技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用高分辨率熔解曲线技术鉴定麦冬道地性的方法。
背景技术
麦冬是指以麦冬为名的百合科沿阶草属(Ophiopogon Ker-Gawl.)和山麦冬书(LiriopeLour.)植物，其块根为常用中药。其主要的药用化学成分为甾体皂苷、麦冬多糖等。药理学研究结果显示，麦冬有降血糖、抗衰老、抗氧化及改善心脑血管疾病等方面的作用。麦冬入药始载于《神农本草经》，在我国栽培历史有1200年之久，著名道地性产地有浙江杭州与慈溪(杭麦冬)、四川三台(川麦冬)、福建泉州(福建麦冬)、湖北襄樊(湖北麦冬)等地。对几种著名药材麦冬的鉴定结果表明：杭麦冬、川麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬；湖北麦冬为百合科山麦冬属植物山麦冬的变种，福建麦冬为短葶山麦冬。其中杭麦冬品质上佳，为著名的道地药材“浙八味”之一。
传统鉴别中药材的方法难以精准区分麦冬与其混伪品。DNA条形码技术在2003年被首次提出，并且迅速在物种的分类与鉴定研究领域中得到广泛的关注和应用。它是一种新型物种分子鉴定技术。该技术可以利用短的、标准的DNA序列片段作为物种标记，定位亲缘关系，分析分支来源，为中药材提供快速、精准的鉴定。它弥补了传统鉴定方法的缺陷，并具有自身独特的优势，例如准确性高、稳定性好、操作简便等。
由于核基因ITS2具有很强的物种水平鉴定能力和良好的PCR扩增效率，因此适合作为植物DNA条形码的序列。ITS2区域可以潜在地用作标准DNA条形码识别药用植物及其近缘种，并且可以作为一个新的通用条码来更广泛地识别植物类群。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速精准鉴定道地性麦冬的检测方法，本发明采用高分辨率熔解曲线分析技术检测ITS2序列，分析熔解曲线特征及差异能够有效准确地鉴定浙江麦冬道地性。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速精准鉴定道地性麦冬的检测方法，包括DNA提取，还包括以下步骤：
一、设置参数
1)、PCR扩增
PCR扩增体系为：
反应成分 浓度 体积(μl) 引物F(μl) 10μM 0.2 引物R(μl) 10μM 0.2 Green-2-Go Master mix 2× 5 Template*(DNA) 5～30ng/μl 0.5 RNase free H2O to Total Volume 10
扩增体系中所用的ITS2的引物序列：
引物F(ITS2-F)：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；
引物R(ITS3-R)：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。
PCR扩增程序为：
95℃变性5min；
95℃变性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为55～59℃(最佳退火温度为57℃)；
Green-2-Go Master mix，即为Green-2-Go qPCR Mastermix-Low ROX(2x)；
2)、将扩增产物直接进行HRM(即，上述40个循环后进入HRM程序)：
HRM程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃；
收集65～95℃的荧光信号数据。
二、将浙麦冬标准品(浙江道地性麦冬)和待测样品分别按照步骤一所述参数进行HRM；
以浙麦冬标准品(浙江道地性麦冬)为参照做基线，待测样品与基线所产生的相对荧光值的差值为纵坐标生成派生熔解曲线，从而获得高分辨率熔解曲线差异图；
当待测样品与基线所产生的相对荧光值的差值在-6.969～8.031之间，判定是浙江麦冬；
反之，则判定为非浙江麦冬。
作为本发明技术方案的改进：所述高分辨率熔解曲线分析，是在Roche LightCyclerTM 480Ⅱ荧光定量PCR仪器上进行HRM。所用软件为Light Cycler 480Ⅱ分析软件。当待测样品与基线所产生的相对荧光值的差值在-6.969～8.031之间，判定是浙江麦冬；四川麦冬在Tm值89.5℃时出现正向的偏离峰，且差值正向高于8.031；湖北麦冬在Tm值90.5℃时出现负向的偏离峰，且差值负向低于-6.969。
在本发明中，所用数据分析方法为HRM差异图分型法，直接对熔解曲线进行比较，通过软件归一化后，以荧光信号的差值建立标准模型。
作为本发明技术方案的改进：本发明利用磁珠法深加工产品基因组DNA抽提试剂盒提取麦冬药材干粉的DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度测定。所得DNA浓度为5.57～9.1ng/μl。
在本发明中，PCR扩增时，不同产地麦冬的PCR产物长度在400-450bp之间；PCR产物产物进行HRM时，以浙江道地性麦冬为参照做基线，与其他样品产生相对荧光值的差值为纵坐标生成派生熔解曲线，将其间差异放大，便于区分不同产地麦冬，即，获得高分辨率熔解曲线差异图。
在本发明中，还进行过如下的实验：
取扩增产物20ul，用4.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5％ug/ul EB)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。浙江道地性麦冬与其他产地的麦冬均具有400-450bp左右的条带。
本发明在做高分辨率熔解曲线分析时发现不同产地麦冬表现出的形状和出峰位置的差异不明显，以浙江道地性麦冬为基线派生出的归一化熔解曲线将差异放大，获得了不同产地具有明显差异且同产地相聚类的曲线。
本发明以建立ITS2序列高分辨率熔解曲线模型为基础进行物种鉴定，根据ITS2通用引物扩增获得PCR产物的实时熔解曲线形状及Tm值差异区分物种。高分辨率熔解曲线分析在Roche LightCyclerTM 480Ⅱ荧光定量PCR仪器上运行。
本发明直接获得高分辨率熔解曲线分析，从而建立麦冬及近缘物种熔解曲线差异图曲线模型，根据参照基线及对应Tm值差异所得导图来区分不同产地及不同种药材。
综上所述，本发明采用的技术方案是：以麦冬药材干品为材料，提取基因组DNA，利用ITS2序列的通用引物进行荧光定量PCR扩增，利用高分辨率熔解曲线峰值的Tm值差异鉴定道地性麦冬。扩增得到PCR产物，通过饱和染料对PCR产物的熔解曲线的实时变化的监测进行HRM测定，进行物种鉴定。
本发明具有如下技术优势：
1)、灵敏度高，HRM可区分单碱基突变，能够高灵敏度地鉴定基因多态性分型结果。
2)、快速高效，HRM在几十分钟内即可完成反应，能够快速高效鉴定物种。
3)、简单直观，根据产物不同Tm熔解曲线形状，能够快速直观地鉴定物种。
本发明首次建立麦冬高分辨率熔解曲线模型，利用高分辨率熔解曲线技术针对麦冬ITS2序列获得不同产区的曲线形状，与传统ITS2作为DNA条码的测序分析方法比较，具有快速直观高效的优点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为麦冬及近缘物种鉴定的高分辨率熔解曲线图。
A：浙江麦冬；B：四川麦冬；C：湖北麦冬。
图2为浙江麦冬及近缘物种PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图。
M：DNA Ladder；1-4：浙江麦冬样品；5-6：四川麦冬；7：湖北麦冬。
图3为退火温度50℃时PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图。
M：DNA Ladder；1-4：浙江麦冬样品；5-6：四川麦冬；7：湖北麦冬。
图4为退火温度60℃时PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图；
M：DNA Ladder；1-4：浙江麦冬样品；5-6：四川麦冬；7：湖北麦冬。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、一种浙江道地性麦冬的鉴定方法，依次进行以下步骤：
1)、DNA提取：利用磁珠法深加工产品基因组DNA抽提试剂盒提取麦冬药材干粉的DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度测定。所得DNA浓度为5.57～9.1ng/ul。
利用RNase free H2O进行稀释，调整DNA浓度到5ng/ul。
2)、设置参数：以浙江麦冬及其近缘物种的DNA为模板进行PCR扩增后进入HRM程序：
①、PCR扩增
PCR扩增体系为：
反应成分 浓度 体积(μl) 引物F(μl) 10μM 0.2 引物R(μl) 10μM 0.2 Green-2-Go Master mix 2× 5 Template*(DNA) 5ng/ul 0.5 RNase free H2O to Total Volume 10
PCR扩增程序为：
95℃变性5min；
95℃变性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为57℃；
取扩增产物20ul，用4.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5％ug/ul EB)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。如图2所示。
在图2中，浙江道地性麦冬与其他产地的麦冬(四川，湖北麦冬)具有的条带均具有约400bp的条带，该条带的序列如SEQ ID NO：3所示。
②、40个循环后进入HRM程序，即，将扩增产物直接进行HRM。
HRM程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃。
高分辨率熔解曲线分析：在Roche LightCyclerTM 480Ⅱ荧光定量PCR仪器上行HRM，收集65～95℃的荧光信号数据，使用Lingt Cycler 480Ⅱ分析软件，以浙江道地性麦冬为参照做基线，与其他样品产生相对荧光值的差值为纵坐标生成派生熔解曲线，将其间差异放大，从而获得高分辨率熔解曲线差异图。
当待测样品与基线所产生的相对荧光值的差值为-6.969～8.031之间，判定是浙江麦冬；
反之，则判定为非浙江麦冬。
即，所得的熔解曲线在图2中与所述的基线进行比对，当差异值为-6.969～8.031之间时，判定为浙江麦冬；反之，则判定为非浙江麦冬。
结果为：当样品为浙江麦冬时，熔解曲线如图2的A所述。
实验一、将事先已知是浙江麦冬的20个批次的待测品，已浙江麦冬为基线，按照实施例1所述方法进行检测，所得结果均为：其熔解曲线差异图中与基线的差值均在-6.969～8.031之间。
实验二、将事先已知是浙江麦冬、四川麦冬、湖北麦冬的待测品(每类待测品均选用5个批次)按照实施例1所述方法进行检测，所得结果为：
浙麦冬，熔解曲线如图1的A所述线形，差值均在-6.969～8.031之间；
四川麦冬，熔解曲线如图1的B所述峰形，Tm值89.5℃出现正向偏离基线高于8.031的曲线；
湖北麦冬，熔解曲线如图1的C所述峰形，Tm值90.5℃出现负向偏离基线低于-6.969的峰。
对比例1-1、将实施例1中的退火温度由作为最佳温度的57℃改成50℃，其余同实施例1。
所得结果为：PCR扩增效率较差1号和6、7号样品均未扩增出目的条带，2号样品扩增出400bp左右条带，但扩增产物浓度较低(图3)，不适于进行后续的HRM程序。
对比例1-2、将实施例1中的退火温度由作为最佳温度的57℃改成60℃，其余同实施例1。
所得结果为：除2号样品扩增出较淡条带外，其余样品均扩增失败(图4)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江理工大学
<120> 浙江道地性麦冬的鉴定方法
<160> 3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITS2-F
<400> 1
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITS3-R
<400> 2
gacgcttctc cagactacaa t 21
<210> 3
<211> 417
<212> DNA
<213> 麦冬(Ophiopogon japonicus (Linn. f.) Ker-Gawl.)
<400> 3
cgctcgccgt tactagggga atcctggtaa gtttcttctc ctccgcttat tgatatgctt 60
aagctcagcg ggtggccccg cctgacctgg ggtcgtgttc cgagggatgc tcggcgtggg 120
ttccttgcat gtaccgccgt ggccgggggg cggaggcgac gttcagcgcc gtacgtgtcc 180
gtccaccact cgccgcgtcc gtcccgaccg gcggtacgca cttcgacccg ccgcgccgtc 240
aggcacgggg ggccaatctc cgcatccgca cccgccgcct catcgggacg gggtgcacgg 300
agcgacgcga ggcgtgacgc ccaggcaggc gtgccctcgg ccggatagcc tcgggcgcaa 360
cttgcgttca aagactcgat ggttcacggg attctgcaat tcacaccaag tatcgca 417