技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法。
背景技术
溶菌酶(lysozyme，EC3.2.1.17)又称胞壁质酶(muramidase)，能特异性水解原核细菌细胞壁中的主要成分肽聚糖，分解微生物的细胞壁，使细菌失去细胞壁的保护并在胞内高渗透压的作用下破裂死亡，从而达到杀菌目的。1921年，著名英国细菌学家Alexander Fleming在人的鼻液中发现了溶菌酶，后证实溶菌酶广泛存在于鸟类和禽类的蛋清内、哺乳动物的各器官组织和体液内、植物以及软体动物和昆虫体内。
溶菌酶作为高等有机体组织及体液中最强大的抗菌剂之一，是生物机体对抗外源病原菌侵袭的重要防御因子。如人溶菌酶是一种小分子碱性球蛋白，它由上皮细胞和单核-巨噬细胞分泌，可识别和破坏病原菌的细胞结构，并通过信号级联反应吸引白细胞集中到感染部位，最终消灭侵染人体的病原菌。此外，溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，和DNA-RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。在植物中，如无花果的鲜汁中均含有丰富的溶菌酶，推测其与植物的抗病毒作用密切关系。另一方面，溶菌酶也广泛存在于微生物中，如各种细菌和噬菌体。噬菌体溶菌酶与噬菌体侵染过程中细菌细胞壁的分解有关。细菌溶菌酶的主要功能是参与细胞生长分裂形态改变等与细胞壁相关的代谢过程。因此，细菌不会对溶菌酶这种细菌中广泛含有的自溶素(autolysin)，产生真正意义上的抵抗性，这对于解决日益严峻的细菌耐药性问题，减少抗生素滥用具有重要意义。
虽然溶菌酶的作用强大，但其对革兰氏阴性菌的裂解效果并不好。这是由于细菌细胞壁构成不同所导致的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖构成，肽聚糖层数较多且较厚，含有少量磷壁酸，而革兰氏阴性菌外层主要由脂多糖(LPS)构成，内层才含有少量肽聚糖。而溶菌酶的主要作用位点为细胞壁中的肽聚糖，水解β-1,4糖苷键，故其对于革兰氏阴性菌的作用效果不是很理想。
在日常生活当中，人们所接触到的很多致病菌，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、痢疾杆菌和产气荚膜杆菌等，都属于革兰氏阴性菌。为了得到对革兰氏阴性菌具有高杀菌活性的溶菌酶，可以对溶菌酶进行定向进化，构建溶菌酶基因随机突变文库，再从中筛选出对革兰氏阴性菌杀菌效果较强的溶菌酶。
定向转化过程中，一方面，所需的突变体文库数量庞大，需采用高通量方法以提高筛选效率；另一方面，溶菌酶对革兰氏阴性菌裂解效果差，需采用衡量指标较敏感、可有效反映裂解效果的筛选手段。而现有的筛选方法如平板抑菌圈法、牛津杯法等，无法很好的同时满足以上两点要求。因此，亟需构建一种灵敏可靠、易操作的高通量筛选方法，用于新型广谱溶菌酶突变体的筛选。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法，该方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联使用，提高了检测的灵敏性，同时利用荧光酶标仪和96微孔板可以实现溶菌酶的高通量检测。
为此，本发明提供了一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法，其包括以下步骤：
A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；
B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；
其中，所述反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白-蛋白酶的识别位点-受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液。
在本发明中，根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，判断发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性；具体地，反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长越快，发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性越高。
在本发明的一些实施方式中，所述的蛋白酶为具有识别序列特异性的蛋白酶；在本发明的一些具体实施例中，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶、肠激酶或凝血因子Xa；在本发明的一些优选的实施例中，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶。
在本发明的另一些实施方式中，所述TEV蛋白酶的识别位点的氨基酸序列为：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly。
在本发明的一些实施方式中，所述目标溶菌酶基因突变文库的构建方法为易错PCR和/或DNA改组。
在本发明中，由于供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的吸收光谱重叠，因此当供体荧光蛋白与受体荧光蛋白之间的距离在10nm以内时，会发生能量转移现象，供体荧光蛋白的能量转移至受体荧光蛋白上，使供体蛋白荧光强度要比它单独存在时低得多，而受体蛋白荧光强度大大增强。
在本发明的一些具体实施例中，所述的供体荧光蛋白为青色荧光蛋白，所述的受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。
在本发明的一些具体实施方式中，所述真核细胞为毕赤酵母。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述方法还包括以下步骤：
C，对筛选出的对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶进行复筛，根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，验证溶菌酶的活性。
本发明的有益效果为：本发明所述筛选方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联，借助检测荧光信号，显著提高了检测的灵敏度，可有效地发现阳性突变，找到优良突变基因；同时该方法可利用荧光酶标仪和96微孔板实现溶菌酶的高通量检测。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。
本发明所述筛选方法基于荧光共振能量转移技术(FRET)，即两个荧光蛋白分子距离极近(10nm以内)时，如果供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的吸收光谱重叠，则会发生能量转移现象，供体荧光蛋白的能量转移至受体荧光蛋白上，使供体蛋白荧光强度要比它单独存在时低得多，而受体蛋白荧光强度大大增强。以青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白为例，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白是一对可以发生FRET效应的蛋白，其中青色蛋白的发射光谱与黄色蛋白的吸收光谱重叠。
用蛋白酶的识别位点作为linker序列，例如，采用TEV蛋白酶的识别位点作为linker序列将青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白连接，使青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白形成距离极近的FRET荧光蛋白对，即“青色荧光蛋白-TEV蛋白酶的识别位点-黄色荧光蛋白”。TEV蛋白酶的识别位点是由Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly七个氨基酸构成。
反应前，由于linker序列(TEV蛋白酶的识别位点)的作用，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白距离极近，青色荧光蛋白的能量转移至黄色荧光蛋白上，此时检测信号呈现青色荧光信号弱、黄色荧光信号强；当将含溶菌酶的发酵液加入反应液中，若溶菌酶对底物菌种(革兰氏阴性菌)有较好的杀菌活性，则细菌发生裂解并释放内部的FRET荧光蛋白对。该蛋白对的TEV蛋白酶的识别位点被反应液中的TEV蛋白酶特异性识别并分解，得到独立的青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白，FRET现象消失，使得青色荧光信号增强。因此，可以通过定量测定青色荧光蛋白信号强度的增长速度，来判定溶菌酶对革兰氏阴性菌的杀菌活性。
本发明所涉及的新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法的具体操作如下：
(1)构建表达目标溶菌酶基因突变文库的真核细胞：
目标溶菌酶的具体种类可根据实际需要选择。编码目标溶菌酶的基因序列通过核酸数据库查找并进行全基因合成，得到原始目标溶菌酶基因序列。构建目标溶菌酶基因随机突变文库主要通过易错PCR和DNA改组(也称DNA洗牌)两种手段实现。
1)易错PCR具体操作步骤如下：
针对原始目标溶菌酶基因序列设计含有酶切位点的引物，通过调整PCR反应体系的配比及反应条件，如改变反应体系中金属离子的浓度、增加PCR反应循环次数等，进行易错PCR扩增，使易错PCR产物中的基因序列发生点突变，从而引起氨基酸改变。
2)DNA改组具体操作步骤如下：
选取与原始目标溶菌酶基因具有同源性的其他溶菌酶基因序列，数目可以根据实际需要所选择。每种基因序列各取20μl混合，加入0.2U的DNaseI，16℃下酶切15min后立即加入6μl EDTA，转移至75℃水浴，酶失活10min。将酶切后的混合体系进行琼脂糖凝胶电泳，选取合适的方法，将所需大小的片段进行胶回收。若模板基因为2000bp左右，则切取100-200bp处胶块，选用胶回收试剂盒进行胶回收；若模板基因为1000bp左右，则切取50bp左右处胶块，由于片段长度小，电泳时选取低熔点琼脂糖进行电泳，切取的胶块溶在3倍体积的TE溶液中，利用酚氯仿抽提，再进行乙醇沉淀，回收小片段DNA。
将回收后的片段DNA作为无引物PCR的模板，进行无引物PCR，利用基因重组的原理，使片段DNA互为引物进行PCR，体系配比如下：1μl PFU酶，5μlbuffer，10μl DNTP，5μl片段DNA，29μl超纯水，共50μl。PCR程序为：94℃5min，94℃30s，46℃1min，72℃30s，50个循环，72℃10min。其中72℃延伸时间根据实际需要选定。对无引物PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收原始目标溶菌酶基因大小的片段。
根据几种同源基因设计含有相同酶切位点的引物，加入所设计的引物，利用上一步无引物PCR产物作为模板，进行有引物PCR。按常规PCR体系配比，按照正常PCR反应条件进行PCR反应。将有引物PCR产物再进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收原始目标溶菌酶基因大小的片段。
将易错PCR或DNA改组后的产物进行双酶切，将表达载体也采用同样的酶进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳，回收所需大小片段，取5μl回收产物再次进行电泳，根据条带亮度确定目的基因和表达载体比例，配制连接体系，16℃连接过夜，构建重组质粒。
将重组质粒转入Top10感受态细胞中，然后将转入重组质粒的感受态细胞悬液全部涂于平板上，每个直径90mm的平板上涂布100-200μl转入重组质粒的感受态细胞悬液，37℃培养16h左右。用无菌水将生长好的菌株从平板上冲下，形成菌悬液，回收菌悬液，利用提质粒试剂盒提取菌悬液中的重组质粒。
将重组质粒转入真核生物感受态细胞中，例如毕赤酵母感受态细胞，将转入重组质粒的真核生物感受态细胞悬液全部平分涂于平板上，静置培养，获得含目标溶菌酶基因突变文库的真核细胞。
(2)构建胞内表达“供体荧光蛋白-蛋白酶的识别位点-受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌：
所采用的供体荧光蛋白为青色荧光蛋白，受体荧光蛋白为光色荧光蛋白，蛋白酶为TEV蛋白酶；
通过NCBI数据库查找出青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的基因序列，加入TEV蛋白酶的识别位点基因作为中间linker序列，设计出两端带有限制性酶切位点的“青色荧光蛋白-TEV蛋白酶的识别位点-黄色荧光蛋白”FRET荧光蛋白对基因序列，通过人工进行合成。将FRET荧光蛋白对基因和革兰氏阴性菌胞内表达载体均进行双酶切，电泳后回收片段进行连接，构建重组质粒。
将重组质粒导入革兰氏阴性菌感受态细胞中，诱导发酵表达，通过SDS-PAGE鉴定FRET荧光蛋白对成功在菌种中得到表达。离心收集菌体，弃上清，加入无菌水重悬菌种，再离心后加入无菌水，使其形成具有特定浓度的菌悬液。
(3)筛选对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶：
将成功分泌表达目标溶菌酶基因突变文库的酵母体系，逐孔转入装有酵母培养基的96深孔板中，在深孔板中进行诱导发酵，获得含目标溶菌酶的发酵液。
每孔吸取100μl发酵液，并将其逐孔对应地转移入透明的酶标板中，每孔再加入100μl纯水，混匀后在酶标仪中测得每孔发酵液的OD600值。
向胞内表达“青色荧光蛋白-TEV蛋白酶的识别位点-黄色荧光蛋白”的革兰氏阴性菌的菌悬液中，加入TEV蛋白酶及TEV蛋白酶缓冲液，加入量根据检测量所需计算(检测时，每孔加入150μl菌悬液、0.8μl TEV蛋白酶缓冲液和0.5μl TEV蛋白酶)，混匀后形成底物混合液，向荧光酶标板中每孔加入151μl底物混合液。
然后向荧光酶标板中每孔加入50μl发酵液(最后两孔不加入发酵液，只加入底物混合液作为阴性对照)，立即吸打1-2次后，放入酶标仪中进行检测，激发波长为433nm，发射波长为475nm，每隔1min检测一次，共检测45min，反应4h后，再检测10min，每隔1min检测一次。
筛选指标的处理分析如下：
反应前45min以时间(min)为横坐标、青色荧光信号强度值为纵坐标做图，检测反应开始时的稳定性。如果反应稳定，即反应趋势平缓上升，则可以求前10min荧光信号强度平均值，同时求反应4h后10min内的平均值。两个平均值之差再除以每孔发酵液的OD600值，即荧光信号强度差值/OD600(青色荧光蛋白的信号强度增长速度)，以此数据对突变溶菌酶酶活的高低进行排序，同时将各孔的数据与阴性对照孔的数据进行比对。其中青色荧光信号增长越快且高于对照孔数值的，表示发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性越高。
对筛选出的含对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶的阳性酵母进行放大培养和复筛，根据反应过程中青色荧光蛋白的信号强度增长速度，验证溶菌酶的活性。提取最终得到的阳性酵母的全基因组，扩增目的基因并进行测序，得到具有高革兰氏阴性菌杀菌活性的新型溶菌酶的基因序列。
本发明中所述的“柞蚕溶菌酶基因”为经密码子优化后的柞蚕溶菌酶基因。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：构建柞蚕溶菌酶基因突变文库
柞蚕是一种北方经济昆虫，柞蚕溶菌酶(Aplyz)具有适应温度范围广、最适温度较低等特性，具有良好的应用价值。由NCBI数据库中查找到柞蚕溶菌酶基因序列，成熟肽序列共363bp，由公司进行全基因合成，合成后的基因序列如下：
AAGTGGTTTACCAAATGTGGTCTAGTGCACGAGCTGAGGAGACAAGGCTTCGACGAGAGCCTAATGAGAGACTGGGTCTGTTTGGTTGAGAACGAAAGCAGCAGATATACTAATAAAATCGGTAAAGTGAATAAGAATGGTTCTCAAGACTACGGTTTGTTCCAGATCAATGACAAATATTGGTGTAGTAAGACCTCCACCCCCGGAAAGGATTGCAATGTGACTTGTAATCAATTGTTGACTGACGATATTACAGTTGCTGCTACCTGTGCGAAGAAGATTTACAAGAGACATAAGTTTAACGCTTGGTACGGATGGTTAAACCACTGTCAACACTCTCTTCCAGACATTAGCGACTGTTAA；
根据要连接的表达载体pPICZαA和上述柞蚕溶菌酶基因序列，选择NotI和XhoI两种限制性内切酶，设计含有酶切位点的上下游引物，引物序列如下：
Aplyz-F：TCTACTCGAGAAAAGAAAGTGGTTTACCA
Aplyz-R：TCGCTGACAATTCGCCGGCGTATAT
首先进行正常PCR，扩增柞蚕溶菌酶基因，与T载体连接后留存菌种，后选用易错PCR和DNA改组两种方法构建柞蚕溶菌酶的基因突变文库。
易错PCR的具体操作步骤如下：
以柞蚕溶菌酶基因为模板，加入设计好的上下游引物，调整体系配比以及反应条件，进行易错PCR，反应体系配比如下：
PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，共50个循环。1％琼脂糖凝胶电泳45min，凝胶成像仪检测并记录结果。
DNA改组的具体操作步骤如下：
选取与柞蚕溶菌酶基因序列具有同源性的人源溶菌酶基因4(LYZL4)的基因和人源溶菌酶基因6(LYZL6)的基因，对柞蚕溶菌酶基因进行改组。其中，人源溶菌酶基因4的基因序列如下：
GAATTCCTCGAGTACATCTTAGGTAGATGTACTGTCGCAAAGAAACTGCATGACGGAGGTCTGGATTACTTCGAAGGATACTCTCTTGAGAATTGGGTGTGCTTGGCCTATTTTGAGTCTAAGTTCAATCCAATGGCCATATATGAAAATACTAGAGAGGGTTATACCGGATTTGGATTGTTTCAGATGAGAGGTAGTGATTGGTGCGGTGACCATGGTAGAAACAGATGTCATATGTCATGTTCCGCATTATTGAACCCAAACCTTGAAAAAACTATTAAGTGCGCTAAAACTATTGTTAAGGGTAAAGAAGGTATGGGTGCTTGGCCTACCTGGTCTAGATATTGTCAATACAGTGATACATTGGCTAGATGGCTAGACGGATGTAAGCTTTAAGCGGCCGC
人源溶菌酶基因6的基因序列如下：
GAATTCCTCGAGTCTTTGATTTCTAGATGCGATTTGGCTCAAGTTTTGCAGTTGGAGGACTTGGACGGTTTCGAGGGTTACTCTTTGTCTGACTGGTTGTGCTTGGCCTTCGTCGAGTCTAAGTTCAACATCTCTAAGATCAACGAGAACGCCGACGGATCTTTCGACTACGGATTGTTCCAGATCAACTCTCACTACTGGTGCAACGACTACAAATCTTACTCTGAGAACTTGTGCCATGTCGATTGCCAGGACTTGTTGAACCCAAACTTGTTGGCTGGAATCCATTGCGCCAAGAGAATCGTCTCTGGAGCCAGAGGAATGAACAACTGGGTCGAGTGGAGATTGCACTGCTCTGGTAGACCTTTGTTCTATTGGTTGACCGGTTGCAGATTGAGATGAGCGGCCGC
根据柞蚕溶菌酶基因序列、人源溶菌酶基因4基因序列和人源溶菌酶基因6基因序列设计含有相同酶切位点的引物。设计引物如下：
柞蚕溶菌酶基因、人源溶菌酶基因4、人源溶菌酶基因6各取20μl进行混合，加入6μl的DNaseI缓冲液，加入0.2U左右的DNaseI，酶切15min，加入10μlEDTA，75℃酶失活10min。酶切后的混合体系采用1.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳45min，凝胶成像仪检测并记录结果。
选取50bp左右处条带，在紫外灯下将胶块切下，加入3倍体积TE溶液，放入70℃水浴中至凝胶熔化，加入等体积的平衡酚抽提一次，12000rpm离心10min取上清转入另一PE管中，去除多余的琼脂。用等体积的酚:(氯仿:异戊醇)(1:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提一次，取上清。
加入总体积1/10的乙酸钠(pH5.2)，再加入三倍体积预冷的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱中冷冻过夜。将离心管取出，放入预冷的4℃离心机，13000rpm高速离心15min，将上清尽可能吸除干净后，向两离心管中各加入1ml 75％的冰冻乙醇，13000rpm，离心10min。重复加入1ml 75％的冰冻乙醇，再次除盐。室温下自然风干，向两支离心管中各加入13μL去离子水溶解DNA，后从离心管中各取3μL DNA溶液跑电泳检查乙醇沉淀后回收效果。
以回收的小片段DNA产物为模板，不加引物，利用同源重组，使小片段之间互相作为模板，进行无引物PCR，体系如下：
PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，46℃退火1min，72℃延伸30s，共50个循环，最后72℃延伸10min。对无引物PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳45min，凝胶成像仪检测并记录结果，并利用胶回收试剂盒回收400bp左右处DNA。为了增加片段的丰富性，可再次利用DNaseI进行酶切并无引物PCR，再次回收。
利用无引物PCR产物为模板，加入上述的六种引物，进行有引物PCR，体系如下：
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55.5℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳45min，凝胶成像仪检测并记录结果，并利用胶回收试剂盒回收400bp左右处DNA。
选用NotI和XhoI限制性内切酶，对易错PCR产物和DNA改组产物以及表达质粒pPICZαA进行双酶切。双酶切后对体系进行电泳，回收所需大小片段，再次将胶回收产物进行电泳，根据条带亮度判断浓度比例，将目的基因和表达质粒连接过夜，构成重组表达质粒。
将重组质粒转入Top10感受态细胞中，后将转入重组质粒的感受态细胞悬液全部涂于平板上，每个直径90mm的平板上涂布100-200μl转入重组质粒的感受态细胞悬液，37℃培养16h左右。用无菌水将生长好的菌株从平板上冲下，形成菌悬液，回收菌悬液，利用提质粒试剂盒提取菌悬液中的重组质粒。
实施例2：将重组表达质粒转入毕赤酵母细胞
毕赤酵母表达系统是一种良好的真核表达系统，结合pPICZαA表达质粒可以实现良好的胞外表达。
毕赤酵母感受态细胞制备具体操作步骤如下：
(1)挑取YPDS平板上的毕赤酵母GS115单克隆接种于10ml YPD液体培养基中，为保证通气量，用6层纱布封口，30℃，250rpm培养过夜。
(2)按1％的接种量转接于含50ml YPD液体培养基的250ml带挡板锥形瓶中。30℃，250rpm震荡培养约20h至OD600为1.3-1.5。
(3)将菌液移入预冷的50ml的离心管中，冰浴至少30min，使细胞充分冷却，4℃，4 000rpm，离心5min收集细胞。
(4)小心弃上清液，用50ml冰预冷的无菌去离子水重悬菌体，4℃，4 000rpm，离心5min。
(5)用25ml冰预冷的无菌去离子水再次重悬菌体。
(6)小心弃上清，用5ml冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬细胞菌体，4℃，4 000rpm，离心5min。
(7)小心弃上清液，用1ml山梨醇重悬菌体，按每管80μL分装备用。
重组质粒电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞的具体步骤如下：
(1)将10μL线性化的重组质粒pPICZαA-ApLyz加入80μL毕赤酵母GS115感受态细胞中，冰上预冷10min。
(2)将电转仪的电转电压调节到1.5kV。
(3)将冰浴后的混合液加入到0.2cm预冷的电转杯中，轻扣几下，使混合液沉到电转杯底部，轻轻拭去电转杯外的水。
(4)将电转杯放入电转仪中，电击时间约5.0ms，电击结束后立即加入1ml预冷的1mol/L的山梨醇溶液。
(5)将电击后的菌液移入无菌离心管中，30℃静置培养1h后加入500μLYPD液体培养基轻轻混匀，继续静置复苏1h。
(6)复苏液涂布于含较低浓度Zeocin(100μg/ml)抗性的YPDS筛选平板上，每个平板涂布200μL，将全部复苏液涂完。
(7)30℃恒温静置培养48h。
实施例3：构建胞内表达“青色荧光蛋白-TEV蛋白酶的识别位点-黄色荧光蛋白”的大肠杆菌
大肠杆菌是一种典型的革兰氏阴性菌，方便得到，易操作易培养，细胞壁具有脂多糖外膜，溶菌酶对其裂解效果较差。
根据NCBI数据库中查找到的荧光蛋白基因和TEV蛋白酶的识别位点基因序列，合成两端分别含有XhoI、NocI酶切位点的“青色荧光蛋白-TEV蛋白酶的识别位点-黄色荧光蛋白”基因序列。利用两种限制性内切酶分别对含有该蛋白对基因的克隆质粒和表达质粒pET28a进行双酶切，电泳回收所需片段。配制连接体系，将荧光蛋白对基因和表达质粒pET28a过夜连接，构建重组表达质粒。
取出BL21(DE3)感受态细胞在冰上融化1-2min，将过夜连接体系全部加入感受态细胞中，冰浴30min后转入42℃水浴90s，立即转入冰中2-3min后，每管加入900μl LB培养基，37℃200rpm复苏1h。将复苏好的菌悬液吸取100μl涂于含有卡那霉素的LB平板上。
利用pET28a通用引物，对平板上长出菌落进行菌落PCR扩增，验证成功转入质粒的大肠杆菌，然后进行发酵，发酵具体步骤如下：
1)将成功转入重组表达质粒的大肠杆菌转入50ml含有适量卡那霉素的LB液体培养基(锥形瓶，250ml规格)，37℃摇床培养至OD600为0.4-1之间，最好为0.6，大约3h。
2)取现制的浓度为100mM的IPTG 0.5ml加入一组培养基中，使其工作浓度为1mM(由于pET28a含有T7lac启动子，如果其他质粒含有T7启动子，则将IPTG工作浓度稀释为0.4mM)；另一组培养基不加IPTG，作对照，将两组继续摇床培养3h。
3)将锥形瓶在冰上放置5min后，4℃5000×g离心5min，弃上清，菌体用1/4容器体积经预冷的无菌水重悬菌种，再次离心，4℃5000×g离心5min。
4)无菌水重悬菌种。
实施例4：筛选对大肠杆菌杀菌活性高的新型柞蚕溶菌酶
将YPD平板上长好的带有溶菌酶基因的毕赤酵母，挑入装有1ml BMGY培养基的96深孔板中，一个菌种挑入一个孔中，培养3天后，4000rpm离心20min，弃上清，每孔加入1ml的BMMY培养基，加入20μl甲醇，每隔24h每孔加入20μl甲醇诱导发酵表达，发酵72h后停止发酵。
将表达好的发酵液每孔吸取100μl，孔孔对应的转移入透明的正常96孔板后，每孔再加入100μl水，吹打混匀，放入酶标仪中测得OD600值。
向胞内表达荧光蛋白对的大肠杆菌菌悬液中，加入TEV蛋白酶及TEV蛋白酶缓冲液，加入量根据检测量所需计算(检测时，每孔加入150μl菌悬液、0.8μl TEV蛋白酶缓冲液和0.5μl TEV蛋白酶)，混合好后形成底物混合液，向黑色96孔板中每孔加入151μl底物混合液。
向黑色96孔板中每孔加入50μl发酵液(最后两孔不加入发酵液，只加入底物混合液作为阴性对照)，立即吸打1-2次，放入酶标仪中进行检测，激发波长为433nm，发射波长为475nm，每隔1min检测一次，共检测45min中，反应4h后，再检测10min，每隔1min检测一次。
检测后，将数据经前文所说方法分析处理，得到含对大肠杆菌杀菌活性高的溶菌酶的酵母菌种，将菌种扩大培养，诱导发酵，进行复筛，将数据经前文所说方法分析处理，验证其活性。提取最终得到的阳性酵母的全基因组，扩增目的基因并进行测序，得到具有高革兰氏阴性菌杀菌活性的新型溶菌酶的基因序列。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
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<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Aplyz-F
<400> 1
tctactcgag aaaagaaagt ggtttacca 29
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Aplyz-R
<400> 2
tcgctgacaa ttcgccggcg tatat 25
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 柞蚕溶菌酶上游引物
<400> 3
tctactcgag aaaagaaagt ggtttacca 29
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 柞蚕溶菌酶下游引物
<400> 4
tatatgcggc cgcttaacag tcgct 25
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人源溶菌酶4上游引物
<400> 5
tctactcgag tacatcttag gtagatgtac t 31
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人源溶菌酶4下游引物
<400> 6
tatatgcggc cgcttaaagc tta 23
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人源溶菌酶基因6上游引物
<400> 7
tctactcgag tctttgattt ctagatg 27
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人源溶菌酶基因6下游引物
<400> 8
tatatgcggc cgctcatctc aat 23
<210> 9
<211> 363
<212> DNA
<213> 柞蚕溶菌酶基因
<400> 9
aagtggttta ccaaatgtgg tctagtgcac gagctgagga gacaaggctt cgacgagagc 60
ctaatgagag actgggtctg tttggttgag aacgaaagca gcagatatac taataaaatc 120
ggtaaagtga ataagaatgg ttctcaagac tacggtttgt tccagatcaa tgacaaatat 180
tggtgtagta agacctccac ccccggaaag gattgcaatg tgacttgtaa tcaattgttg 240
actgacgata ttacagttgc tgctacctgt gcgaagaaga tttacaagag acataagttt 300
aacgcttggt acggatggtt aaaccactgt caacactctc ttccagacat tagcgactgt 360
taa 363
<210> 10
<211> 404
<212> DNA
<213> 人源溶菌酶基因4
<400> 10
gaattcctcg agtacatctt aggtagatgt actgtcgcaa agaaactgca tgacggaggt 60
ctggattact tcgaaggata ctctcttgag aattgggtgt gcttggccta ttttgagtct 120
aagttcaatc caatggccat atatgaaaat actagagagg gttataccgg atttggattg 180
tttcagatga gaggtagtga ttggtgcggt gaccatggta gaaacagatg tcatatgtca 240
tgttccgcat tattgaaccc aaaccttgaa aaaactatta agtgcgctaa aactattgtt 300
aagggtaaag aaggtatggg tgcttggcct acctggtcta gatattgtca atacagtgat 360
acattggcta gatggctaga cggatgtaag ctttaagcgg ccgc 404
<210> 11
<211> 410
<212> DNA
<213> 人源溶菌酶基因6
<400> 11
gaattcctcg agtctttgat ttctagatgc gatttggctc aagttttgca gttggaggac 60
ttggacggtt tcgagggtta ctctttgtct gactggttgt gcttggcctt cgtcgagtct 120
aagttcaaca tctctaagat caacgagaac gccgacggat ctttcgacta cggattgttc 180
cagatcaact ctcactactg gtgcaacgac tacaaatctt actctgagaa cttgtgccat 240
gtcgattgcc aggacttgtt gaacccaaac ttgttggctg gaatccattg cgccaagaga 300
atcgtctctg gagccagagg aatgaacaac tgggtcgagt ggagattgca ctgctctggt 360
agacctttgt tctattggtt gaccggttgc agattgagat gagcggccgc 410
<170> 手工
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> TEV蛋白酶识别位点
<400> 12
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
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