技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种强冬性白菜型冬油菜POD酶活性基因QTL位点，同时还涉及与强冬性白菜型冬油菜POD酶活性基因QTL位点连锁的分子标记。
背景技术
白菜型油菜在我国栽培历史悠久，种质资源丰富，是我国重要的油料作物之一。但白菜型油菜以春性为主，强冬性白菜型冬油菜种质缺乏，尤其适宜北方旱寒区种植的强冬性冬油菜品种缺乏。我国北方气候严寒，冬油菜具备优异的抗寒性才能安全越冬，因此抗寒品种选育是北方冬油菜发展的关键。采用常规育种方法选育抗寒材料费时费力，且选择效率较低，如果借助分子标记辅助育种，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。
POD是植物重要的保护性酶之一，在抵御外界低温环境中起着积极作用。因此POD酶活性的高低是衡量植物抗寒性强弱的指标之一。关于POD酶活性及其基因的研究很多，研究认为其符合数量性状的遗传特点。但不同作物中，其基因序列，表达模式、遗传效益有所不同。近年强冬性白菜型冬油菜中POD酶活性的研究甚多，但对其分子标记及QTL定位的研究尚未见报道。本研究通过QTL定位，旨在筛选出POD的QTL位点和分子标记，用于POD基因的克隆和强冬性白菜型冬油菜抗寒育种的分子标记辅助选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供了1个强冬性白菜型冬油菜POD酶活性的QTL位点，该位点的效应值比较高，对强冬性白菜型冬油菜POD酶活性调控起着重要作用，可用作定位克隆和分子标记辅助选择。
本发明还提供2个白菜型冬油菜油POD酶活性的QTL位点连锁的分子标记，这些标记与QTL位点的遗传距离较近且是基于 PCR 技术的SSR和InDel标记，因而可靠且使用方便，这对白菜型冬油菜抗寒育种提供便利。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：
强冬性白菜型冬油菜POD酶分子标记及QTL定位，其筛选包括有以下步骤：
（1）构建分离群体：利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜‘陇油7号’和强抗寒冬油菜‘陇油9号’配置杂交组合,杂交F1代自交产生F2代分离群体。本发明用到的实验材料由甘肃农业大学油菜遗传育种课题组提供。
（2）油菜叶片DNA提取：采用改进的CTAB法提取亲本‘陇油7号’和 ‘陇油9号’及F2代分离群体的叶片DNA。
（3）引物来源及合成：由上海生物工程技术有限公司合成315对引物，引物来源于www.UK crop.net发表的油菜微卫星引物序列以及Brassica Database网站http://brassicadb.org/上公布的10个染色体上的所有引物，其中SSR引物51对，InDel 引物264对。
（4）多态性引物筛选：利用合成的引物对两亲本DNA进行PCR扩增，筛选出具有多态性的引物。该过程涉及PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、照相等步骤。
（5）多态性引物在F2代检测：将筛选出的多态性引物在F2代中进行检测，获得基因型数据，该过程与（4）步骤基本相同。
（6）遗传连锁图构建及QTL定位：根据F2代基因型数据，利用QTL IciMapping V3.3软件进行遗传连锁图构建及QTL定位。
通过筛选步骤获得了强冬性白菜型冬油菜POD酶的1个QTL位点，命名为：Qpod.gsau-10A，与1个强冬性白菜型冬油菜POD酶的1个QTL位点连锁的2个分子标记，分别是： BrID90115、Ra2-E07，2个分子标记的序列分别如下：
BrID90115-F：TTCAACAAAATCAAGACCGAAA
BrID90115-R：AAGGAAAAAGACAAGAGAGATGGA
Ra2-E07-F：ATTGCTGAGATTGGCTCAGG
Ra2-E07-R：CCTACACTTGCGGTCTTCACC。
Qpod.gsau-10A位点位于10A染色体上，与标记BrID90115和Ra2-E07连锁，可解释33.6258%的表型变异，加性效应为-31.1196，显性效应-28.2463。
本发明的有益效果：本发明首次定位得到1个强冬性白菜型冬油菜POD酶活性QTL位点，并给出2个与强冬性白菜型冬油菜POD酶活性QTL位点的标记，可解释33.6258%的表型变异。在常规抗寒育种中，试验材料需通过越冬来判断其抗寒性的强弱，费时费力。通过检测POD酶活性QTL位点，在苗期就可以筛选材料，大大提高了筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。同时POD酶活性QTL位点的获得，可进一步进行POD酶基因的克隆，为白菜型冬油菜抗寒机理的探索提供技术支撑。
附图说明
图1为本发明强冬性超强抗寒冬油菜‘陇油7号’和强抗寒冬油菜‘陇油9号’杂交F2代群体POD酶活性分布图。
图2 为本发明利用两亲本筛选多态性引物。
图3为本发明多态性引物Na14G02在F2代中的检测结果。
图4为本发明Qpod.gsau-10A位点在2A染色体的位置及LOD 曲线示意图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：强冬性白菜型冬油菜分离群体的构建及POD酶活性测定 。
本实施例中使用的分离群体具体构建如下：
（1）2010年8月利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜‘陇油7号’和强抗寒冬油菜‘陇油9号’配置杂交组合，2011年5月收获F1代种子。
（2）2011年8月播种F1种子，2012年4月套袋自交，获得F2代种子。
2012年8月播种F2代种子。待苗期随机选取103株挂牌标记，于11月初采集新鲜幼叶，用冰盒带回实验室并保存于-70℃超低温冰箱。采用愈创木酚比色法测定POD酶活性。结果表明：F2代POD酶活性均呈正态分布，证明POD酶性状属于数量性状（图 1）。
实施例2：亲本和F2代分离群体叶片总DNA的提取。
采用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：
（1）采摘健康幼叶作为提取油菜基因组DNA的材料，用蒸馏水洗净，用纸吸干。
（2）取新鲜的叶片0.5g左右置于研钵中，加入液氮，迅速研磨至发白粉末状后立即装入2ml离心管。
（3）加入已预热的2×CTAB提取缓冲液700ul浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴60min，其间轻柔混合2-3次。
（4）取出离心管，冷却至室温，加入700ul的氯仿/异戊醇（24/1），轻缓颠倒混匀，静置10 min。
（5）13000rpm离心10min。
（6）取上清600ul转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，轻缓颠倒混匀，室温放置10min。
（7）13000rpm离心10min，取上清400ul转移至新离心管中，加等体积已预冷的异丙醇，保存于-20℃，静置20 min。
（8）13000rpm离心10min，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清，用600ul 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干。加入300ul去离子水溶解沉淀。
（9）加入1ul RNase（10mg/ml）置于37℃水浴60 min，每个离心管加300ul去离子水，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。
（10）吸取上清400ul 转入新离心管，加入上清体积1/10的3mol/LNaAC溶液，2.5倍体积的预冷无水乙醇沉淀DNA，置于-20℃，20 min左右，12000rpm离心10min，弃上清。
（11）用600ul 70%的乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥。
（12）加入30??l TE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。（-20°C长期保存）
实施例3：SSR和InDel引物来源、合成及多态性筛选。
（1）从www.UK crop.net发表的油菜微卫星引物序列以及Brassica Database网站http://brassicadb.org/上公布的10个染色体上的所有引物中均匀选取315对。其中SSR引物51对，InDel 引物264对。引物均由上海生物工程技术有限公司合成。
（2）从亲本中各随机选取6株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。
（3）PCR反应体系
PCR反应体系为10ul：
Mix Taq酶 6ul
上引物 0.5ul
下引物 0.5ul
ddH2O 2ul
模板： 1ul
（4）PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性50s，55-60℃复性50s（每个循环的退火温度降低或升高 0.5℃），72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；取出PCR产物4℃保存。
（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，具体操作如下：
a用ddH2O充分洗涤玻璃板、样品梳和橡胶套，置于支架上晾干。
b晾干后，将两块玻璃板对齐扣到一起，装进橡胶套中，并用1%的琼脂糖胶封口，静置30min。
c将两对封好的玻璃板小心装到电泳槽上。
d配置50ml的丙烯酰胺凝胶溶液：将30%丙烯酰胺13.3ml，蒸馏水31ml，10×TBE 5ml，10%过硫酸铵10.7ml和TEMED 3.5ul迅速加入100ml小烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀。
e将上述配好的丙烯酰胺凝胶溶液沿玻璃凹板上部缓缓灌入两块玻璃板间，两对玻璃板胶灌好后，插入梳子，静置1h左右。
f用移液枪在梳子周围加入少许1×TBE缓冲液，轻轻拔出梳子，在电泳槽中灌满1×TBE电极缓冲液。
g每个点样孔加入PCR产物2-3ul。连接电源，在电压200V，电流100mA电泳1h左右。
h关闭电源，回收电极缓冲液，取下玻璃板，撬开玻璃板取出凝胶，用ddH2O冲洗数次准备银染。
（6）银染过程
a固定：在装有凝胶的胶盒中倒入300ml固定液，在脱色摇床上轻摇8min，回收固定液。
b染色：向胶盒中加入300ml染色液，在脱色摇床上轻摇10-15min，回收染色液，用ddH2O冲洗两遍。
c显影：向胶盒中加入300ml显色液，在脱色摇床上轻摇至条带清晰，倒出显色液，用ddH2O冲洗两遍。
d照相：将凝胶置于胶片观察灯上照相。
银染过程中所需试剂配制：
固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，用ddH2O定容至1L。
染色液：2g AgNO3，100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，用ddH2O定容至1L。
显影液：300ml 3%NaOH溶液中加入1.5ml甲醛（现用现配）。
（7）多态性引物筛选
根据电泳结果，筛选出39对在“陇油7号”和“陇油9号”之间扩增重复稳定，条带清晰，具有多态性的引物。
实施例4：多态性引物在F2代中的分布、遗传连锁图构建及QTL分析。
（1）将实施例3得到的39对多态性引物对F2群体103个单株的DNA分别进行PCR扩增，聚丙烯凝胶电泳后银染照相和带型判读，与亲本“陇油7号”相同带型记为“A”，与亲本“陇油9号”相同带型记为“B”，杂合体记为“H”，缺失的带型记为“-”。
（2）统计带型结果，采用QTL IciMapping V3.3 软件计算引物之间的遗传距离，并构建遗传连锁图和QTL分析。筛选出的39对引物分别分布在白菜型油菜10个染色体上。对POD活性进行QTL分析，共检测到1个控制POD活性的 QTL（图4），位于染色体10A上，命名为Qpod.gsau-10A定位区间位于BrID90115~Ra2-E07之间。Qpod.gsau-10A可解释的表型变异为33.6258%。
表1 与强冬性白菜型冬油菜POD酶QTL定位连锁的分子标记
表2强冬性白菜型冬油菜POD酶活性QTL位点基本信息
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。