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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610027861.8 (22)申请日 2016.01.15 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 苏州吉诺瑞生物科技有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区东 平街 199 号 (72)发明人 张函槊 李娟 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 检测人 RIOK2 基因表达量和相对表达量的引 物对 (57) 摘要 本发明公开了检测人 RIOK2 基因表达量和相 对表达量的引物对。本发明公开的检。
2、测人 RIOK2 基因表达量和相对表达量的引物对， 为名称为 RIOK2-P 的由序列表中序列 1 所示的单链 DNA 和 序列2所示的单链DNA组成的引物对。 实验证明， 本发明的引物对能够检测 RIOK2 在宫颈癌组织中 的表达含量， 操作相对简单， 结果准确。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 105463117 A 2016.04.06 CN 105463117 A 1.检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的引物对， 为名称为RIOK2-P的由 序列表中序列1所示的单链。
3、DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。 2.检测或辅助检测人类RIOK2基因表达量或相对表达量的成套试剂， 由权利要求1所述 RIOK2-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。 3.根据权利要求2所述的成套试剂， 其特征在于： 所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的 单链DNA和序列4所示的单链DNA组成。 4.检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒， 由权利要求1所 述引物对或权利要求2或3所述成套试剂与X1组成， 所述X1为进行定量PCR扩增所需试剂。 5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒， 其特征在于： 所述进行定量PCR扩增。
4、所需试剂 为qPCRMIX。 6.检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的系统， 由权利要求1所述引物 对、 权利要求2或3所述成套试剂或权利要求4或5所述试剂或试剂盒与Y1组成， 所述Y1为进 行RNA提取所需的试剂、 进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。 7.鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统， 包括权利要求1所述引物对、 权利要求2 或3所述成套试剂、 权利要求4或5所述试剂或试剂盒或权利要求6所述的系统与基因定量数 据处理系统； 所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基 因的表达量或相对表达量， 根据所述待鉴定组织和/或细。
5、胞的RIOK2基因的表达量或相对表 达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。 8.下述1)或2)的方法： 1)检测RIOK2基因的表达量或相对表达量的方法， 包括以离体的待鉴定组织和/或细胞 的cDNA或RNA为模板， 用权利要求1所述引物对进行PCR扩增， 所述PCR扩增中的退火条件为 5835sec。 2)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法， 包括： 检测来自待鉴定组织和/或细胞 的RIOK2基因的表达量或相对表达量； 如果所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达 量或相对表达量越高， 所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越 大， 如果所述待鉴。
6、定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量越低， 所述待鉴定 组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。 9.权利要求1所述引物对、 权利要求2或3所述成套试剂、 权利要求4或5所述试剂或试剂 盒或权利要求6或7所述系统在下述1)-5)中任一种中的应用： 1)检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量； 2)制备检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量产品； 3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞； 4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。 10.根据权利要求7所述系统、 权利要求8所述方法或权利要求9所述应用， 其特征在于： 权利要求7或8中所述待鉴定。
7、组织和/或细胞为宫颈宫颈组织和/或宫颈宫颈细胞； 权利要求 9中所述肿瘤组织和/或细胞为宫颈癌组织和/或细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105463117 A 2 检测人RIOK2基因表达量和相对表达量的引物对 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中检测人RIOK2基因表达量和相对表达量的引物对。 背景技术 0002 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。 原位癌高发年龄为3035岁， 浸润癌为4555 岁， 近年来其发病有年轻化的趋势。 临床上的诊断方法一般为细胞刮片检测、 阴道镜检测、 组织活检等。 但是， 子宫肌瘤、 子宫内膜异位、 宫颈息肉、 溃疡等原因会对诊断结果的确定性 造。
8、成严重干扰。 因此， 寻找新的宫颈癌诊断标志物至关重要。 0003 RIOK2(RIOkinase2)基因是一种磷酸激酶。 有研究表明该基因与AKT信号通路有 关， 可以调控细胞迁移、 细胞周期、 细胞凋亡等行为。 在宫颈癌当中， 与癌旁组织相比， RIOK2 的表达明显升高。 因此， RIOK2有希望成为潜在的宫颈癌诊断标志物。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是如何检测人RIOK2基因表达量或相对表达量。 0005 为解决上述技术问题， 本发明首先提供了检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或 相对表达量的引物对。 0006 本发明所提供的检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相。
9、对表达量的引物对， 为 名称为RIOK2-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。 0007 为解决上述技术问题， 本发明还提供了检测或辅助检测人类RIOK2基因表达量或 相对表达量的成套试剂。 0008 本发明所提供的检测或辅助检测人类RIOK2基因表达量或相对表达量的成套试 剂， 由所述RIOK2-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。 0009 上述成套试剂中， 所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单 链DNA组成。 0010 为解决上述技术问题， 本发明还提供了检测或辅助检测人RIOK2基因表达。
10、量或相 对表达量的试剂或试剂盒。 0011 本发明所提供的检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的试剂或试剂 盒， 由所述RIOK2-P或所述成套试剂与X1组成， 所述X1为进行定量PCR扩增所需试剂。 0012 上述试剂或试剂盒中， 所述进行定量PCR扩增所需试剂可为qPCRMIX。 qPCRMIX可 为北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司产品。 0013 上述试剂或试剂盒中， 所述定量PCR扩增可为实时荧光定量PCR扩增。 0014 为解决上述技术问题， 本发明还提供了检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相 对表达量的系统。 0015 本发明所提供的检测。
11、或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的系统， 由所 述RIOK2-P、 所述成套试剂或所述试剂或试剂盒与Y1组成， 所述Y1为进行RNA提取所需的试 剂、 进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。 说明书 1/7 页 3 CN 105463117 A 3 0016 上述系统中， 所述进行RNA提取所需的试剂可为TRIzol、 氯仿、 异丙醇和/或乙醇。 TRIzol可为上海捷瑞生物工程有限公司产品。 0017 所述进行反转录所需的试剂可为ReverTranscriptqPCRRTKit中的试剂。 ReverTranscriptqPCRRTKit为Takara公司产品。 0。
12、018 所述进行定量PCR扩增所需仪器可为实时荧光定量pcr仪(如ABI7300或ABI7500 (美国AppliedBiosystems公司)。 0019 为解决上述技术问题， 本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系 统。 0020 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统， 包括所述RIOK2-P、 所述成套试剂、 所述试剂或试剂盒或所述检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达 量的系统与基因定量数据处理系统； 所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组 织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量， 根据所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2 基因的表。
13、达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。 0021 为解决上述技术问题， 本发明还提供了检测RIOK2基因的表达量或相对表达量的 方法。 0022 本发明所提供的检测RIOK2基因的表达量或相对表达量的方法， 包括以离体的待 鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板， 用所述RIOK2-P进行PCR扩增， 所述PCR扩增中的退 火条件可为5835sec。 反应条件具体可为： 95预变性1min； 9515s， 5835sec， 40个循 环。 0023 所述PCR扩增时的反应体系可为25 L反应体系， 具体如下： 2 LcDNA溶液， 12.5 L qPCRMix(。
14、2)， RIOK2-F(RIOK2-F在该反应体系中的浓度为0.2 M)， RIOK2-R(RIOK2-R在该 反应体系中的浓度为0.2 M)， 用无菌蒸馏水补至25 L。 0024 为解决上述技术问题， 本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方 法。 0025 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法， 包括： 检测来自待鉴 定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量； 如果所述待鉴定组织和/或细胞的 RIOK2基因的表达量或相对表达量越高， 所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织 和/或细胞的风险越大， 如果所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达。
15、量或相对表达 量越低， 所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。 0026 上述方法中， 所述待鉴定组织和/或细胞可为宫颈组织和/或宫颈细胞。 0027 为解决上述技术问题， 本发明还提供了所述RIOK2-P、 所述成套试剂、 所述试剂或 试剂盒或所述系统在下述1)-5)中任一种中的应用： 0028 1)检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量； 0029 2)制备检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量产品； 0030 3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞； 0031 4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。 0032 上述应用中， 所述肿瘤组织。
16、和/或细胞可为宫颈癌组织和/或细胞。 0033 实验证明， 本发明的引物对能够检测RIOK2在宫颈癌组织中的表达含量， 操作相对 简单， 结果准确。 说明书 2/7 页 4 CN 105463117 A 4 0034 本发明鉴于现有技术中检测宫颈癌样品标志物的不足， 本发明设计了检测内参/ 目的基因用引物， 用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。 通过调整两个基因的引 物探针浓度及比例， 优化PCR的反应体系和反应条件， 开发了一种用于检测RIOK2基因相对 表达量的试剂盒。 0035 使用本发明的试剂盒， 将实时荧光PCR技术对RIOK2基因的表达水平进行检测， 检 测精度高， 而且。
17、操作简单， 可降低检测成本， 节约检测时间。 采用双标准曲线法， 通过构建 RIOK2和内参基因GAPDH的标准定量曲线， 精确定量样本的内参基因拷贝数和RIOK2拷贝数， 相比于以往的免疫组化方法， 该试剂盒具有精度高， 结果便于判读等优点。 加之该试剂盒将 反应体系所需的引物、 探针进行合理配比和优化， 使实验条件达到最佳， 从而省去了繁琐的 条件摸索环节， 大大提升了实验效率。 该试剂盒经测试特异性好， 灵敏度高， 操作简便。 有助 于临床样品的辅助性检测。 附图说明 0036 图1为RIOK2熔解曲线。 0037 图2为GAPDH熔解曲线。 0038 图3为RIOK2和GAPDH的扩增。
18、曲线。 其中。 左侧为GAPDH扩增曲线， 右侧为RIOK2扩增 曲线。 0039 图4为6位临床宫颈癌患者RIOK2的相对表达量。 具体实施方式 0040 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0041 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0042 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0043 实施例1 0044 本发明的用于检测RIOK2基因相对表达量的试剂盒， 包括： 0045 TRIzol(上海捷瑞生物工程有限公司)； 0046 氯仿； 0047 无。
19、水乙醇； 0048 ReverTranscriptqPCRRTKit(Takara公司)； 0049 检测体系PCR反应液： qPCRMix(2)(北京全式金生物技术(TransGenBiotech) 有限公司)、 RIOK2-F/RIOK2-R各0.2 M 0050 其中， 引物序列为： 0051 RIOK2-F:CGTTACATGAGCCGAGATGA(序列1) 0052 RIOK2-R:ACAGCCACCATGTTTAAGGC(序列2) 0053 GAPDH-F:CATGAGAAGTATGACAACAGCCT(序列3) 0054 GAPDH-R:AGTCCTTCCACGATACCAAAG。
20、T(序列4) 0055 实施例2 0056 本发明试剂盒的使用方法： 说明书 3/7 页 5 CN 105463117 A 5 0057 (1)抽提的组织RNA:取适量的新鲜组织， 加入1mLtrizol在匀浆其中研磨均匀， 加 入0.2ml氯仿， 震荡均匀； 14000rpm4离心10min， 吸取上清层转移至另一新的离心管中； 加入等体积的异丙醇， 上下充分混匀， 室温静置10min； 14000rpm4离心10min， 弃上清， 加 入75乙醇1ml， 轻轻上下颠倒洗涤管壁； 14000rpm4离心5min， 弃乙醇； 室温干燥10- 15min， 加入20ulRNase-free水溶解。
21、沉淀。 0058 (2)参考Takara公司的ReverTranscriptqPCRRTKit试剂盒说明书， 将RNA反转 为cDNA， 得到cDNA溶液， cDNA溶液中cDNA的浓度为50 L/ L。 0059 (3)试剂配置： 每个反应体系均为25 L反应体系， 具体如下： 2 LcDNA溶液， 12.5 L qPCRMix(2)， RIOK2-F或GAPDH-F(RIOK2-F或GAPDH-F在该反应体系中的浓度为0.2 M)， RIOK2-R或GAPDH-R(RIOK2-R或GAPDH-R在该反应体系中的浓度为0.2 M)， 用无菌蒸馏水补 至25 L。 用生理盐水作为空白对照。 0。
22、060 (4)检测： 检测在实时荧光PCR仪上进行， 可用仪器包括ABI7300， ABI7500(美国 AppliedBiosystems公司)等。 反应条件： 95预变性1min； 9515s， 5835sec， 40个循环， 荧光信号于5835sec时采集。 0061 (5)结果判断： 将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上， 系统根据标准曲线和 CT值自动计算出拷贝数。 0062 使用该试剂盒检测得到的溶解度曲线及扩增曲线见图1， 图2和图3。 0063 实施例3 0064 采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本 0065 检测对象： 临床宫颈癌患者6位， (所有样品为宫颈癌I期组织)。。
23、 每个患者的宫颈癌 组织和宫颈癌旁组织成对检测一共6对， 按实施例2试剂盒的使用方法检测待测样本。 每个 样本3次重复， 1份空白对照。 检测时间仅需100分钟。 0066 6位临床宫颈癌患者样本检测结果如下表所示： 0067 说明书 4/7 页 6 CN 105463117 A 6 0068 说明书 5/7 页 7 CN 105463117 A 7 0069 说明书 6/7 页 8 CN 105463117 A 8 0070 6位临床宫颈癌患者样本检测结果总结见图4。 0071 图4结果显示， 使用该引物对能够检测RIOK2在宫颈癌组织中的表达含量， 操作相 对简单， 结果准确。 0072 。
24、本发明鉴于现有技术中检测宫颈癌样品标志物的不足， 本发明设计了检测内参/ 目的基因用引物， 用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。 通过调整两个基因的引 物探针浓度及比例， 优化PCR的反应体系和反应条件， 开发了一种用于检测RIOK2基因相对 表达量的试剂盒。 0073 使用本发明的试剂盒， 将实时荧光PCR技术对RIOK2基因的表达水平进行检测， 检 测精度高， 而且操作简单， 可降低检测成本， 节约检测时间。 采用双标准曲线法， 通过构建 RIOK2和内参基因GAPDH的标准定量曲线， 精确定量样本的内参基因拷贝数和RIOK2拷贝数， 相比于以往的免疫组化方法， 该试剂盒具有精度。
25、高， 结果便于判读等优点。 加之该试剂盒将 反应体系所需的引物、 探针进行合理配比和优化， 使实验条件达到最佳， 从而省去了繁琐的 条件摸索环节， 大大提升了实验效率。 该试剂盒经测试特异性好， 灵敏度高， 操作简便。 有助 于临床样品的辅助性检测。 说明书 7/7 页 9 CN 105463117 A 9 0001 0002 序列表 1/2 页 10 CN 105463117 A 10 序列表 2/2 页 11 CN 105463117 A 11 图1 说明书附图 1/3 页 12 CN 105463117 A 12 图2 说明书附图 2/3 页 13 CN 105463117 A 13 图3 图4 说明书附图 3/3 页 14 CN 105463117 A 14 。