Appl Environ Microbiol.1992)(Wang er al. Appl Microbiol Biotechnol.2006)(P。
11、otin et al.EurJBiochem.1993),Pseudomon as(Morrice et al. Eur J Biochem.1983)(Malmqvist.Biochim Biophys Acta.1978)。 但 是其制备的琼胶酶由于尚未适应大规模工业化生产。 所以故急需筛选出新的菌株进入微生 物库中， 作为生产琼胶酶菌株的后备力量。 0005 琼胶寡糖就是指琼胶多糖经水解后聚合度 (DP) 为 2-10 的低聚糖， 又称琼胶低聚 糖， 主要由琼二糖的重复单位连接而成， 水溶性好， 有利于人体吸收， 大大提高了其应用价 值， 是一种新型的海洋功能性低聚糖， 其生物活性正在逐。
12、渐被挖掘， 不仅具有功能性低聚糖 的一般特性， 还具有许多普通寡糖无法替代的生理功能特性， 如较强的抗肿瘤， 抗氧化， 抗 炎， 抗龋齿及抗淀粉老化等活性， 是一种极具开发潜力的低聚糖。而在海洋中藻类含量丰 富， 琼胶酶水解产生的琼胶寡糖对于提高资源的利用价值， 有着重要的作用， 并有着深远的 影响， 此外， 琼胶酶还可以作为多种产业的工具酶， 可制成酶制剂， 广泛应用于生物， 食品和 水产养殖等多种领域。 发明内容 0006 本发明的目的是筛选出一种产琼胶酶的菌株， 并提供一种利用此菌株制备琼胶酶 的方法。 0007 本发明的技术方案 ： 一株筛选自市售鲍鱼肠道的细菌， 可以用于制备琼胶酶 。
13、说 明 书 CN 103865850 A 3 2/4 页 4 (agarase)， 其分类命名为蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） fjfst-2013001， 已于2013年12月 8 日在中国典型培养物保藏中心登记保藏， 其保藏编号为 CCTCC M 2013638， 保藏地址为武 汉大学。 0008 微生物菌株的筛选与鉴定 ： 本发明取市售新鲜鲍鱼， 消毒之后， 用无菌水清洗， 用无菌手术刀将其与壳分离， 用镊 子和手术刀取下壳上的肠道， 涂布于琼脂筛选培养基上， 在 25下， 培养 48h 挑选有明显 凹陷的菌落进入琼脂筛选培养基中进行划线分离纯化， 纯种接到发酵培养基 2。
14、5， 120 rpm， 摇瓶培养 24-72h， 检测培养基中的琼脂酶活力， 最终筛选出目标菌株 B-13， 对其进行 生理生化特性鉴定和分子生物学实验指南进行 16s rDNA 序列分析， 确定其属于蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） ， 拟命名为蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） fjfst-2013001。 0009 用所述蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） fjfst-2013001 生产琼胶酶的方法包括如 下步骤 ： （1） 用 250mL 锥形瓶装 20-60mL 种子培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并接种菌落， 接种 后于 20-30， 8。
15、0-140rpm 摇床培养 12-24h 后得到种子发酵液 ； （2） 用 250mL 锥形瓶装 20-60mL 发酵培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并按 2%-10% 的接 种量， 将种子发酵液接入发酵培养基， 20-30培养 24-60h 后得到含琼胶酶的发酵液 ； （3） 而后将发酵培养基经过 4， 8000-10000g 冷冻离心 10-20min 之后， 取上清液 ； （4） 将上清液加入质量分数为 60%-80% 的饱和硫酸铵进行盐析， 放置冰箱过夜后， 4、 8000-10000g 离心 20-40min 取沉淀 ； 沉淀置于 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液中溶解。
16、， 而后置 于透析袋中透析 ； （5） 取透析后的透析液， 用 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液冲过 2-3 床体积后， 加入 5-10ml 透析液进入 Q-Sepharose Fast Flow 中， 上样平衡后， 用 2-3 床 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液 洗去杂质， 而后用 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液含 0-2mol/L 的 NaCl 进行梯度洗脱， 收集有琼 胶酶活性的试管， 将有活性的合并， 充分透析脱盐， 进行冷冻干燥， 得粗酶粉 ； （6）取 粗 酶 粉 0.1g， 溶 于 5ml 的 0.01-0.1mol/L PBS 缓 冲 液 中，。
17、 待 0.01-0.1mol/ L PBS 缓冲液冲过 4-5 床体积之后， 加入 5ml 样液到凝胶柱 Sephacryl S-100 上， 并用含 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液洗脱， 测定并收集有琼胶酶活力的试管 ； （7） 将试管中的液体合并进行冷冻干燥， 即成琼胶酶。 0010 所述种子培养基为 ： 海水晶 25g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母粉 1g/L， 琼脂 2g/L， 调节 pH 为 7.2-8.4， 去离子水配制 ； 发酵培养基配方 ： 海水晶 20-30g/L， 蛋白胨 3-7g/L， 酵母粉 0.5-2.5g/L， 琼脂 1.5-2.5g/L， 调节 pH。
18、 为 7.2-8.4， 去离子水配制。 0011 用该方法生产的琼胶酶的检测方法 ： 取上述步骤 （3） 得到含有琼胶酶的发酵液上清液 1mL， 加入 1mL 的 PBS 缓冲液 （其中含 有琼胶0.1%） ， 置于40水浴锅中酶解30min， 后加入1.5mLDNS， 沸水浴15min。 冷却至室温 后， 用蒸馏水补齐刻度， 使用分光光度计在 540nm 下进行检测。1U 定义为 1min 产生 1ug 琼 胶寡糖的值。 0012 本发明的有益效果 ： 筛选出一种用于微生物法生产琼胶酶的菌株， 分类命名为蝙 蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） fjfst-2013001。本发明以该。
19、菌作为菌种， 以常见碳源， 氮源， 无机盐组成的发酵培养基， 可以在 24-60h 内达到最大酶产量。 说 明 书 CN 103865850 A 4 3/4 页 5 具体实施方式 0013 以下是说明本发明的具体实施例， 但本发明并不限于此。 0014 实施例 1 取福州市售新鲜鲍鱼， 立即浸入70%的酒精1min消毒， 再用无菌水清洗数次， 用无菌手 术刀将其与壳分离， 再用无菌水清洗数次， 用镊子和手术刀取下壳上的肠道， 置于预先灭菌 的研钵中， 加入灭菌的 1ml 海水研磨 10min， 后加入 9ml 灭菌海水混匀。吸取 1ml 进行稀释 （10-1,10-2,10-3,10-4,） 。
20、， 吸取 0.5ml 涂布于琼脂筛选培养基上， 在 25下， 培养 48h 挑选有 明显凹陷的菌落进入琼脂筛选培养基中进行划线分离纯化， 将纯种接到液体培养基 25， 100rpm， 摇瓶培养 48h， 离心取上清， 采用分光光度法检测培养基中的琼脂酶活性， 经过初 筛， 共分离获得6株能产琼胶酶的细菌， 结合琼胶酶的生产能力， 最终选定B-13作为出发菌 株。 0015 实施例 2 经形态学和生理生化特性研究， B-13 菌株的特征如下 ： 菌落形态 ： 菌落呈现出圆形， 表面光滑， 乳白色， 边缘整齐。 0016 细胞形态 ： 此为革兰氏阴性菌， 形态为杆状。 0017 生理生化特征 ： 。
21、为兼性厌氧菌， 能利用淀粉， 葡萄糖， 蔗糖， 醋酸钠， D- 半乳糖等多 种化合物作为碳源， 也可以利用蛋白胨， 酵母膏， 硝酸铵， 硫酸铵， 等多种化合物作为氮源。 0018 对菌株的 16S rRNA 基因进行 PCR 扩增与序列测定， 发现其 16S rRNA 的基 因部分片断长度为 1484bp， 经过 NCBI 和核糖体数据库进行比对， 鉴定为蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） ， 拟命名为蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） fjfst-2013001， 菌株的 16S rRNA 序列具体可见序列表。 0019 实施例 3 （1） 将蝙蝠弧菌 （Vampir。
22、ovibriosp.） fjfst-2013001 在种子培养基中， 用 250mL 锥形 瓶装 30mL 种子培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并接种菌落， 接种后于 25， 140rpm 摇床培 养 24h 后得到种子发酵液， 所述种子培养基为 ： 海水晶 25g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母粉 1g/L， 琼 脂 2g/L， 调节 pH 为 7.4， 去离子水配制。 0020 （2） 用 250mL 锥形瓶装 30mL 发酵培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并按 4% 的接种 量， 将种子发酵液接入发酵培养基， 接种后于25， 140rpm摇床培养培养48h后得到含琼胶 酶的发酵液。
23、， 所述发酵培养基为 ： 海水晶 25g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母粉 1g/L， 琼脂 2g/L， 调节 pH 为 7.4， 去离子水配制。 0021 该实施例所得的琼胶酶的活力为 1.71U/mL 实施例 4 （1） 将蝙蝠弧菌 （Vampirovibriosp.） fjfst-2013001 在种子培养基中， 用 250mL 锥形 瓶装 30mL 种子培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并接种菌落， 接种后于 25， 100rpm 摇床培 养 24h 后得到种子发酵液， 所述种子培养基为 ： 海水晶 25g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母粉 1g/L， 琼 脂 2.5g/L， 调节 。
24、pH 为 8， 去离子水配制。 0022 （2） 用 250mL 锥形瓶装 30mL 发酵培养基， 按常规方法灭菌， 冷却， 并按 8% 的接种 量， 将种子发酵液接入发酵培养基， 接种后于25， 100rpm摇床培养培养48h后得到含琼胶 酶的发酵液， 所述发酵培养基为 ： 海水晶 25g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母粉 1g/L， 琼脂 2.5g/L， 调 说 明 书 CN 103865850 A 5 4/4 页 6 节 pH 为 8， 去离子水配制。 0023 该实施例所得的琼胶酶的活力为 4.17U/mL 实施例 5 （1） 将上述发酵培养基经过 4， 8000g 冷冻离心 15mi。
25、n 之后， 取上清液。 0024 （2） 将上清液加入质量分数为 80% 的饱和硫酸铵进行盐析， 放置冰箱过夜， 4， 10000g 离心 30min 取沉淀。 0025 （3） 沉淀置于一定量的 0.01mol/L PBS 缓冲液中溶解， 而后置于透析袋中透析。 0026 （4） 取透析后的透析液， 用 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液冲过 2-3 床体积后， 加入 5-10ml 透析液进入 Q-Sepharose Fast Flow 中， 上样平衡后， 用 2-3 床 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液洗去杂质， 而后用 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液含 0-。
26、2mol/L 的 NaCl 进行梯度洗脱， 收 集有琼胶酶活性的试管， 将有活性的合并之后， 充分透析脱盐之后， 进行冷冻干燥， 得粗酶 粉。 0027 （5） 取粗酶粉 0.1g， 溶于 5ml 的 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液中， 待 0.01-0.1mol/ L PBS 缓冲液冲过 4-5 床体积之后， 加入 5ml 样液到凝胶柱 Sephacryl S-100 上， 并用含 0.01-0.1mol/L PBS 缓冲液洗脱， 测定并收集有琼胶酶活力的试管。 0028 （6） 将试管中的液体合并进行冷冻干燥， 即成琼胶酶。 说 明 书 CN 103865850 A 6 1/2。
27、 页 7 SEQUENCE LISTING 福建农林大学 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 1 1 PatentIn version 3.3 1 1484 DNA 16S rRNA 1 cagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggtgtg cttcacacat gcaagtcgaa 60 cgaggtagca atacctagtg gcggacgggt gagtaacgcg tgggaatctg cctttagatg 120 ggggataacg ggccgaaagg tccgctaata ccgcatatgc cgcaaggtga aaggagtaat 180。
28、 ccgtctaaag atgagcccgc gtccgattag ctagttggta gagtaagagc ctaccaaggc 240 gacgatcggt agctggtctg agaggatgat cagccacaat gggactgaga cacggcccat 300 actcctacgg gaggcagcag tggggaattt tacgcaatgg gggaaaccct gacgtagcga 360 caccgcgtga gcgaagaagc cctttggggt gtaaagctct gtcagctgga acgaaaacaa 420 tgacggtacc agcagagg。
29、aa gcatcggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaagacgta 480 ggatgcgagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagagtt cgtaggtggt ttgttaagtt 540 tggtgttaaa gatcggggct caaccctggg actgcactga atactggcag actcgagtgt 600 序 列 表 CN 103865850 A 7 2/2 页 8 ggtagaggct agtggaattc ccagtgtagc ggtgaaatgc gtagatattg ggaagaacac 660 cggtggcg。
30、ta ggcgactagc tgggccgtaa ctgacgctga ggaacgaaag ccaggggagc 720 gaatgggatt agatacccca gtagtcctgg ccgtaaacga tggatactag gcgtatcggg 780 tatcgacccc tgatgtgccg cagctaacgc gataagtatc ccgcctgagt agtacggccg 840 caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggaac atgtggttta 900 attcgaagca acgcgaagaa ccttac。
31、cagg gcttgacatg gtaggaagct ttcggaaacg 960 agagtgtgcc cgcaagggag cctacacaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccccc gttgttagtt gccatcaggt 1080 aaagctgggc actctagcga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc 1140 aagtcatcat gccccttatg ccccgggcta cacacgtgtt a。
32、caatggctg ggacaatgtg 1200 atgcaatccc gtgaggggga gcgaaccacg aaacccagtc tcagttcaga tcgcaggctg 1260 caactcgcct gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaaccgccg atcagcacgc ggcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcatgg gagttggtca cgcccaaagt 1380 cggtgcgcta accttcggga agcagccgcc taaggcaggg ccgatgactg ggacgaagtc 1440 gtaacaaggt agccgtaccg gaaggtgcgg ctggatcacc tcct 1484 序 列 表 CN 103865850 A 8 。