技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体及其在 木质纤维素降解中的应用。
背景技术
纤维素酶(Cellulases)是水解纤维素(β-1，4葡聚糖或者β-D-糖苷键) 导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖(cellooligosaccharides)和类似物质的酶。 纤维素酶在传统上已被分为三个主要类型：内切葡聚糖酶(endoglucanases，EC3. 2.1.4)，外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase， EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosideglucohydrolase，EC3.2.1.21)。 内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶体部分，而外切葡聚糖酶纤维二糖 水解酶是唯一可以作用于晶体纤维素的酶组分。因此，纤维二糖水解酶在纤维 素酶体系中的存在对于晶体纤维素的有效溶解是必需的。
纤维二糖水解酶由3个部分组成：具有催化活性的催化结构域，作用为锚 定纤维素的纤维素结合域以及连接这两个结构域的一段短肽。在水解纤维素过 程中，纤维二糖水解酶主要作用于纤维素线性分子非还原端，水解β-1,4-糖苷 键，每次切下一个纤维二糖分子，使结晶纤维素成为易溶解的非结晶纤维素。
当前经济过分依赖于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性导致资源逐渐 枯竭，燃烧产生的二氧化碳已造成气候环境的日益恶化。寻找可再生的清洁能 源成为各国科研人员关注的焦点。其中生物质能源因具有来源广泛、价格低廉、 再生性强等优点，成为最具潜力的能源物质。生物乙醇是源于可再生物质的重 要能源之一。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，全球每年通过光合作 用产生的植物约10000亿吨，为避免与人争粮，木质纤维素将成为生物乙醇生 产最具潜力的原料。
木质纤维素炼制生物乙醇过程通常包括预处理、水解、发酵、蒸馏等单元 操作，其中纤维素水解为可发酵糖是纤维素乙醇炼制过程中至关重要的环节。 目前，木质纤维素的降解主要有化学法和酶法水解。与化学法水解相比，酶法 水解工艺条件温和，设备简单，能耗低，同时具有副产物少、环境友好等特点， 受到广泛重视并取得重大进展。
由于木质纤维素中的纤维素主要以结晶状态存在，因此纤维二糖水解酶在 木质纤维素水解中的作用相当重要。但目前现有的纤维二糖水解酶活力低，耗 酶量大，发酵成本高，且其在酸性条件下的酶解效率和转化率普遍偏低，严重 限制了木质纤维素在生物乙醇生产中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种纤维二糖水解酶突变体及其在木质纤维素降解中 的应用。本发明通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋 白。所述突变体在酸性条件下的酶活力得到显著提高，且耐热性更强，能大大 提高木质纤维素的降解效率，进而促进其在生物乙醇生产中的应用。
本发明一方面提供了一种纤维二糖水解酶突变体，是氨基酸序列为SEQID NO：1的纤维二糖水解酶第33位氨基酸由Gln变为Lys，第91位氨基酸由Ala 变为Lys，第105位氨基酸由Glu变为Ala，第112位氨基酸由Ala变为Thr， 第224位氨基酸由Asp变为Asn。
上述纤维二糖水解酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：3，其编码基因的 核酸序列为SEQIDNO：4。
本发明另一方面提供了一种重组质粒，其携带有编码序列为SEQIDNO：4 的纤维二糖水解酶突变体的基因。
本发明还提供了一种重组菌株，是通过将上述重组质粒转化入里氏木霉 (Trichodermareesei)中获得的。
本发明还提供了上述纤维二糖水解酶突变体在生物乙醇生产中的应用。
本发明提供的纤维二糖水解酶突变体比野生型的耐酸性更强，其最适pH为 5.0，且在pH4.0-7.0范围内均能保持65％以上的酶活水平，而野生型的最适pH 为5.5。所述纤维二糖水解酶突变体可广泛应用于木质纤维素的降解，能显著提 高木质纤维素的糖化率。其中，添加本发明所述纤维二糖水解酶突变体MAF7A 的实验组2中木质纤维素的糖化率比对照组提高了9.5％，比添加野生型纤维二 糖水解酶AF7A的实验组1提高了3.5％，取得了意料不到的技术效果。
附图说明
图1为重组菌株发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中，泳道1为 里氏木霉工程菌AF7A发酵上清液，泳道2为里氏木霉工程菌MAF7A发酵上清 液，泳道3为对照组宿主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液，泳道1和2中箭头所 指70kDa处的蛋白条带分别为重组表达的纤维二糖水解酶AF7A和突变体 MAF7A；
图2为纤维二糖水解酶突变体与野生型pH-相对酶活曲线图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001) 和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记 载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但 是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。
下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1：纤维二糖水解酶突变体基因的筛选
为了提高野生型纤维二糖水解酶AF7A(氨基酸序列为SEQIDNO:1，编码 核苷酸序列为SEQIDNO：2，由上海生工生物工程股份有限公司合成)在酸性 条件下的酶活力，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR 引物AF7A-F1、AF7A-R1如下：
AF7A-F1：GGCGAATTCATGATGCTGGCCTCCACCTTCTCC(下划线为限 制性内切酶EcoRI识别位点)；
AF7A-R1：ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGAGAGTAATAATC(下划线 为限制性内切酶NotI识别位点)；
以野生型纤维二糖水解酶AF7A基因SEQIDNO:2为模板，利用上述引物 用GeneMorphII随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR 产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化 至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出 现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μL含有0.1mMIPTG的 LB+Amp培养基，37℃，220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重 悬，反复冻融破壁，获得含有纤维二糖水解酶的大肠杆菌细胞裂解液。
各取50μL裂解液至两块新的96孔板，分别在pH6.0和pH4.0的条件下测 定其纤维二糖水解酶酶活。结果发现，有些突变子在酸性条件的酶活没有变化， 有些突变子的酶活甚至降低了，对在pH4.0条件下依然保持高酶活的突变子进 行DNA测序，最终，申请人获得了能显著提高纤维二糖水解酶酸性耐受性的突 变位点组合Q33K、A91K、E105A、A112T和D224N。
将含Q33K、A91K、E105A、A112T和D224N突变位点的纤维二糖水解酶 突变体命名为MAF7A，其氨基酸序列为SEQIDNO：3，编码核苷酸序列为SEQ IDNO：4。SEQIDNO：4由上海生工生物工程股份有限公司合成，并且在合成 序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点。
将合成后的基因片段用限制性内切酶KpnI和XbaI(Fermentas)进行酶切；同 时，用限制性内切酶KpnI和XbaI对载体pTG进行酶切；凝胶回收目的基因片 段和载体；并用T4DNA连接酶将上述两片段连接，转化Trans5α大肠杆菌，用 氨苄青霉素进行筛选。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化 质粒，将携带纤维二糖水解酶突变体基因序列的重组表达质粒命名为 pTG-MAF7A。
实施例2：纤维二糖水解酶突变体重组菌株的构建及验证
(1)原生质体制备
取里氏木霉(Trichodermareesei)SCHD4菌株孢子悬液，接种于PDA平板 上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120mL YEG+U(0.5％酵母粉、1％葡萄糖、0.1％尿苷)的液体培养基中，30℃，220rpm 振荡培养14～16h；
用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 mL10mg/mL裂解酶液(SigmaL1412)的三角瓶中，30℃，90rpm作用1-2h； 用显微镜观察检测原生质体转化进展；
将预冷的20mL1.2M山梨醇(1.2M山梨醇，50mMTris-Cl，50mMCaCl2) 加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm， 4℃离心10min；弃上清，加入预冷的5mL1.2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm， 4℃离心10min；弃上清，加入适量预冷的1.2M山梨醇悬浮分装(200μL/管， 原生质体浓度为108个/mL)。
(2)表达载体转化与菌株验证
以下操作均在冰上进行，取10μg重组质粒pTG-MAF7A加入到含有200μL 原生质体溶液的7mL无菌离心管中，然后加入50μL25％PEG(25％PEG，50 mMTris-Cl，50mMCaCl2)，轻弹管底混匀，冰上放置20min；加入2mL25％ PEG，混匀后室温放置5min；加入4mL1.2M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并 保持在55℃的上层培养基中(0.1％MgSO4,1％KH2PO4,0.6％(NH4)2SO4,1％葡萄 糖,18.3％山梨醇,0.35％琼脂糖)；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上 (2％葡萄糖，0.5％(NH4)2SO4，1.5％KH2PO4，0.06％MgSO4，0.06％CaCl2，1.5％ 琼脂)，30℃培养5～7d至有转化子长出。
挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2d；取适量菌丝体置于2mL离 心管中，加入100mg无菌石英砂和400μL抽提缓冲液(100mMTris-HCl，100mM EDTA，250mMNaCl，1％SDS)；用珠打仪剧烈振荡2min；65℃水浴20min后， 加入200μL10MNH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min；取上清，加入 2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用 70％乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。
以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物AF7A-F和AF7A-R进行 PCR扩增目的基因进行验证。
AF7A-F：ATGATGCTGGCCTCCACCTTCTCC；
AF7A-R：CTACAGGCACTGAGAGTAATAATC；
PCR扩增条件为94℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃1min，30个循环； 72℃7min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析， 构建得到了重组表达纤维二糖水解酶突变体的里氏木霉工程菌，将其命名为里 氏木霉MAF7A(TrichodermareeseiMAF7A)。
采用上述同样的方法构建得到重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程 菌，命名为里氏木霉AF7A(TrichodermareeseiAF7A)。
实施例3发酵验证和酶活测定
将上述里氏木霉工程菌MAF7A(TrichodermareeseiMAF7A)与里氏木霉工 程菌AF7A(TrichodermareeseiAF7A)分别接种于PDA平板，30℃培养1d，待孢 子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基(1.5％ 葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH4)2SO4，0.09％MgSO4，2％KH2PO4， 0.04％CaCl2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素)的250mL三角瓶中，30℃培养 48小时，然后25℃培养48小时，取发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测分析。 结果如图1所示，泳道1和2中箭头所指70kDa处的蛋白条带分别为纤维二糖 水解酶AF7A和突变体MAF7A，从而说明本发明构建的里氏木霉工程菌AF7A 能有效表达野生型纤维二糖水解酶AF7A，里氏木霉工程菌MAF7A能有效表达 纤维二糖水解酶突变体MAF7A。
(1)酶活测定方法
在50℃、pH值为4.8的条件下，每分钟从浓度为0.05％对硝基苯基-β-D- 纤维二糖苷的溶液中降解释放1μmol对硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活单位。
取试管各加入已稀释好的酶液0.5ml；同时放置50±0.1℃水浴中，预热 2min；准确向样品试管中加入0.5mL底物溶液，准确即时15min，迅速向各管 中加入碳酸钠溶液0.2ml，于空白管中加入底物溶液0.5ml，摇匀。以空白管调 零，在分光光度计波长410nm下测量。
酶活X＝A×1÷0.5×n÷15
其中：X——酶活力单位，IU/g(mL)；
A——吸光度在标准曲线上算得的对硝基苯酚含量，μmol；
1/0.5——所加入的酶液体积；
15——待测液与底物的反应时间；
n——稀释倍数；
(2)酶活测定结果
采用上述方法分别测定宿主菌里氏木霉SCHD4、里氏木霉AF7A和里氏木 霉MAF7A发酵上清液中纤维二糖水解酶酶活。结果显示：宿主菌发酵上清液未 测到酶活，里氏木霉AF7A和里氏木霉MAF7A发酵上清液酶活分别为67U/mL 和93U/mL。从而进一步说明，本发明构建的重组菌里氏木霉AF7A和里氏木霉 MAF7A能分别高效表达纤维二糖水解酶AF7A和突变体MAF7A。
实施例4酶学性质分析
4.1最适作用pH分析
分别用pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的 缓冲液稀释实施例3所述里氏木霉AF7A和里氏木霉MAF7A发酵上清液，在 50℃条件下测定其纤维二糖水解酶酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活， 做pH-相对酶活曲线。结果如图2所示，野生型纤维二糖水解酶AF7A的最适作 用pH为5.5，而纤维二糖水解酶突变体MAF7A的最适作用pH为5.0，且在 pH4.0-7.0范围内均能保持65％以上的酶活水平，与野生型相比，突变体的耐酸 性得到显著提高。
4.2最适作用温度分析
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃， pH5.0条件下，测定实施例3所述里氏木霉AF7A和里氏木霉MAF7A发酵上清 液的纤维二糖水解酶酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶 活曲线。结果显示：与野生型相比，本发明提供的纤维二糖水解酶突变体MAF7A 的最适作用温度没有发生改变，最适温度均为60℃。
实施例5纤维二糖水解酶在木质纤维素降解中的应用
准备3个250mL的三角瓶，各加入2g绝干玉米芯粉(主要成分为木质纤维 素)；按照固液比为1：10(m/v)分别加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液150mL，pH 为5.0左右；分别加入4.0mg酸性纤维素酶L30(购自潍坊康地恩生物科技有限 公司，酶活500U/mg)；然后向3个三角瓶中分别加入0.6mg酸性纤维素酶L30、 0.6mg纤维二糖水解酶AF7A(酶活500U/mg)和0.6mg突变体MAF7A(酶活 500U/mg)；在50℃条件下震荡酶解；48h后，分别取样，用生物传感分析仪测 定其葡萄糖含量，计算玉米芯粉的糖化率，具体结果见下表。
糖化率(％)＝酶解后得到的葡萄糖的含量(mg/g木质纤维素原料)÷底 物总葡萄糖含量(mg/g木质纤维素原料)×100％
从表中的数据可以看出，与对照组相比，实验组1和2通过添加纤维二糖 水解酶，与酸性纤维素酶共同作用，能显著促进木质纤维素的降解，提高木质 纤维素的糖化率。其中，添加本发明所述纤维二糖水解酶突变体MAF7A的实验 组2中木质纤维素的糖化率比对照组提高了9.5％，比添加野生型纤维二糖水解 酶AF7A的实验组1提高了3.5％，取得了意料不到的技术效果。