技术领域
本发明涉及一株球形赖氨酸芽胞杆菌及其晶体蛋白和活性产物的分离方法与应用，尤其是涉及一株高效抗肿瘤野生型菌株（LysinibacillussphaericusBsX050）及其活性代谢产物的分离方法与抗肿瘤方面的应用，及其晶体蛋白抗肿瘤方面的应用。
背景技术
近年来,芽胞杆菌(Bacillus)作为一类可产生丰富代谢产物的微生物类群，日趋受到重视。芽胞杆菌大多能分泌高活性的胞外产物,如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶等酶类。芽胞杆菌被作为益生菌广泛应用于害虫防治、部分病原菌的抑制和抗肿瘤活性研究。
随着人类疾病谱的变化，恶性肿瘤也已成为人类前三位的死亡原因之一，严重危害人类健康。抗肿瘤治疗日益彰显其重要性。新的治疗手段及疗效特异性是当前医学界研究的热点。芽胞杆菌是一种昆虫病原细菌。近年，有研究发现某些非杀虫活性的芽胞杆菌能够产生抗癌细胞活性的代谢物，对人类某些癌细胞具有细胞毒性。现对这类芽胞杆菌的抗肿瘤研究进展综述如下。
苏云金芽胞杆菌：日本学者Mizuki等于1999年首次发现了对磷翅目和双翅目无杀虫活性，但对体外培养的人类白血病T细胞(MOLT-4)和人类宫颈癌传代细胞(Hela)有杀伤力的Bt菌株。2000年，Mizuki等对分离到的蛋白进行理化性质分析，发现该类伴胞蛋白序列包含了Bt伴胞晶体蛋白共有的5个保守区域，但与现有的其他Cry和Cyt蛋白同源性很低(＜25%)，只有在胰蛋白酶和蛋白酶K的作用下，降解为活性片段，此蛋白才会选择性地毒杀人类白血病T细胞MOLT-4和人类宫颈癌传代细胞HeLa，而对正常细胞无作用，该伴胞素首次被命名为parasporin(PS)。截止目前为止，分离得到的PS蛋白主要划分为6群18类。PS1类包括11个抗癌晶体蛋白，最早发现的PS1Aa1也称Cry31Aa1，原毒素分子量为81kDa，具有Cry蛋白类似典型的结构域，PS1Aa的蛋白经胰酶酶解后产生15和56kDa的活性多肽，可能通过形成多肽二聚体而对Hela，HL-60，MOLT-4，HepG2等细胞具有杀伤力；PS2类包括3个抗癌晶体蛋白，PS2Aa1也称Cry46Aa1，分子量为37kDa，不具有Cry蛋白类似典型的结构域，Cry15Aa与球形芽胞杆菌的Mtx2和Mtx3有很高的同源性，PS2的活性部分经X-衍射分析发现该蛋白有很多的β-片层结构围绕一个长轴卷曲而成，PS2Aa原毒素经蛋白酶K酶解后产生30kDa的活性多肽，对MOLT-4，HL-60，HepG2等细胞具有杀伤力；PS3类包括2个抗癌晶体蛋白，PS3Aa1也称Cry41Aa1，分子量为93kDa，具有Cry蛋白类似典型的3个结构域和5个保守区，PS3Aa蛋白经蛋白酶K在N端和C端酶解后，形成64kDa的活性多肽，对HL-60和HepG2具有中等毒力；PS4，PS5，PS6类各包含1个抗癌晶体蛋白；PS4Aa1也称Cry45Aa1，分子量为31kDa，无Cry蛋白类似典型的3个结构域和5个保守区，于其他晶体蛋白的同源性较低，PS4Aa1蛋白经蛋白酶K在C端酶解后产生27kDa的活性多肽，对Sawano，HL-60，MOLT-4，TCS，Caco-2细胞具有较高的细胞毒力。PS5Aa1分子量为34kDa，PS6Aa1分子量为84kDa，具有典型的3个结构域，PS6Aa经胰蛋白酶在N端消化后产生73kDa的活性多肽，对HepG2和Hela细胞具有较高的毒性。
解淀粉芽胞杆菌：2011年华中农业大学微生物实验室发现一株对肿瘤有杀伤力的解淀粉芽胞杆菌，通过对发酵上清液的分离得到脂肽类表面活性剂，经研究发现，当脂肽的浓度大于50μg/mL时，脂肽类表面活性剂有明显的体外抑制肿瘤细胞活性。
枯草芽胞杆菌：2013年中国药科大学郭传龙等从枯草芽胞杆菌的发酵液中分离到了一种环脂肽（CLPs），该CLPs对MCF-7有明显的细胞毒性，而对正常HELF细胞无细胞毒性，研究发现环脂肽能够与体外培养癌细胞的胞膜结合，形成离子通道，出现孔洞，导致胞内容物外泄，细胞DNA断裂。HwangMH等发现环脂肽可以从体液免疫方面来抵抗肿瘤入侵。
蜡样芽胞杆菌：2008年中国农业大学食品科学与工程学院教育部功能乳品重点实验室发现蜡样芽胞杆菌ZH-14产生的胞外蛋白对肿瘤细胞S-180的抑制率在43.6%以上。
海带内生芽胞杆菌：2015年大连海洋大学食品科学与工程学院发现海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2胞外蛋白具有抗肿瘤活性，DNN7胞外蛋白对体外慢性粒细胞癌细胞K562，肝肿瘤细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率分别为96.46%，42.99%和85.7%；HSN2胞外蛋白对体外慢性粒细胞癌细胞K562，肝肿瘤细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率分别为92.65%，66.8%，88.48%。
球形芽胞杆菌：2014年LuoW在球形芽胞杆菌IAB872(LysinibacillussphaericusIAB872)中发现一种Bin蛋白，这种蛋白能够抑制一系列人类肿瘤细胞在体外的增殖。Bin蛋白的抗增殖作用与细胞凋亡关联，导致细胞内Bax/Bcl-2的比率增加，上调CyclinB1蛋白和下调CDC25C蛋白的表达，并且其抗增殖作用在G2/Ms时期与细胞周期阻滞相关联。Bin蛋白能促进细胞凋亡，抑制运动和侵袭肺癌细胞(A549)。该报道提到球形芽胞杆菌IAB872提取的可溶性晶体毒素对肺癌细胞（A549）和肝癌细胞（HepG2）具有抗肿瘤活性，而未提到其对小鼠乳腺癌细胞（4T1）和肝癌细胞（Hep-3B）有效果，尽管报道提及晶体毒素的可溶性，但未说明其具体形态特征。
虽然有关芽胞杆菌代谢产物和晶体蛋白抗肿瘤的研究起始较早，但对于球形芽胞杆菌代谢产物及晶体蛋白抗肿瘤的研究极少。球形芽胞杆菌是一种在自然界中广泛分布、形成亚末端膨大胞子囊和球形芽胞的好气芽胞杆菌，其灭蚊选择性强，对非靶标生物和人畜无毒性，在自然界中易降解不污染环境，其毒杀作用主要是由其产生的毒素蛋白（晶体蛋白和Mtx蛋白）实现的。人们对该类细菌的研究主要集中于杀虫方面，而在抗肿瘤方面的研究极少，且报道只说明球形芽胞杆菌IAB872提取的可溶性晶体毒素对A549癌细胞具有抗肿瘤活性，而未提其发酵液中的活性代谢产物具有抗肿瘤广谱活性，同时也未提及晶体毒素的具体形态特征。
其他：金永生等在多粘芽胞杆菌HY96-2发酵液乙酸乙酯部分分离得到金雀异黄素，发现它具有抗肿瘤的作用。李伟利用海虾毒性法测定分离自海胆的多粘芽胞杆菌的抗肿瘤活性，结果表明发酵液中蛋白有一定的抗肿瘤作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株球形赖氨酸芽胞杆菌及其晶体蛋白和活性产物的应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，
一株球形赖氨酸芽胞杆菌菌株LysinibacillussphaericusBsX050，它的活性产物对肿瘤细胞具有较好的抑制作用，并对其抗肿瘤活性物进行了初步分离，同时它产生的晶体蛋白也具有抗肿瘤活性。
本发明之球形赖氨酸芽胞杆菌，为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050,LysinibacillussphaericusBsX050，于2014年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCCNO：M2014160。
本发明之球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050的分离：采用温度筛选法，从长沙岳麓山采集的土样中直接分离得到一株具有球形芽胞杆菌性状的细菌，经菌落形态观察、革兰染色、相差显微镜及扫描电镜观察。
该菌株的具体分离过程：从长沙岳麓山采集土样，加入无菌水，混匀，75-80℃加热30min，取适量匀浆涂布于LB平板上，30℃条件下培养48h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，30℃条件下培养24-48h，将重复分离纯化到的单菌落接种到LB液体培养基摇瓶中，30℃，120-160rpm，培养12h，50%甘油混匀，-80℃冰箱中长期保藏。
革兰染色过程：取菌液少许，涂片并固定；结晶紫染色1-2min，水洗并用吸水纸吸干；碘液媒染1-2min，水洗并吸干；用体积浓度95%酒精脱色，直到酒精不出现紫色时即停止（大约0.5min），立即水洗，并吸干；番红复染3-4min，水洗并吸干；在光学显微镜油镜下观察菌体形状与颜色。
扫描电镜观察：
取菌液1mL，9000-11000rpm，3min，离心，去上清，PBS缓冲液洗涤十次，最后用200微升PBS缓冲液重悬菌体，加入等量戊二醛固定，在扫描电子显微镜下观察单个菌体。
晶体蛋白的特征研究。LysinibacillussphaericusBsX050在发酵培养基中发酵培养60-72h后，离心，去上清，先用0.5mol/LNaCl溶液洗涤菌体,再用质量浓度0.9%的NaCl洗涤菌体，超声破碎，沉淀并分别用5%丙酮和水洗涤，用收集的晶体蛋白制备电镜样品进行扫描电镜及超薄切片观察。晶体蛋白的抗肿瘤活性。收集的晶体蛋白经胰蛋白酶酶解后进行肿瘤细胞毒性实验。所述球形赖氨酸芽胞杆菌的晶体蛋白具有抗肿瘤的作用。
所述球形赖氨酸芽胞杆菌活性代谢产物的分离方法，包括以下步骤：
方法一：从LB平板上挑取单菌落，转接到含有LB液体培养基的摇瓶中，30℃，120-160rpm，振荡培养12h后，按1%的接种量转接于发酵培养基中，于30℃，120-160rpm，20%-40%的相对湿度，振荡培养48-72h后，8000－11000rpm离心15min；收集发酵上清液，加入硫酸铵，使发酵液中硫酸铵的质量百分比为30%-80%，于4℃沉淀过夜，8000－11000rpm离心20min，收集沉淀，用水溶解，得到粗提蛋白，过0.22μm滤膜，在蛋白质纯化仪（AKTA）上进行初步分离，收集具有生物活性的组分即得。
或者采用方法二：从LB平板上挑取单菌落，转接到含有LB液体培养基的摇瓶中，30℃，120-160rpm，振荡培养12h后，按1%的接种量转接于发酵培养基中，于30℃，120-160rpm，20%-40%的相对湿度，振荡培养48-72h后，8000－11000rpm离心15min；收集发酵上清液，加入硫酸铵，使发酵液中硫酸铵的质量百分比为30%-80%，于4℃沉淀过夜，8000－11000rpm离心20min，收集沉淀，用水溶解，加盐酸调pH值至2.0，4℃放置过夜，8000－11000rpm离心10min收集沉淀，用三氯甲烷和甲醇（v/v=2:1）溶解沉淀，8000－11000rpm离心10min，取上清冷冻干燥，用甲醇溶解，过0.22微米滤膜，利用高效液相色谱仪进一步分离纯化，得到活性代谢产物。
进一步，方法一中，初步分离时，蛋白质纯化仪（AKTA）上所用凝胶柱为Superdex200。进一步纯化使用强阴离子交换柱。
进一步，方法二中，分离纯化时，所述高效液相色谱仪中用C18反相色谱柱。
将所得球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050活性代谢产物进行肿瘤细胞毒性实验，其具有抗肿瘤活性。
本发明之球形赖氨酸芽胞杆菌对4T1细胞和Hep-3B细胞具有明显的毒性，同时其活性代谢产物具有广谱的抗肿瘤活性。
本发明其包含了晶体蛋白毒素的具体形态特征，同时对4T1细胞和Hep-3B细胞具有细胞毒性，而对正常细胞HUVEC无明显毒性。
微生物保藏情况说明
本发明之球形赖氨酸芽胞杆菌，为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050,LysinibacillussphaericusBsX050，于2014年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCCNO：M2014160。
附图说明
图1为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株的形态特征图；a为革兰染色图（2000×）；b为相差显微镜镜检图（1000×）；c为扫描电子显微镜镜检图；
图2为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液粗提物的抗肿瘤谱测定图；
图3－a为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物的阴离子交换柱分离图；
图3－b为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物阴离子交换分离后收集各峰的B16细胞毒性检测；
图3－c为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物的高效液相色谱分离图；
图3－d为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物高效液相色谱分离后收集各峰的B16细胞毒性检测;
图4－a为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白的SDS-PAGE鉴定图；
图4－b为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白的质谱鉴定分析表；
图5为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白扫描电镜及超薄切片观察图；a为扫描电镜图；b为超薄切片图；
图6－a为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白处理24h的抗肿瘤活性检测图；图示从左到右依次为HUVEC、4T1、Hep-3B细胞；
图6－b为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白处理48h的抗肿瘤活性检测图；图示从左到右依次为4T1、Hep-3B、HUVEC细胞；
图7为本发明实施例扫描电镜观察球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白作用肿瘤细胞24h后，细胞的变化图；
图8为本发明实施例激光共聚焦显微镜检测球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白作用肿瘤细胞24h后，细胞内部的变化图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明之球形赖氨酸芽胞杆菌，为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050,LysinibacillussphaericusBsX050，于2014年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCCNO：M2014160。
（一）该菌株的具体分离过程：从长沙岳麓山采集土样，加入无菌水，混匀，75℃加热30min，取适量匀浆涂布于LB平板上，30℃条件下培养48h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，30℃条件下培养24h，将重复分离纯化到的单菌落接种到LB液体培养基摇瓶中，30℃，120rpm，培养12h，50%甘油混匀，-80℃冰箱中长期保藏。
革兰染色过程：取菌液少许，涂片并固定；结晶紫染色2min，水洗并用吸水纸吸干；碘液媒染2min，水洗并吸干；用体积浓度95%酒精脱色，直到酒精不出现紫色时即停止（大约0.5min），立即水洗，并吸干；番红复染4min，水洗并吸干；在光学显微镜油镜下观察菌体形状与颜色。
扫描电镜观察：
取菌液1mL，11000rpm，3min，离心，去上清，PBS缓冲液洗涤十次，最后用200微升（μL）PBS缓冲液重悬菌体，加入等量戊二醛固定，在扫描电子显微镜下观察单个菌体。
本发明实施例中LB培养基(质量百分比)：1%氯化钠，1%蛋白胨，0.5%酵母粉，2%琼脂（液体培养基不加），pH7.0。
本发明实施例中发酵培养基(质量百分比)：0.5%牛肉膏，0.2%氯化钠，0.005%硫酸锰，1%蛋白胨，0.03%七水硫酸镁，0.3%葡萄糖，0.03%磷酸氢二钾，2%琼脂（液体培养基不加），pH7.3～7.4。
图1是本实施例之球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株经分离纯化后的形态特征图。其中a是对该细菌进行的革兰染色图，革兰染色为阳性杆状细菌。b是该菌株的相差显微镜图，如图所示菌株产末端球形芽胞。c是扫描电镜图，经过观察，其长度约为2-3微米，宽度约为1微米，芽胞端生。
（二）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株的活性代谢产物粗提物的抗肿瘤谱测定
图2为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050的活性代谢产物粗提物的抗肿瘤谱测定图。
具体实验过程：挑取单菌落到含20mLLB液体培养基的100mL摇瓶中，30℃，160rpm，培养12h后，按1%的接种量转接于发酵培养基中，30℃，160rpm，保持20%-40%的相对湿度，振荡培养48h后，8000rpm离心15min；收集发酵上清液，按照硫酸铵溶解表，根据在0℃硫酸铵的溶解量，加入硫酸铵，使发酵液中硫酸铵的质量百分比为50%，于4℃沉淀过夜，8000rpm离心20min，收集沉淀，用水溶解，得到粗提蛋白，用50WMCO的超滤离心管除盐，将其分别作用于小鼠黑色素瘤细胞B16，人宫颈癌细胞Hela，肝癌细胞Hep-3B，小鼠乳腺癌细胞4T1，人结肠癌细胞HT29，人乳腺癌细胞MCF-7。在倒置显微镜下观察发现细胞的形态发生变化，结果显示，粗提蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16，人宫颈癌细胞Hela，肝癌细胞Hep-3B，小鼠乳腺癌细胞4T1，人结肠癌细胞HT29，人乳腺癌细胞MCF-7都具有细胞毒性，说明球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050活性代谢产物粗提蛋白具有广谱的抗肿瘤活性。
（三）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物的分离
图3－a为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物的阴离子交换柱分离图；图3－b为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物阴离子交换分离后收集各峰的B16细胞毒性检测；图3－c为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物的高效液相色谱分离图；图3－d为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株发酵上清液中抗肿瘤活性物高效液相色谱分离后收集各峰的B16细胞毒性检测。
具体实施过程：方法一：挑取单菌落到含20mLLB液体培养基的100mL摇瓶中，30℃，160rpm，培养12h后，按1%的接种量转接于发酵培养基中，30℃，160rpm，保持20%-40%的相对湿度，振荡培养72h后，8000rpm离心15min；收集发酵上清液，按照硫酸铵溶解表，根据在0℃硫酸铵的溶解量，加入硫酸铵，使发酵液中硫酸铵的质量百分比为50%，于4℃沉淀过夜，8000rpm离心20min，收集沉淀，用水溶解，过0.22微米滤膜，过Superdex200葡聚糖凝胶柱，进一步纯化使用离子交换，用Q,FF（强阴离子）交换柱。配置pH=7.0的50mM磷酸缓冲液（A液）和pH=7.0的1MNaCl溶液（B液）。用A液先进行上样挂柱，洗脱时B液由0%的NaCl溶液10个柱体积逐渐增加到100%NaCl，流速为1mL/min，检测波长为215nm。由于该色谱柱在pH=7.0的流动相中能特异性的与酸性蛋白发生交换，而碱性蛋白成阳离子状态而不能发生交换，直接形成穿透峰。收集穿透峰之产品和所有洗脱峰之产品进行细胞毒性实验[具体实施过程：将小鼠黑色素瘤细胞（B16）铺于96孔板中，静置培养12-24h，分别加入收集各峰的样品，以等量发酵培养基作对照（CK），置于5%CO2培养箱中37℃培养24h并在倒置显微镜下观察细胞形态变化，确定活性成分]。结果如图3－a和3－b所示。色谱图结果显示峰1是穿透峰，峰2,3,4为洗脱峰，经细胞毒性实验检测发现峰4为活性峰。
方法二：挑取单菌落到含20mLLB液体培养基的100mL摇瓶中，30℃，120rpm，培养12h后转接到发酵培养基中，30℃，120rpm，保持20%-40%的相对湿度，振荡培养48h后，11000rpm离心15min；收集发酵上清液，按照硫酸铵溶解表，根据在0℃硫酸铵的溶解量，加入硫酸铵，使发酵液中硫酸铵的质量百分比为50%，于4℃沉淀过夜，11000rpm离心20min，收集沉淀，用水溶解，加盐酸调pH值至2.0，4℃过夜放置，11000rpm离心10min收集沉淀，用三氯甲烷和甲醇（v/v=2:1）溶解沉淀，11000rpm离心10min，取上清冷冻干燥，用甲醇溶解，过0.22微米滤膜，利用高效液相色谱仪进一步分离纯化，利用反相柱C18，流动相为乙腈与醋酸铵（v/v=3/4）,流速为15mL/min，收集所有洗脱峰之产品进行细胞毒性实验[具体实施过程：将小鼠黑色素瘤细胞（B16）铺于96孔板中，静置培养12-24h，分别加入收集的各峰，以等量发酵培养基作对照（CK），置于5%CO2培养箱中37℃培养24h并在倒置显微镜下观察细胞形态变化，确定活性成分]。结果如图3－c和3－d所示。经细胞毒性实验检测结果显示峰1为活性峰。
（四）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白的SDS-PAGE鉴定及质谱鉴定分析表
图4－a为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白的SDS-PAGE鉴定图；
图4－b为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白的质谱鉴定分析表。
具体实施过程：挑取单菌落到含20mLLB液体培养基的100mL摇瓶中，30℃，120rpm，培养12h后，按1%的接种量转接到发酵培养基中，30℃，120rpm，保持20%-40%的相对湿度，振荡培养60h后，8000rpm离心10min，收集菌体。在离心管中加入0.5mol/LNaCl溶液洗涤菌体，8000rpm离心10min，洗涤3次，0.9%的NaCl溶液重悬菌体，超声破碎（超声功率380W,超声30s,间隔30s,超声10次），并重复两次，8000rpm离心10min,收集菌体，并用质量浓度0.9%的NaCl溶液再洗涤菌体2次。后用5%丙酮洗涤菌体3次，8000rpm离心10min,最后用灭菌的双蒸水洗涤3次以上，得到晶体蛋白。取少量的晶体蛋白，加入5*loadingbuffer，煮沸10min，SDS-PAGE鉴定晶体蛋白，截取胶上的晶体蛋白条带，进行胶内酶解鉴定。结果显示晶体蛋白的分子量为125kDa。
（五）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白形态观察图。
图5为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白扫描电镜及超薄切片观察图；a扫描电镜图；b超薄切片图。
具体实施过程：将步骤（四）中提取的晶体蛋白用质量浓度为2.5%的戊二醛溶液固定，灭菌的双蒸水洗涤晶体蛋白3次，每次10min,无水乙醇梯度（体积浓度分别为30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%）洗脱晶体蛋白，每次10min，取少量晶体蛋白涂布于盖玻片上，自然风干，送电镜室做扫描电镜观察；同时用质量分数为2.5%的戊二醛溶液固定的晶体蛋白送武汉病毒所做超薄切片观察。扫描电镜结果显示晶体蛋白为圆形或椭圆形，超薄切片结果显示晶体蛋白结构比较松散，致密性不好。
（六）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白的抗肿瘤活性检测图
图6－a为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白处理24h的抗肿瘤活性检测图；图示从左到右依次为HUVEC、4T1、Hep-3B细胞；
图6－b为本发明实施例球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白处理48h的抗肿瘤活性检测图；图示从左到右依次为4T1、Hep-3B、HUVEC细胞。
具体实施过程：用pH值12.5的50mM的Na2CO3溶液溶解晶体蛋白，37℃放置1h，离心，收集上清，透析48h，采用胰酶（1mg/mL）酶解晶体蛋白（V胰酶/V晶体蛋白=1/10），37℃放置3h，过滤除菌后保存于-80℃，备用。
分别将酶解的晶体蛋白作用于4T1细胞，Hep-3B细胞和HUVEC细胞24h、48h，用MTT法检测BsX050晶体蛋白作用24小时和48小时的抗肿瘤活性。结果表明在浓度为12微克/毫升的晶体蛋白作用24h后，4T1细胞的存活率只有38.55%，Hep-3B细胞的存活率为58.28%，HUVEC的存活率为78%以上；而在浓度为8微克/毫升的晶体蛋白作用48h后，4T1细胞的存活率也只有27.91%，Hep-3B细胞的存活率为19.55%，HUVEC的存活率仍可达87%以上，说明晶体蛋白对4T1细胞和Hep-3B细胞具有明显的抑制效果，而对HUVEC的抑制效果不是很明显，说明晶体蛋白对HUVEC毒性较弱。
（七）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白作用肿瘤细胞
图7为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050晶体蛋白作用细胞后扫描电镜观察细胞变化。
具体实施过程：将小鼠乳腺癌细胞4T1，肝癌细胞Hep-3B和人脐静脉内皮细胞HUVEC，分别铺于6孔板中，静置培养24h，分别加入12微克/毫升，经步骤（六）胰酶酶解后的晶体蛋白，以等量发酵培养基作对照（CK），置于5%CO2培养箱中37℃培养24h。用枪头轻轻吸去上清，用质量分数为2.5%的戊二醛溶液固定，灭菌的双蒸水洗涤细胞，每次10min,无水乙醇梯度（体积浓度分别为30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%）洗脱细胞，每次15min，取少量细胞涂布于盖玻片上，自然风干，送电镜室做扫描电镜观察。结果显示加入晶体蛋白的4T1细胞和Hep-3B细胞外形发生明显变化，而HUVEC细胞无明显变化。
（八）球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050菌株晶体蛋白作用肿瘤细胞
图8球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050晶体蛋白作用细胞后激光共聚焦观察细胞内部变化。
具体实施过程：将小鼠乳腺癌细胞4T1，肝癌细胞Hep-3B和人脐静脉内皮细胞HUVEC，分别铺于6孔板中，静置培养24h，加入经步骤（六）胰酶酶解后的晶体蛋白处理24h（染色过程均在无光条件下进行）；小心吸去上清，用1mLPBS洗涤两遍（注意操作要轻柔），小心吸去PBS，沿孔壁慢慢的加入60微升0.1μM的Mitotrack(1:500)，染色20min；小心吸去染色液，加入1mLPBS轻轻的洗涤两遍，小心吸去PBS；在6孔板中加入1mL质量浓度为4%的甲醛溶液，固定10min；吸去甲醛，用1mLPBS洗涤2次，小心吸去PBS；加入60微升0.5μg/mL的hoechst（1:10000），染色20min，小心吸去染色液，加入1mLPBS轻轻的洗涤两遍，小心吸去PBS；加入1mL0.5%TritonX-100（PBS配制），透化处理10min；吸去TritonX-100，用1mLPBS洗涤3次，小心吸去PBS；加入1mL2%BSA，封闭30min；吸去BSA，用1mLPBS洗涤2次，小心吸去PBS；加入60微升0.5μg/mL的Tubulin（1:10000），染色1h；吸去染色液，加入1mLPBS轻轻的洗涤4遍，小心吸去PBS；每孔加入20微升抗淬灭剂，用荧光激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示HUVEC细胞无明显变化，而4T1细胞和Hep-3B细胞的核明显皱缩，微管蛋白和线粒体也有较明显变化。说明晶体蛋白对HUVEC细胞无明显毒性，但对4T1细胞和Hep-3B细胞具有毒性。