技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种微生物基因改造方法、 用于生产高级脂肪醇、高级脂肪烃的基因工程菌及其应用。
背景技术
当今世界能源问题成为世界经济发展的瓶颈，利用生物质等可再生资源进行物 质的生产成为当今科学研究的热点。
高级脂肪醇不仅是高效的生物柴油，而且在医学和日化用品中也有重要的用途。 随着石油资源的枯竭，脂肪醇的生物法生产受到越来越多的关注。长链的烷类和烯 类是最具前景的生物燃料。其物理性状熔点较低，在生物燃料中最适于用作能源物 质。因此发酵法生产的高级脂肪醇和高级烃类将是一种绿色平台化学品。综合已有 文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的包括能够积累高级脂肪醇和高级烃类 的藻类、用于表面活性剂生产的假单胞菌、遗传和操作背景都很清楚的大肠杆菌等。 其中大肠杆菌的培养条件简单，菌种本身有高级脂肪醇和高级烃类代谢途径，具有 代谢灵活性，易于基因工程改造。对大肠杆菌高级脂肪醇和高级烃类代谢的研究表 明，在以葡萄糖为底物的高级烃的发酵中，高级脂肪醇和高级烃类生成过程如下：(1) 通过糖酵解形成乙酰-CoA；(2)乙酰-CoA进入脂肪酸合成路径形成脂酰-ACP(3) 脂酰-ACP经由脂肪酸形成脂酰-CoA；(4)脂酰-CoA被还原为脂肪醇或经由脂肪醛 还原为高烷类或烯类。
目前国内外对大肠杆菌生产高级脂肪醇和高级烃类的代谢网络途径改造有以下 两种：1、过量表达内源的TesA’(硫酯酶I，ThioesteraseI)和FadD(脂酰-CoA合 成酶，fattyacyl-CoAsynthetase)，与此同时过量表达异源的FAR(脂酰-CoA还原酶， fattyacyl-CoAreductase)。这种改造的出发点是将脂肪酸合成路径的中间产物脂酰 -ACP经由脂酰-CoA转化为脂肪醇。2、过量表达内源的TesA’和FadD，与此同时过 量表达异源的Acyl-ACP还原酶和脂肪醛还原酶。以上改造的出发点是将脂肪酸合 成路径的中间产物脂酰-ACP经由脂酰-CoA、脂肪醛转化为烷类和烯类。这两种改造 方法的缺陷是产物烃类的合成都要经由脂肪酸和脂酰-CoA，由于脂肪酸合成、β氧 化都是在胞质内完成的，且脂肪酸的积累对细胞毒性较大，不会高浓度积累，这限 制了这类途径可能达到的最高产量。此外，脂酰-CoA极易被TesA和TesB(硫酯酶 II，ThioesteraseII)酯解为脂肪酸，这样便阻断了其进一步还原为脂肪醇和脂肪醛进 而形成烷类和烯类的可能性。因此急需一种具有开发潜力的高级脂肪醇和高级烃类 的合成路径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物基因改造方法用于生产高级脂肪醇和高级脂 肪烃。本发明的目的还在于提供基因工程菌以及使用本发明的基因工程菌发酵多种 碳源生产高级脂肪醇和高级烃类的方法。
本发明的微生物基因改造方法，包括删除微生物细胞内由脂酰-ACP生成脂肪酸 的路径以减少胞质内自由脂肪酸生成的步骤；其中，所述删除微生物细胞内由脂酰 -ACP生成脂肪酸的路径的方法为将微生物中的硫酯酶TesC编码基因敲除。
优选地，本发明所述微生物为大肠杆菌。
本发明的用于生产高级脂肪醇的基因工程菌，体内不含硫酯酶TESC，且含有包 含编码外源脂酰-CoA还原酶FAR的基因片段的重组质粒。
上述基因工程菌体内的硫酯酶TESC通过将硫酯酶TESC编码基因TesC敲除的 方法删除。
本发明所述包含外源脂酰-CoA还原酶FAR的编码基因片段的重组质粒，优选 地，所述重组质粒为pTr-FAR，即将外源脂酰-CoA还原酶FAR的编码基因序列连接 于质粒pTrcHisA上。
本发明所述外源脂-CoA还原酶FAR的编码基因片段，其核苷酸序列如SEQID No.1所示：
本发明的制备上述用于生产高级脂肪醇的重组质粒的方法，包括以下步骤：
1)克隆获得两端分别带有限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切位点的包含脂酰 -CoA还原酶FAR的编码基因序列的DNA片段；
2)将上述DNA片段与空质粒经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切并连接， 获得重组质粒。
上述制备重组质粒的方法中，优选以海洋杆菌(MarinobacteraquaeoleiVT8)为 模板克隆包含编码脂酰-CoA还原酶FAR的基因序列的DNA片段，将所述DNA片 段和pTrcHisA质粒经所述限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切并连接，获得重组质 粒pTr-FAR。优选地，所述引物为：FARF:CGGGATCCATGGCAATACAGCA GGTACATCACG，划线处为BamHⅠ酶切位点；FARR:CGGAATTCTCA GGCAGCTTTTTTGCGCTG划线处为EcoRI酶切位点。
本发明的用于生产高级脂肪醇的基因工程菌，为大肠杆菌MGKFPF，其包含上 述用于生产高级脂肪醇的的重组质粒。
本发明的制备上述用于生产高级脂肪醇的基因工程菌的方法，包括以下步骤：
1)将大肠杆菌中的硫酯酶TesC编码基因敲除，获得大肠杆菌MGKFM；
2)将上述用于生产高级脂肪醇的重组质粒转入步骤1)的大肠杆菌MGKFM中， 获得基因工程菌。
本发明的用于生产高级脂肪烃的基因工程菌，体内不含硫酯酶TESC，且同时含 有包含编码外源酰基ACP还原酶PCC7942_orf1594和脂肪醛还原酶 PCC7942_orf1593的编码基因片段的重组质粒。
优选地，本发明所述微生物为大肠杆菌。
上述基因工程菌体内的硫酯酶TESC通过将硫酯酶TESC编码基因TesC敲除的 方法删除。
本发明的用于生产高级脂肪烃的重组质粒，包含酰基ACP还原酶 PCC7942_orf1594和脂肪醛还原酶PCC7942_orf1593的编码基因序列。优选地，所述 重组质粒为pTr-1593-1594，即将外源的酰基ACP还原酶(PCC7942_orf1594)和脂 肪醛还原酶(PCC7942_orf1593)的编码基因片段连接于质粒pTrcHisA上。
本发明的制备上述用于生产高级脂肪烃的重组质粒的方法，包括以下步骤：
1)克隆获得两端分别带有限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切位点的、同时包 含酰基ACP还原酶PCC7942_orf1594和脂肪醛还原酶PCC7942_orf1593的编码基因 序列的DNA片段；
2)将上述两段DNA片段与空质粒经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切并连 接，获得重组质粒。
上述制备重组质粒的方法中，优选以细长聚球藻(Synechococcuselongatus PCC7942)基因组为模板克隆获得两端带有不同限制性酶切位点的含有Acyl-ACP还 原酶(PCC7942_orf1594)和脂肪醛还原酶(PCC7942_orf1593)的DNA片段。将所 述的DNA片段和pTrcHisA质粒经所述限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并连 接，获得重组质粒pTr-1593-1594。其中优选地，所述引物为：1593F:CGGGATCCATGCCGCAGCTTGAAGCCAGC划线处为BamHⅠ酶切位点，1594R:CGGAATTCTCAAATTGCCAATGCCAAGGGTTG划线处为EcoRⅠ酶切位点。
本发明所述酰基ACP还原酶PCC7942_orf1594的编码基因，其核苷酸序列如 SEQIDNo.2所示：
本发明所述脂肪醛还原酶PCC7942_orf1593的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示：
本发明的用于生产高级脂肪烃的基因工程菌，为大肠杆菌MGKFP34，包含上述 用于生产高级脂肪烃的的重组质粒。
本发明的制备上述用于生产高级脂肪烃的基因工程菌的方法，包括以下步骤：
1)将大肠杆菌中的硫酯酶TesC编码基因敲除，获得大肠杆菌MGKFM；
2)将上述用于生产高级脂肪烃的重组质粒转入步骤1)的大肠杆菌MGKFM中， 获得基因工程菌。
在本发明的制备基因工程菌的方法中，将大肠杆菌中的硫酯酶TesC编码基因敲 除的步骤中，包括设计带有TesC上下游同源臂的引物扩增catA-sacB的步骤。具体 为，设计带有TesC上下游同源臂的引物扩增catA-sacB，其中优选的所述引物为：
KtesCF:CGTAATCTGGCGGTATTAACCCTGTAATTAATTTGCATAGTGGCAATTTTGTGACGGAAGATCACTTCGCAG，KtesCR:TATTCCGGGTGTCGCCGGATGCGGCTTGAGCATCCGGCACCACAAAACGTATCAAAGGGAAA ACTGTCCATATGCACAGATG，将扩增后的catA-sacB转化至大肠杆菌感受态内。
本发明还提供了上述用于生产高级脂肪醇的重组质粒和基因工程菌在生产高级 脂肪醇中的应用。
本发明还提供了上述用于生产高级脂肪烃的重组质粒和基因工程菌在生产高级 脂肪烃中的应用。
上述应用具体地为，使用本发明的基因工程菌发酵多种碳源生产高级脂肪醇或 高级脂肪烃类的方法，所述方法包括在基因工程菌生长过程中生物量的积累及加入 不同量的诱导剂时产物的积累。
在上述应用中，所述碳源优选为甘油，所述诱导剂优选的为乳糖。
本研究通过敲除TesC阻断了脂酰-ACP走向脂肪酸，同时过量表达脂酰-CoA还 原酶FAR，使得细胞内合成脂酰-ACP尽可能多的走向脂肪醇。现有研究不采取这一 路径的主要原因可能是有以下三个方面：第一，TesC这一基因的敲除较普通基因难 于操作，敲除后菌株生长缓慢。第二，负责这一步骤的有三个同工酶操作繁琐，且 定位分工还不足够明确，我们的实验是建立在一系列合成生物学的软件和预测分析 上的。第三，普遍认为脂肪酸对于细菌是必需的，因此不会完全阻断这里路径，又 不易选择合适的弱化途径。
本发明产生如下的技术效果：
本发明的微生物改造方法、基因工程菌株和质粒能够提高原始大肠杆菌的高级 脂肪醇和高级烃类产量，是具有更高高级脂肪醇和高级烃类产量的重组基因工程菌。
通过对比实验证明，构建出来的基因工程菌相对于原始菌来说，高级脂肪醇和 高级烃类的积累速度和产量都有极大提高。表明这类基因工程菌存在着较大的应用 潜力。
附图说明
图1为本发明大肠杆菌TESC酶敲除示意图；其中，H1为TesC基因上游50bp 序列，H2为TesC基因下游50bp序列，P1为与CatA-sacB同源的上游引物，P2为 与CatA-sacB同源的上游引物，ybaV为基因组上位于TesC上游的基因，queC为基 因组上位于TesC下游的基因。
图2为本发明基因工程菌产高级脂肪醇的代谢途径。
图3为本发明基因工程菌产高级脂肪烃的代谢途径。
图4为本发明重组质粒pTr-FAR构建过程示意图。
图5为本发明重组质粒pTr-1593-1594构建过程示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分 子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试 剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可 从商业途径得到。
实施例1培养基的配制
LB培养基成份为每升水中含有5g酵母粉，10g胰蛋白胨和10gNaCl。固体培 养基为液体基中加入1.5％的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨苄青霉素(Amp) 的使用浓度是50μg/mL。
实施例2海洋杆菌VT8和细长聚球藻PCC7942的总DNA的提取
用SDS-蛋白酶K裂解菌体十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多 糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA。
1)海洋杆菌取单菌落接种于100mLDSMZ514培养基在合适的温度下培养2天； 细长聚球藻培养于培养基BG11100mL中，在合适的温度下培养8天。
2)取20mL菌液于离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清。
3)沉淀重悬于1.0mL0.85％NaCl中。
4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。
5)沉淀重悬于550μL1×TE中。
6)加17μL溶菌酶(35mg/mL)，37℃温育30min。
7)加3μL蛋白酶K(20mg/mL)，37℃温育30min。
8)加30μL10％十二烷基磺酸钠SDS，37℃温育30min。
9)加100μL5MNaCl充分混匀。
10)加80μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。
11)加等体积(0.7-0.8mL)氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻振荡混匀。
12)室温，13,000rpm离心10min。
13)将上清液转移到一新1.5mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1) 轻轻振荡混匀。
14)重复第12)步。
15)将上清液转移到一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)轻 轻振荡混匀。
16)重复第12)步。
17)将上清液转移到一新1.5mL离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温 静置60min。
18)20℃13,000rpm离心20min。
19)弃上清，加500μL70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。
20)4℃15,000rpm离心20min。
21)重复洗盐两次。
22)倒置离心管，干燥DNA沉淀10-15min。
DNA沉淀溶于30μL1×TE缓冲液，-20℃保存备用。
实施例3重组质粒pTr-FAR的构建
FAR基因的克隆
以提取海洋杆菌MarinobacteraquaeoleiVT总DNA为模板进行PCR反应
PCR反应体系为：
PCR反应程序为：94℃4min
94℃30s，64℃30s，72℃1min35cycles，
72℃5min
包含FAR酶基因的DNA片段的酶切体系按如下配比组成：
酶切反应过夜进行，电泳检验酶切程度。用DNA回收试剂盒回收酶切后的核酸。
pTrcHisA质粒的酶切体系按如下配比组成：
酶切反应过夜进行后，电泳检验酶切程度。回收酶切后的质粒。
酶切后的质粒与包含FAR酶基因的DNA片段按如下的方法混和后进行连接反 应。
连接反应在16℃进行4小时，之后将反应混合物用于转化反应获得重组质粒 pTr-FAR(质粒构建情况可参见图4)。
实施例4重组质粒pTr-1593-1594的构建
Orf1593-1594基因的克隆
细长聚球藻的基因组为模板进行PCR反应
PCR反应体系为：
PCR反应程序为：94℃4min
94℃30s，64℃30s，72℃2min35cycles，
72℃8min
包含Orf1593-1594酶基因的DNA片段酶切体系按如下配比组成：
酶切反应过夜进行，电泳检验酶切程度。用DNA回收试剂盒回收酶切后的核酸。
pTrcHisA质粒的酶切体系按如下配比组成：
酶切反应过夜进行后，电泳检验酶切程度。回收酶切后的质粒。
酶切后的质粒与包含orf-1593-1594酶基因的DNA片段按如下的方法混和后进 行连接反应。
连接反应在16℃进行4小时，之后将反应混合物用于转化反应获得重组质粒 pTr-1593-1594(质粒构建情况可参见图5)。
实施例5大肠杆菌菌株MGKF的构建
pKD46质粒转入E.coliMG1655，30℃筛选氨苄100mg/L筛选后，制备感受态；
设计引物：
KtesCF:
CGTAATCTGGCGGTATTAACCCTGTAATTAATTTGCATAGTGGCAATTTT
KtesCR:
实线处为TesC的同源序列，虚线处为pEASY-cata-sacb的同源序列。 pEASY-cata-sacb为模板扩增，PCR产物纯化后电转化上一步制备的感受态，37℃培 养1h，涂布氯霉素抗性平板，挑选缺失菌株，42℃1h消除质粒pKD46。获得大肠 杆菌菌株MGKF(请参见图1)。
实施例6基因工程菌MGKFPF的构建
感受态细胞用CaCl2法制备。选取大肠杆菌MGKF制成感受态细胞，用热击法 将质粒pTr-FAR转入上述感受态，热击的反应条件是42℃热击90秒。热击后加入 800μL的LB培养基，37℃活化45分钟后涂于含100μg/mL氨苄和34μg/mL氯霉 素的LB平板上37℃过夜培养，获得基因工程菌MGKFPF。
实施例7基因工程菌MGKFP34的构建
感受态细胞用CaCl2法制备。选取大肠杆菌MGKF制成感受态细胞，用热击法 将质粒pTr-1593-1594转入上述感受态，热击的反应条件是42℃热击90秒。热击后 加入800μL的LB培养基,37℃活化45分钟后涂于含100μg/mL氨苄和34μg/mL氯 霉素的LB平板上37℃过夜培养，获得基因工程菌MGKFP34。
实施例8重组菌的生长特征及稳定性分析
原始菌E.coliMG1655不具有氨苄和氯霉素抗性，质粒载体上有氨苄抗性，TesC 基因敲除菌株具有氯霉素抗性。本基因工程菌能在浓度为100μg/mL氨苄和34μg/mL 氯霉素的LB平板上正常生长，表明重组质粒已经转入于MGKF。挑取30个这样的 菌落接种于含有100μg/mL和34μg/mL氯霉素的氨苄平板上，结果经过24h的培养， 平板上长出了29个菌落，说明该菌在没有任何的选择性压力的条件下仍十分稳定， 稳定性达95％以上。
实施例9基因工程菌MGKFPF，连续发酵条件下的高级脂肪醇产量
将构建的基因工程菌MGKFPF，37℃培养至对数生长期后加入诱导剂乳糖或 IPTG诱导FAR表达(代谢途径见图2)；培养过程中保持甘油浓度20g/L，连续通气 好氧发酵。其间用NaOH调节发酵液的pH值使其保持在pH7.5处，并间或补加Amp， 以防止质粒丢失。至发酵终点，高级脂肪醇产量为10g/L，比起原始菌株产量0.10g/L 提高了100倍多。
实施例10基因工程菌MGKFP34连续发酵条件下的高级烃类产量
将构建的基因工程菌MGKFP34，37℃培养至对数生长期后加入诱导剂乳糖或 IPTG诱导pTr-1593-1594表达(代谢途径见图3)；培养过程中保持甘油浓度20g/L， 连续通气好氧发酵。其间用NaOH调节发酵液的pH值使其保持在pH7.5处，并间或 补加Amp，以防止质粒丢失。至发酵终点，高级脂肪烃的产量为8g/L，而原始菌株 不积累高级脂肪烃。