人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103923909 A (43)申请公布日 2014.07.16 CN 103923909 A (21)申请号 201310014700.1 (22)申请日 2013.01.15 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 张文驹 陈子易 程舟 陈家宽 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方 法 (57) 摘要 本发明属于中。

2、药技术领域， 涉及中药材的鉴 别方法， 具体涉及人参与西洋参的特异性分子标 记及其鉴别方法。本发明提供了能够特异性识别 人参与西洋参的DNA分子标记， 所述的DNA分子标 记分别位于 Seq.No.1 5 的 DNA 序列中的 （SSR） 位点上， 根据上述序列设计 5 对引物， 对人参和西 洋参的DNA模板进行PCR扩增， 每一对引物都能分 别扩增出特异性识别人参和西洋参的 PCR 产物， 用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测这 些长度不一的产物， 从而快速鉴别人参与西洋参。 本方法所需样品少， 不受产品形态的限制， 对样品 的 DNA 长度要求不高， PCR 稳定且重复性好。 (51)。

3、Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103923909 A CN 103923909 A 1/1 页 2 1. 含有人参与西洋参的特异性分子标记位点的如 Seq.No.1， Seq.No.2， Seq.No.3， Seq.No.4 和 Seq.No.5 所示的 DNA 序列。 2. 基于权利要求 1 所述的 DNA 序列的 PCR 引物对， 其序列组合为 ： Seq.No.6 和 Seq. No.7， Seq.No。

4、.8 和 Seq.No.9， Seq.No.10 和 Seq.No.11， Seq.No.12 和 Seq.No.13， Seq.No.14 和 Seq.No.15。 3. 一种鉴别人参与西洋参的方法， 其特征在于， 包括 ： 特异性扩增人参与西洋参的简 单重复序列位点的如权利要求 2 所述的引物序列， 利用所述的引物鉴别人参与西洋参， 其 包括步骤 ： 1） 取待鉴定样品， 用高盐低 PH 法提取样品的总 DNA ； 2) 取待检样品的 DNA， 从所述的引物对中任选其中 3 对， 按各对引物特定的 退火温度进行 PCR 扩增， 每一对引物设置 3 次重复和空白对照 ; 3) 根据所选引物对。

5、扩增的 PCR 产物大小对样品的属性做出判断。 4. 按权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述各引物对的判断标准如表 1 所示 ： 表 1. 用于人参、 西洋参鉴定的 5 对 PCR 引物及产物大小 所选 3 对引物扩增的结果均符合上述标准时， 判断样品属于人参或西洋参。 权 利 要 求 书 CN 103923909 A 2 1/4 页 3 人参与西洋参的特异性分子标记及其鉴别方法 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 涉及中药材的鉴别方法。具体涉及人参与西洋参的特 异性分子标记及其鉴别方法。 背景技术 0002 人参 （Panax ginseng C.A.Meyer） 和西洋。

6、参 (Panax quinquefolius L.) 均为目 前我国应用最广泛的重要中药材， 属多年生宿根草本植物五加科 （Araliaceae） 人参。研究 显示， 人参分布于我国东北、 俄罗斯远东地区及朝鲜等地 ； 西洋参原产于北美低山地区， 我 国引种成功后在东北、 华北、 华中和康滇四大栽培区均有栽种。 现有技术公开了人参和西洋 参药性差异较大， 但形态相似， 尤其是国内栽培的人参与栽培西洋参很难根据形态特征准 确鉴别， 两者的粉末更是难以区别。因此市场需求一种不依赖于形态特征的鉴别人参与西 洋参的方法。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供重要中药材的鉴别方法， 具体涉及人参与西。

7、洋参的特异性 分子标记， 及其鉴别方法， 尤其是一种不依赖于形态特征的鉴别人参与西洋参的方法。 0004 本发明提供了能够特异性识别人参与西洋参的 DNA 分子标记， 所述的 DNA 分子标 记分别位于 Seq.No.1 5 的 DNA 序列中的 （SSR） 位点上， 所述的 Seq.No.1， Seq.No.2， Seq. No.3， Seq.No.4 和 Seq.No.5DNA 序列上分别具有一个简单重复序列 （SSR） 位点， 通过该序列 位点能够特异性地识别人参和西洋参 ； 0005 进一步， 本发明提供了基于上述 DNA 分子标记的快速鉴别人参与西洋参的方法， 其中， 根据上述序列设。

8、计 5 对引物， 对人参和西洋参的 DNA 模板进行 PCR 扩增， 每一对引物 都能分别扩增出特异性识别人参和西洋参的 PCR 产物， 用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝 胶电泳检测这些长度不一的产物， 从而快速鉴别人参与西洋参。 0006 更具体的， 本发明的快速鉴别人参与西洋参的方法， 其特征在于， 其包括， 0007 1， 特异性扩增人参与西洋参的简单重复序列 （simple repeat sequence， 简称 SSR） 位点的引物序列 ； 本发明从大量含有 SSR 位点的人参序列中筛选出含有 SSR 位点的 5 条 DNA 序列， 分别为 Seq.No.1， Seq.No.2， Se。

9、q.No.3， Seq.No.4 和 Seq.No.5， 这些 SSR 位点 用于特异性地区别人参与西洋参 ； 0008 2， 利用上述的引物鉴别人参与西洋参 ： 0009 根 据 上 述 5 条 人 参 DNA 序 列，设 计 5 对 多 聚 酶 链 式 反 应 （polymerase chainreaction， 简称 PCR) 引物， 其序列分别为 Seq.No.6 和 Seq.No.7， Seq.No.8 和 Seq. No.9， Seq.No.10 和 Seq.No.11， Seq.No.12 和 Seq.No.13， Seq.No.14 和 Seq.No.15 ； 0010 用 S。

10、eq.No.6+Seq.No.7 对人参与西洋参的 DNA 模板分别进行 PCR 扩增， PCR 退火 温度 52， 结果显示， 人参能产生 181bp 长的 PCR 产物， 而西洋参不能产生 PCR 产物 ； 0011 用 Seq.No.8+Seq.No.9 对人参与西洋参的 DNA 模板分别进行 PCR 扩增， 退火温度 说 明 书 CN 103923909 A 3 2/4 页 4 55， 结果显示， 人参只能产生一条203bp长的PCR产物， 而西洋参则能产生191bp和203bp 长的两条 PCR 产物 ； 0012 用 Seq.No.10+Seq.No.11 对人参与西洋参的 DNA。

11、 模板分别进行 PCR 扩增， 退火温 度 57， 结果显示， 人参能产生一条 243bp 长的 PCR 产物， 而西洋参则产生 235bp 长的 PCR 产物 ； 0013 用 Seq.No.12+Seq.No.13 对人参与西洋参的 DNA 模板分别进行 PCR 扩增， 退火温 度 57， 结果显示， 人参只能产生一条 184bp 长的 PCR 产物， 而西洋参则能产生 166bp 和 157bp 长的两条 PCR 产物 ； 0014 用 Seq.No.14+Seq.No.15 对人参与西洋参的 DNA 模板分别进行 PCR 扩增， 退火温 度 57， 结果显示， 人参能产生 251bp 。

12、和 273bp 两条 PCR 产物， 而西洋参则不能产生 PCR 产 物。 0015 本发明的实施例中， 对人参与西洋参进行鉴定 ： 0016 1） 取待鉴定样品 0.05 克， 用高盐低 PH 法提取样品的总 DNA ； 0017 2） 取 2550ng 待检样品的 DNA， 从上述的 5 对引物中任选 3 对， 按 0018 各对引物特定的退火温度进行 PCR 扩增， 每一对引物设置 3 次重复和空白对照 ； 0019 3） 聚丙烯酰胺凝胶电泳检验 PCR 产物的大小 ； 0020 4） 根据所选引物对产生的 PCR 产物的大小和表 1 所提出的标准， 对样品的属性做 出判断。 0021 。

13、本发明的上述鉴定中， 0022 选择引物对 （Seq.No.6+Seq.No.7） 、 引物对 （Seq.No.14+Seq.No.15）和其它任何 一个引物对进行 PCR 扩增， 可以用琼脂糖凝胶电泳检测结果， 结果显示， 采用前两个引物对 扩增西洋参的 DNA， 不能获得任何产物， 而扩增人参的 DNA， 将获得表 1 所示的产物 ； 用其它 3 对引物分别扩增人参和西洋参的 DNA 均将获得如表 1 所示的大小不一的产物 ； 0023 表 1. 用于人参、 西洋参鉴定的 5 对 PCR 引物及产物大小 0024 0025 所选 3 对引物扩增的结果都符合上述标准， 才能判断样品属于人参还。

14、是西洋参。 0026 本发明的优点有 ： 0027 所需样品少， 不多于 0.005 克， 也不受产品形态的限制， 不论样品是形态完好还是 已被粉碎， 或加入其它物质， 只要 DNA 不被严重破坏均能按本发明的方法进行鉴定 ； 此外， 本发明所述的引物对序列较长， 而扩增的产物则不超过 280bp， 因此对样品的 DNA 长度要求 不高， PCR 稳定且重复性好。 附图说明 说 明 书 CN 103923909 A 4 3/4 页 5 0028 图 1 引物对 （Seq.No.6+Seq.No.7） 扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳 图， 共 35 个样品和一个空白对照 （标为 -） ，。

15、 M 为 DNA 分子大小标记 （mark） ； 其中， 样品名称和 来源是 ： 1-4 ： 新宾栽培西洋参 ； 5 ： 抚松大马牙 ； 6 ： 通化大马牙 ； 7 ： 通化二马牙 ； 8 ： 集安二 马牙 ； 9 ： 二马牙 ( 新宾 ) ； 10-11 ： 集安长脖 ； 12-13 ： 集安圆芦 ； 14-15 ： 集安竹节芦 ； 16-17 ： 集安林下参 ； 18-19 ： 桓仁移山参 ； 20-24 ： 加拿大栽培西洋参 （龙宝） ； 25-29 ： 美国栽培西洋 参 ； 30-31 ： 加拿大栽培西洋参 （神象） ； 32-33 ： 宽甸石柱参 ； 34-35 ： 韩国高丽参。 0。

16、029 图 2 是引物对 （Seq.No.8+Seq.No.9） 扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电泳 图， 样品编号与图 1 相同， 其中 12 号样品的 PCR 反应体系被西洋参 DNA 污染， 重复实验不再 出现 191bp 的产物， 证明 12 号样品并非例外。 0030 图 3 是引物对 （Seq.No.10+Seq.No.11） 扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电 泳图， 样品编号与图 1 相同。 0031 图 4 是引物对 （Seq.No.12+Seq.No.13） 扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电 泳图， 样品编号与图 1 相同。 0032 图 5 是引物对 （Seq.。

17、No.14+Seq.No.15） 扩增人参和西洋参个体的聚丙酰胺凝胶电 泳图， 样品编号与图 1 相同。 具体实施方式 0033 实施例 1 0034 从不同产地和市场收集大马牙、 二马牙、 长脖、 圆芦和竹节芦 5 种常见人参农家品 种样品以及移山参、 林下参、 石柱参和高丽参样品 51 份， 从美国、 加拿大以及中国辽宁收集 西洋参样品 16 份 （材料如表 2 所示） ； 0035 采用改良的高盐 SDS 法提取样品的总 DNA， 从较少材料中获得高质量的 DNA ； 0036 PCR 扩增， PCR 反应体系如下 ： 总体积 20L， 含有约 20ng 基因组 DNA， 正向引物和 反。

18、向引物各 0.25mol/L， 1 反应缓冲液， 1.0mmol/L MgCl2， 0.1mmol/L dNTP， 1U Taq 酶， 用 DEPC 处理水补充体积至 20L， 另用去离子水代替模版 DNA 作为阴性对照 ； 0037 PCR扩增程序如下 ： PCR反应在Applied BiosystemTM2720 Thermal Cycler扩增仪 上进行， 反应参数为 ： 94预变性 1min， 根据各对引物具体设定的 Ta 温度 40s， 72 40s， 35 个循环， 72 5min 补平， 反应产物在 4下保存 ； 0038 按如下程序进行 PCR 产物检测 ： PCR 反应产物上。

19、样于 4% 聚丙酰胺凝胶 ( 每板胶含 3.6g 尿素， 17mL 去离子水， 3mL10TBE 溶液， 4.5mL40%Arc-Bis 溶液， 0.3mL10%(NH3)2S2O2 溶液， 14L TEMED)， 上样量为 5L， 凝胶放置在含有 0.5TBE 缓冲液的电泳槽中进行电 泳， 电压 500V， 电泳时间为 100min。凝胶由 0.1%AgNO3 溶液染色 10min 后， 用 1.5%NaOH 和 0.4% 甲醛混合液显色 15min。以数码相机拍照记录， 用 Smart ViewTM Plus 生物电泳图像分 析软件 （上海复日科技有限公司） 计算片段大小 ； 0039 结。

20、果显示 ： 每一对引物扩增 51 份人参样品， 无一例外均具有表 1 所示的人参特有 的PCR产物 （其中， 在用Seq.No.8+Seq.No.9扩增一份园芦样品时， 出现西洋参特有的产物， 重复实验多次都不再出现这一产物， 证明此次实验被西洋参 DNA 污染， 该样品并非例外） ； 扩 增 16 份西洋参样品， 所有样品均出现了西洋参特有的 PCR 产物。 0040 表 2 本发明所用人参和西洋参材料 说 明 书 CN 103923909 A 5 4/4 页 6 0041 说 明 书 CN 103923909 A 6 1/5 页 7 SEQUENCE LISTING 复旦大学 人参与西洋参。

21、的特异性分子标记及其鉴别方法 1 PatentIn version 3.3 1 185 DNA Panax ginseng 1 tacatttgct tgcttgattt ctcctcctcc ttcttccttc cttccatgga tggatcttgg 60 tttcatgaaa gtcaaaatcc cttctccctc ttctcttgaa gtggccgaac tcctctctct 120 ctctccctct ctctcttttc ctcttagcaa cttggaaggg taaaagagat gaaagaaaga 180 agaaa 185 2 203 DNA Panax g。

22、inseng 2 tgcccccttt tgttttctca atgctttgat attgtgacaa agcctttttt atttttttgt 60 cctttttttg ggtactgtat taatgttacc gctgttcttt aggaggaaaa aagtagaaac 120 taagtcatac taaaattgat tcgacagttg gctggaccat catgcaaaat tcaggattca 180 tcagcgacta aagaaaatat gga 203 序 列 表 CN 103923909 A 7 2/5 页 8 3 231 DNA Panax ginse。

23、ng 3 atcaaacgaa ttcacggaca gaaatttgat ttttactatt cattattgtg caatgaaata 60 ttctaataaa acaaaaacct taaataaaat ataatatatt ctatttataa tctaataaaa 120 aaaacataat atatatatat atatacatat atatatatat ataacaacac atgttatatt 180 aaaaaaatca cccgtgacaa ccttcagact ttccttcccc catattcatt t 231 4 180 DNA Panax ginseng 4。

24、 aagtttggca gaaggtaagg gagggatgga taaatgtaat gacccaatat tattattatt 60 attattatta ttattattac atgttgctct acacgtggcg gatgatgatc tttaactgac 120 tggactggac tacactagac tagactagac attgtccccg aacccaaaca gtgccgtctt 180 5 240 DNA Panax ginseng 5 ctaagcagtg gaagtcaaac acatcttcta aatgaagatg aacttacatg ctgaaatct。

25、a 60 tatgtgcagg tatatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgtgtg tggactatat 120 序 列 表 CN 103923909 A 8 3/5 页 9 atacacaact gtgtagtaca cagtcactta tggcgatatt tttttggaga tatagcgacg 180 gttcaaccgt cgccatagac cagaatagct atagcgacag tttacccatc gctatagccc 240 6 21 DNA 引物 6 tacatttgct tgatttctcc t 21 7 22 DNA 引物 7。

26、 tttcttcttt ctttcatctc tt 22 8 19 DNA 引物 8 tgcccccttt tgttttctc 19 9 24 DNA 引物 9 序 列 表 CN 103923909 A 9 4/5 页 10 tccatatttt ctttagtcgc tgat 24 10 22 DNA 引物 10 atcaaacgaa ttcacggaca ga 22 11 24 DNA 引物 11 aaatgaatat gggggaagga aagt 24 12 20 DNA 引物 12 aagtttggca gaaggtaagg 20 13 20 DNA 引物 13 aagacggcac tgtttgggtt 20 序 列 表 CN 103923909 A 10 5/5 页 11 14 21 DNA 引物 14 ctaagcagtg gaagtcaaac a 21 15 20 DNA 引物 15 gggctatagc gatgggtaaa 20 序 列 表 CN 103923909 A 11 1/3 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103923909 A 12 2/3 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103923909 A 13 3/3 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103923909 A 14 。