技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于酶切法检测β-酪蛋 白基因型的方法。
背景技术
牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种，酪蛋白在牛奶 蛋白中的含量约占80％左右，乳清蛋白约占14％。牛奶蛋白中一般含 有四种酪蛋白，αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白， 其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％。
β-酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基 酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G。目前 大多数养殖奶牛生产的β-酪蛋白，主要为A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋 白两种类型。在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4-11个氨基 酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽——β-酪啡肽，BCM7 (Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile)就是从这类多肽中分离出来的一种类似 吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要 是由A1-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生， 这是由于A2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有 比较稳定的二级结构，而A1-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级 结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性 心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面 的疾病。
A1β-酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研 究，A1β-酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世 界卫生组织。新西兰流行病学证据表明A2牛奶比A1牛奶更有益于人 类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中A1牛奶与心脏病发 病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与A1牛奶的消耗有很 强的关联性(s＝0.86)。Elliott比较了10个国家0-14岁儿童I型糖 尿病的发病率，A1β-酪蛋白与其有较大的关联性(s＝0.726)，在冰 岛，由于当地的奶牛主要为A2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病 率很低。动物学实验也表明表明，喂养A1牛奶的兔子与喂养A2牛奶 的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。
因此，我们需要找到一种能够有效区分A1奶牛和A2奶牛的方法， 从而使得养殖场只繁育A2奶牛，但目前的检测方法无法检测出β-酪 蛋白不同的基因型，不能保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
发明内容
鉴于目前检测β-酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本发明提 供一种检测出β-酪蛋白不同的基因型的基于酶切法检测β-酪蛋白基 因型的方法。
为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步 骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物， 所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I 酶切位点；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进 行判断。
依照本发明的一个方面，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断， 具体为：
如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开或存在一个253bp的条带, 则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；
如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和 一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；
如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和 一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
依照本发明的一个方面，所述酶切的体系包括PCR产物9ul、限制 性内切酶0.2ul和缓冲液1ul；所述酶切的条件为37℃孵育1-8h，65 ℃热失活20min。
依照本发明的一个方面，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出 含有Dde I酶切位点的引物，所述酶切的条件为37℃孵育2h，65℃热 失活20min。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、 热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP1ul、10uM上下游引物 各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O至20ul。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件：在温度为92-95 ℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-65 ℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后 在温度为68-72℃时延伸7min。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增进行35个循环。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件：在温度为95℃时 预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为61℃时退火 30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72 ℃时延伸7min。
本发明实施的优点：本发明的检测方法首先根据β-酪蛋白的碱基 序列，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引 物，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
然后利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个 Dde I酶切位点；再用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增； 最后利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进 行判断，本发明的检测方法利用A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白67位氨 基酸的第二个碱基不同，设计出特异性的引物，使A2β-酪蛋白产生一 个Dde I酶切位点，而A1β-酪蛋白没有酶切位点，然后利用酶切技术， 从而有效区分出A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白，因此，本发明人提供的 基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基 因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例 中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图 仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述的一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法 的示意图；
图2为本发明所述酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
如图1、图2所示，一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法， 该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物， 所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCAAAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I 酶切位点；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进 行判断。
由于牛奶中蛋白质主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，牛奶蛋白中 一般含有四种酪蛋白：αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ- 酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％，是氨基酸的重要 来源，同时在体内传递重要的矿物质(如钙和磷等)，促进其消化吸 收，β-酪蛋白有两种主要的变异型，即A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白， 由于A2β-酪蛋白具有能下优点：
a、A2β-酪蛋白是自然源生的牛奶蛋白，目前A2β-酪蛋白的奶源 非常稀有；
b、A2β-酪蛋白更接近母乳的蛋白质；
c、更贴合人体的消化系统，能更天然地呵护消化吸收，同时，A2β- 酪蛋白则不会生成BCM-7(因为BCM-7与部分婴儿的1型糖尿病风险升 高、免疫反应、消化功能紊乱、自闭症和呼吸功能障碍之间存在关联)。
因此，含有A2β-酪蛋白的牛奶(也就是A2牛奶)受到人们的欢 迎，但要甄选出基因纯正的A2奶牛确保生产出合格的A2牛奶，需要 极高的技术和专业的质量检测方法。
为了解决上述难题，本发明公开了一种基于酶切法检测β-酪蛋白 基因型的方法，下面对本发明所述的一种基于酶切法检测β-酪蛋白基 因型的方法作进一步说明，该方法具体包含以下步骤：
步骤S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点 的引物；
本发明的检测方法根据β-酪蛋白的碱基序列，在β-酪蛋白的67 位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，一般在β-酪蛋白67 位氨基酸的第二个碱基设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的 序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’
步骤S2：利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产 生一个Dde I酶切位点；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I 酶切位点，酶切之后就会产生一个218bp的条带和一个35bp的小条带。
步骤S3：用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
将待检测的奶牛基因组DNA用设计出的引物进行PCR扩增，PCR扩 增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP 1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O 至20ul；PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在 温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-65℃时退火30s、在温度 为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸 7min，实际使用时PCR扩增的最优条件为在温度为95℃时预变性5 min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为61℃时退火30s、在 温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸 7min。
步骤S4：利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳 的结果进行判断。
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，酶切的体系包括PCR产物9ul、 限制性内切酶0.2ul和缓冲液1ul，酶切的条件为37℃孵育1-8h， 65℃热失活20min，实际应用中，最优的酶切的条件为37℃孵育2h， 65℃热失活20min。根据酶切产物的琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断 β-酪蛋白的基因型，如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开，也就 是说PCR扩增后的产物存在一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1β- 酪蛋白；如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条 带和一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；如果PCR扩增后 的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带,则 β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
本发明的检测方法利用A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白67位氨基酸 的第二个碱基不同，设计出特异性的引物，使A2β-酪蛋白产生一个 Dde I酶切位点，而A1β-酪蛋白没有酶切位点，然后利用酶切技术， 从而有效区分出A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白，因此，本发明人提供的 基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基 因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范 围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。