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本申请要求于2012年12月7日提交的美国申请编号61/734,919的 优先权，所述专利申请以引用的方式全文纳入本文。
序列表
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技术领域
本申请涉及包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的组合物， 以及所述组合物的用途，包括作为疫苗。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的特征在于，母猪的严重繁殖障 碍和高比例的晚期流产和早产，以及幼猪的呼吸疾病和死亡。PRRS 是由具有单链正义RNA基因组的小的包膜病毒导致，所述病毒属于 动脉病毒科(Arteriviridae)动脉病毒属(Arterivirus)。在天然条 件下，PRRS病毒在肺泡巨噬细胞中复制并且能够维持长时间的病毒 血症，在一些情况下导致持续数月的持续性感染。所述疾病于20世 纪80年代晚期在美国和欧洲突然出现，随后已经在全世界传播，给 猪饲养业带来重大经济损失。所述病毒能够在被感染的农场中持续存 在，这主要是由于其存在于被持续感染的携带者母猪中。
根据PRRS病毒所来源的大陆将其分成两种基因型。来源于北美 的PRRS病毒毒株被分类为2型基因型，而来源于欧洲的PRRS病毒 毒株被指定为1型基因型。目前两种基因型都在全球传播。所述两种 基因型在基因组水平上彼此相差约40％，并且在血清学上也是不同 的。每种基因型内的分离株也表现出最高达20％的相当大的核苷酸 序列异质性。PRRS病毒似乎是通过随机突变和基因内重组事件而进 化的。
根据对西班牙毒株的序列分析，已估计PRRS病毒表现出的突变 率为在每个位点每年1-3×10-2次置换，这与其他快速进化的RNA病 毒的突变率类似。在过去的25年中已观察到的PRRS病毒的巨大遗 传变异，以及产生与较早分离株相比更高发病率和死亡率的PRRS病 毒分离株在本领域中的出现是值得注意的。此外，正逐渐认识到每种 PRRS病毒原液(stock)通常作为遗传相关物种的混合物存在的事实。
在兽医学中用于保护动物免患病毒疾病的常见类型的生物制品 是由经修饰的活病毒(MLV)疫苗组成。用于产生减毒活病毒疫苗 的最常用的方法是在基质(通常是细胞培养物)而非天然宿主中和/ 或不利条件下连续传代致病病毒，直至所述病毒从其初始的毒力(产 生疾病的能力)充分减毒但仍保持诱导保护性免疫的能力。1996年， 第一种MLV疫苗被引入北美市场，所述疫苗是基于在1991年分离 的PRRS病毒毒株VR-2332。通过使所述病毒在35-37℃下在猿猴肾 细胞(MA-104/MARC-145)中进行25次连续传代，然后在31℃下 在相同的细胞型中进行12次额外传代(共36次传代)，获得所述减 毒疫苗株。
随后，由于观察到最初的PRRSMLV疫苗保护效力下降(推测 是由于流行的PRRS病毒分离株的基因组中进化的遗传改变，这导致 出现毒力更强且遗传上不同的(异源的)PRRS病毒毒株)，因此在 1999年引入第二个版本的MLV疫苗。这次行动的原理是增大疫苗株 的遗传同源性使其超过20世纪90年代后期本领域中传播的同期病毒 的遗传同源性。该减毒疫苗株来源自在1997年从PRRS的严重病例 中分离得到的JA-142PRRS病毒，并且代表该分离株在37℃下在猴 肾细胞系MARC-145中的200次连续传代。已记载了这些疫苗的两 种祖先分离株(progenitor)VR-2332和JA-142分别表现出中等水平 和高水平的毒力，因此这解释了为了产生减毒的疫苗病毒，需要在细 胞培养物中在不利条件下进行中等次数的传代(VR-2332)或在更温 和的环境中进行更多次的连续传代(JA-142)。值得注意的是，将这 些减毒的PRRS病毒毒株接种到猪中导致持续4周以上的病毒血症。 在此期间，所述病毒从身体分泌物中排出，导致所述疫苗病毒传播到 未接种的动物。因此，这些疫苗的使用导致其从减毒表型倒退为毒力 表型。
用野生型PRRS病毒感染猪或者用该病原体的活的减毒形式进行疫 苗接种引发产生病毒特异性但是非中和的抗体，以及产生少量中和抗体。 此外，在此期间，产生有限数量的干扰素(IFN)γ分泌细胞(SC)。 病毒中和抗体和病毒特异性IFNγSC的产生被认为是引发针对PRRS病 毒的保护性免疫的主要决定因素。被广泛接受的是，PRRS病毒天然会 刺激不平衡(即强体液应答，其特征在于产生丰富的非中和抗体和有限 但具有潜在保护性的T细胞介导的基于IFNγ的细胞免疫)和非保护性 免疫应答。之前已提出，决定产生通常观察到的针对疫苗接种或感染的 非保护性的适应性免疫应答的最相关的参数是缺少由PRRS病毒所引发 的充分的先天免疫应答。被病毒感染的细胞通常分泌I型IFN(IFNα 和IFNβ)，所述I型IFN在邻近的细胞中引起分子改变以帮助这些细 胞保护自身免受病毒感染。值得注意的是，猪对PRRS病毒感染的IFNα 应答几乎不存在。
已经假设，不存在针对PRRS病毒的感染或疫苗接种的充分的先天 免疫应答，可以至少部分导致特异性病毒中和抗体的延迟产生以及猪针 对这种病毒的细胞介导的免疫应答的延迟出现。因此，PRRS病毒可通 过在感染其宿主后不引发充分的IFNα产生而避开Th-1型应答的发生。 就这点而言，已知浆细胞样树状突细胞(pDC)在诱导早期抗病毒状态 中发挥重要作用，这是由于除了其他细胞因子(例如，对适应性免疫的 发生具有重要影响的肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素6(IL-6)) 以外，pDC还迅速并大量分泌IFNα。尽管pDC仅占猪外周血单核细胞 (PBMC)群的一小部分(<1％)，它们却产生了新鲜分离的猪PBMC 样品中所分泌的IFNα中的大多数。值得注意的是，与刺激pDC分泌大 量IFNα的其他猪病毒不同，PRRS病毒引发这种细胞亚群的少量IFNα 应答，甚至通过主动抑制被刺激的pDC分泌IFNα和TNFα的能力而 对其功能产生不利影响。可合理地预料到，这种阻碍对宿主随后的适应 性免疫应答的性质具有显著影响。通过在用PRRSMLV疫苗进行免疫时 提供外源性IFNα源而对PRRS病毒特异性的T细胞介导的IFNγ应答 的强度产生的增强作用，提供了对该假说的支持。
在本领域中，一直需要有效且经济的疫苗，以保护猪免受PRRS感 染的影响，从而使损失最小。
发明内容
在本发明的一个实施方案中，本文提供了一种分离的猪繁殖与呼吸 综合征(PRRS)病毒。所述病毒的基因组可编码选自如下的蛋白：在 相对于SEQIDNO:25的第31位上包含缬氨酸的E蛋白、在相对于 SEQIDNO:25的第60位上包含丙氨酸的E蛋白，或在相对于SEQID NO:21的第94位上包含缬氨酸的GP3蛋白。所述病毒的基因组还可 编码在相对于SEQIDNO:25的第31位上包含缬氨酸的E蛋白、在 相对于SEQIDNO:25的第60位上包含丙氨酸的E蛋白，和在相对 于SEQIDNO:21的第94位上包含缬氨酸的GP3蛋白。所述病毒的 基因组可包含SEQIDNO:1的序列或其RNA等价序列。
作为一个实施方案，本文还提供了一种包含所述病毒和可药用载 体的疫苗。所述疫苗还可包含免疫佐剂。
作为一个实施方案，本文还提供了在哺乳动物中诱导特异性针对 PRRS病毒的免疫应答的方法，所述方法可包括将所述疫苗给予有此 需要的哺乳动物。所述疫苗还可包含免疫佐剂。
在一个实施方案中，所述免疫佐剂可以是干扰素α(IFN-α)、 干扰素β(IFN-β)、白细胞介素-12、白细胞介素-15和白细胞介素-18； 编码干扰素α的核酸；编码白细胞介素-12的核酸、编码白细胞介素 -15的核酸；编码白细胞介素-18的核酸；编码干扰素β的核酸；诱导 或增强干扰素α的活性的物质；诱导或增强干扰素β的活性的物质； 多聚IC或多聚ICLC。可在给予所述疫苗的同时、在给予所述疫苗 之后24小时内或在给予所述疫苗之前24小时内给予所述免疫佐剂。 所述给药可以是肌肉内、真皮内、粘膜、口服、舌下、眼内、鼻内、 静脉内、腹膜内、局部或经皮肤给药。所述给药可以是肌肉内给药。
本文还提供了分离的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，其被 保藏在美国典型菌种保藏中心(theAmericanTypeculture Collection)，被指定为ATCC专利保藏号PTA-120658。
在一个实施方案中，本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的分离的毒株，其中所述毒株是G16X、111698或794A61。 在一个实施方案中，所述毒株是G16X。在一个实施方案中，所述毒 株具有SEQIDNO:1中所示的基因组RNA序列(毒株G16X)。在 一个实施方案中，本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 的分离的毒株，其中所述毒株具有SEQIDNO:1(毒株G16X)或 SEQIDNO:3(毒株111698)中所示的基因组RNA序列。在一个实 施方案中，本发明提供了PRRSV的分离的毒株，所述毒株具有由SEQ IDNO:12和SEQIDNO:14中所示的序列表征的蛋白E序列；由 SEQIDNO:16和SEQIDNO:17表征的GP3序列；由SEQIDNO:7 表征的Nsp2序列；和/或由SEQIDNO:19表征的GP4序列。
在一个实施方案6中，本发明提供了PRRSV的分离的毒株，其 中所述毒株具有与SEQIDNO:1(G16X)具有至少95％同一性的核 酸序列，并且所述毒株相对于PRRS病毒毒株89-46448-40的蛋白序 列具有一个或多个所编码的氨基酸置换，所述氨基酸置换选自：蛋白 Nsp2V/M67V；蛋白Nsp2P/S490P、Nsp2P495L；Nsp2Y338H；蛋 白EI31V；蛋白ET60A；蛋白GP3I94V；和蛋白GP3P/S96S。在 一个实施方案中，所述毒株具有一个或多个如以下所示的所编码的氨 基酸：蛋白Nsp267V；蛋白Nsp2490P；蛋白Nsp2Y338H；蛋白 Nsp2P495L；蛋白E31V；蛋白E60A；蛋白GP394V；蛋白GP3 L213F；蛋白GP396S和蛋白GP4A32S。在其他实施方案中，所述 毒株具有如本文别处所描述的同一性水平百分数。在一个实施方案 中，有利的是，当PRRSV的疫苗株被给予猪时，其具有由例如巨噬 细胞产生的高的干扰素α应答的表型。在一个实施方案7中，本发明 提供了一种免疫原性组合物，其包含至少一种分离的PRRSV毒株以 及还包含可用于兽医用途的药物载体，所述分离的PRRSV毒株选自 G16X、111698和实施方案6的毒株。
在一个实施方案中，本发明提供了在动物中诱导特异性针对猪繁 殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的免疫应答的方法，所述方法包括 给予动物本文所描述的免疫原性组合物的步骤。在一个实施方案中， 所述免疫原性组合物还包括免疫佐剂。
在一个实施方案中，免疫原性组合物还包括免疫佐剂。在一个实 施方案中，所述免疫佐剂包括以下物质中的至少一种：干扰素α、干 扰素β、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18、在猪细胞 中表达的编码干扰素α的核酸、在猪细胞中表达的编码白细胞介素-12 的核酸、在猪细胞中表达的编码白细胞介素-15的核酸、在猪细胞中 表达的编码白细胞介素-18的核酸、在猪细胞中表达的编码干扰素β 的核酸、诱导或增强干扰素β或干扰素α或二者的活性的物质，以及 多聚IC或多聚ICLC。在一个实施方案中，在给予所述免疫原性组 合物的同时、在给予所述免疫原性组合物之后24小时内或在给予所 述免疫原性组合物之前24小时内给予所述免疫佐剂。
在一个实施方案中，免疫原性组合物的给药是肌肉内、真皮内、 粘膜、口服、舌下、眼内、鼻内、静脉内、腹膜内、局部或经皮肤给 药。在一个实施方案中，给药是肌肉内给药。
附图说明
图1说明在用PRRS病毒分离株89-46448-40、NADC-20或模拟 接种物(mockinoculum)感染后第7天和第14天，猪的体重改变(％)。 根据激发时的体重来确定体重增加百分数。计算各组的平均值 (±SEM)。
图2表示在用PRRS病毒分离株89-46448-40或NADC-20或模拟 接种物感染猪之后的血清病毒血症。在ZMAC细胞(ATCCNo. PTA-8764，野猪(Susscrofa)(猪(pig/swine))肺组织细胞)中 测定猪血清样品中传染性病毒的数量(TCID50/ml)。
图3说明用PRRS病毒分离株89-46448-40或NADC-20或模拟 接种物感染14天的猪的肺部总病理学得分。根据本领域已知的评分 系统来确定总肺病理学得分。
图4A-4D提供了PRRS病毒分离株89-46448-40和衍生毒株 794A61、111698和G16X之间非结构蛋白2(Nsp2，图4A)、蛋白 E(图4B)以及糖蛋白GP3(图4C)和GP4(图4D)的一级结构中 预测的氨基酸差异。粗体字母示出了PRRSV89-46448-40、794A61、 111698和G16X的完整蛋白E和GP3以及Nsp2和GP4的连续部分 (以<和>指示)的预测的氨基酸序列中有区别的氨基酸位点。加框的 字母对示出了PRRS病毒89-46448-40的一些蛋白中的多态位点。
图5示出了猪肺泡巨噬细胞针对不同类型的PRRS病毒感染的干 扰素α应答。以标示的感染复数(MOI)用PRRS病毒感染ZMAC 细胞。通过特异性针对猪干扰素α的ELISA测定在所述细胞暴露于 所标示的病毒后8h时收集的培养物上清液中干扰素α的量。
图6示出了不同的PRRS病毒毒株对于肺泡巨噬细胞对多聚 (I:C)的干扰素α应答的影响。模拟感染或用标示的病毒(MOI＝5) 感染ZMAC细胞。在孵育2h之后，将细胞培养物暴露于25mg/ml 多聚(I:C)。8h后收集细胞培养基，并通过特异性针对猪干扰素α 的ELISA检测干扰素α的存在。
图7提供了在用有毒力的PRRS病毒激发后第7天时未接种PRRS病毒(PRRSvirus)和接种PRRS病毒的猪的体重改变(％)。根据激发时体重来确定体重增加百分数。计算每组的平均值(±SEM)。
图8说明用有毒力的PRRS病毒激发之后在未接种PRRS病毒和 接种PRRS病毒的猪中的病毒血症的程度和频率。通过实时定量PCR 来测定在用有毒力的PRRS病毒激发之后第7天从猪采集的血清样品 中PRRS病毒基因组的拷贝数。
图9示出了用有毒力的PRRS病毒激发之后在未接种PRRS病毒 和接种PRRS病毒的猪中的BAL液中的病毒载量。在ZMAC细胞中 滴定在用有毒力的PRRS病毒激发后第14天采集的猪BAL液样品中 的传染性病毒的量(TCID50/ml)。
图10A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDNO:26)、 89-46448-40、794A61和111698(后三者为SEQIDNO:25)的蛋白 E氨基酸序列的比对。图10B示出了来自G16X的蛋白E的氨基酸序 列(SEQIDNO:26)，图10C示出了来自毒株89-46448-40的蛋白E 的氨基酸序列(SEQIDNO:25)。
图11A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDNO:23)、 89-46448-40(SEQIDNO:23)、794A61(SEQIDNO:23)和111698 (SEQIDNO:24)的GP4氨基酸序列的比对。图11B示出了来自毒 株89-46448-40的GP4的氨基酸序列(SEQIDNO:23)。图11C示 出了与PRRSV分离株89-46448-40相关的GP4的氨基酸序列(SEQ IDNO.24)。
图12A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDNO:22)、 89-46448-40(SEQIDNO:21)、794A61(SEQIDNO:22)和111698 (SEQIDNO:48)的GP3氨基酸序列的比对。图12B表示来自毒株 89-46448-40的GP3的氨基酸序列(SEQIDNO:21)。图12C表示 与PRRSV分离株G16X相关的GP3的氨基酸序列(SEQIDNO.22)。
图13示出了用IngelvacPRRSMLV或G16X接种后猪的血清干 扰素α的水平。如在“材料和方法”中所述用IngelvacPRRSMLV 或G16X接种两组猪(n＝6)。在接种后所标示的时间点采集血清样 品并通过ELISA测定血清干扰素α的水平。数据代表在每个处理组 中每个时间点检测的6个样品的平均值±SE。模拟接种动物在每个测 试的时间点具有<2pg/ml血清(数据未示出)。
图14示出了暴露于有毒力的PRRS病毒之后猪的体重(BW)改 变。在用野生型PRRSV分离株LTX1激发之前不久以及激发后第7、 10和14天对模拟接种、接种IngelvacPRRSMLV或接种G16X病毒 的猪(每组n＝6)进行称重。还在所述4个时间点对未被激发且未接 种的动物(严格对照，n＝6)进行称重。在个体基础上测定激发后接 下来的第7、10和14天期间的BW改变，并计算相对于激发时BW 的体重改变百分数(％)。结果代表每组的平均体重改变百分数(％) +/-SDEV。除了G16X组，所有组都是由每组6只动物组成。G16X 组有6只动物，直到第10天该组减少到5只动物。该组中的一只动 物被排除，因为它患了肠扭转，需要在病毒激发后第10天对该动物 施行安乐死。
图15示出了暴露于有毒力的PRRS病毒后猪的病毒血症的程度 和频率。在用野生型PRRS病毒LTX1激发之前不久和激发后的标 示天数从模拟接种、接种IngelvacPRRSMLV或接种G16X病毒的 动物采集血清样品。还在这些时间点采集未激发且未接种的动物(严 格对照)(n＝6)的样品。通过在ZMAC细胞中进行传染性病毒滴定 来测定血清中的病毒载量。提供各个猪的结果，然后计算每组成员的 平均值(水平红色柱)。在激发后第10天将G16X组的一只猪从试 验中排除(参见图14的图注)。
图16示出了暴露于有毒力的PRRS病毒后猪的BAL液中的病毒 载量。在用野生型PRRS病毒LTX1激发后第14天从模拟接种、接 种IngelvacPRRSMLV或接种G16X病毒的动物的肺采集BAL液。 还在此时间点从未激发且未接种动物(严格对照)(n＝6)获得样品。 通过在ZMAC细胞中进行传染性病毒滴定来测定每只动物的BAL液 中的病毒载量。提供各个猪的结果，然后仅使用病毒阳性样品计算每 组成员的平均值(水平柱)。
具体实施方式
猪繁殖与呼吸综合征病毒在20世纪80年代后期首先出现在美国。 过去几年中美国猪种群中PRRS患病率的显著增加最好地说明了需 要新工具来控制PRRS的令人信服的证据。动植物卫生检验局 (APHIS)所进行的血清学调查表明，在2000年观察到的养殖者/加 工者(grower/finisher)美国猪群中PRRS的最初患病率为35％，到 2006年增加到53％。从那时起，所述患病率持续升高，到2009年所 述患病率令人担忧地高达71％，这代表在9年中患病率>200％的增 加。现在，美国70％以上的猪群被北美型(基因型2)PRRS病毒感 染，导致每年的经济损失超过6.64亿美元，使PRRS成为猪养殖业 带来损失最高的疾病。
作为猪养殖业的主要经济问题，美国国家猪肉委员会(NPB)将 在猪的商业种群中控制和根除PRRS病毒视为最优先的事。但是，疾 病控制被证明难以在很大程度上实现，因为该病毒的RNA基因组表 现出很高的突变速率，这导致显著且持续的遗传/抗原病毒的多样化。 这可通过以下事实得到清楚的说明：存在这样的9种明确定义的2型 (或北美样)PRRS病毒谱系，在其之间表现出较大的系统发生差异。 从25年前这一主要的猪病原体首次出现起，所述9种不同的北美样 PRRS病毒谱系就已经出现，并且包含了目前世界上存在的PRRSV 病毒的大的遗传差异。这些谱系在遗传上是不同的，这可通过至少 11％的谱系内多样性来证实。大多数(>95％)在美国已分离的PRRS 病毒属于这些谱系中的四个，即谱系1、5、8和9。
通常认为，PRRSMLV疫苗针对因有毒力的PRRS病毒感染而 导致的疾病的保护性效力水平主要取决于所述两种病毒的遗传相似 性(同源性)。因此，基于本领域中表现出的集体智慧，同时期的 PRRS病毒毒株之间的遗传多样性中的时间依赖性的增加，应当会使 具有过时基因型的减毒PRRS病毒疫苗不能在猪中赋予针对最近进 化的PRRS病毒的充分有效的保护性免疫。因此，应当注意到，目前 可获得的两种疫苗产生自1991和1997年分离的原始野生型病毒，并 且属于谱系5或8，所述谱系与目前在本领域中流行的且属于谱系1 或9的大多数(60％)PRRS病毒毒株在系统发生上距离非常远。尽 管这种差异可影响所述两种商用疫苗的免疫潜能，其他因素(例如免 疫病毒的性质对其作为疫苗的效力的影响)尚未被考虑。
本发明人发现了三种名为G16X、794A61和111698的新的变异 毒株，所述毒株衍生自北美PRRS病毒分离株89-46448-40，并且令 人惊讶的是，其与亲代病毒毒株相比在病毒感染的猪肺泡巨噬细胞中 显著更强地刺激IFNα。通过噬菌斑纯化或终点稀释从所述亲代毒株 获得所述新变体。所述三种变异毒株中若干新的点突变将其与亲代 89-46448-40病毒区分开，所述亲代89-46448-40病毒基于其ORF5 序列属于在北美出现的最早的PRRS病毒谱系，即谱系5。所述 89-46448-40病毒天然表现出可忽略的毒力，并且可能是遗传相关病 毒的混合种群，所述遗传相关病毒在于其基因组核苷酸序列中相差若 干单核苷酸突变。所述病毒毒株G16X、794A61和111698的序列差 异在于相对于89-46448-40病毒的若干同义和非同义点突变，它们基 于其ORF5核苷酸序列全部属于2型PRRSV亚谱系5.1。在所述三 种新毒株基因组中的突变导致与89-46448-40病毒编码的蛋白相比 2-5个氨基酸的改变。
此外，出乎意料的是，与89-46448-40病毒不同，G16X不抑制 暴露于合成的双链(ds)RNA分子多聚(I:C)的猪巨噬细胞合成IFN α。相反，所述G16X毒株增强对该分子的应答，所述分子已经是猪 肺泡巨噬细胞产生该细胞因子的强诱导剂。值得注意的是，尽管 G16X、794A61和111698几乎是同基因的，但是它们在随后用属于 谱系8的高毒力且遗传上不同(异源的)PRRS病毒分离株激发后在 疫苗效力方面彼此间存在显著差异[差(794A61)，中等(111698) 和良好(G16X)]。令人吃惊的是，与其他两种毒株(794A61和111698) 相比，G16X在被给予该毒株的猪中具有产生保护性免疫应答的优异 能力。这可通过G16X使传染性谱系8(异源)激发病毒更快减少和 /或清除而得到证明。此外，当评估其针对属于谱系1的不同的异源 的有毒力2型PRRS病毒的疫苗效力时，G16X病毒也能够刺激强的 保护性免疫。
此外，由于亲代89-46448-40病毒分离株所表现出的微不足道的 毒力和所述三种衍生毒株的明显疫苗效力，可将本文所公开的突变 PRRS病毒用作活PRRS病毒疫苗，而不必通过在培养的哺乳动物细 胞中连续传代或通过减毒来修饰其生物特性。此外，由于祖先病毒分 离株天然可忽略的毒力，所述疫苗发展出有毒力的表型的风险是不可 能的。因此，本发明人做出了与众不同的发现：衍生自具有可忽略毒 力的原始PRRS病毒的毒株能够在猪中诱导针对以异源(不同谱系) 的有毒力PRRS病毒进行的激发的保护性免疫。
1.定义
本文所使用的术语的目的仅为描述具体的实施方案，并不意欲进行 限制。如说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明， 单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物。
对于本文数值范围的描述，每个介于其中间的具有相同精确度的数 值被明确地包含在内。例如，对于范围6-9，除了6和9，也考虑到了数 字7和8，以及对于范围6.0-7.0，明确考虑到了数字6.0、6.1、6.2、 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
“细胞”指如本领域中所理解的生物实体，其意欲包含可以为原代 细胞或细胞系的细胞。当本文中使用若干所述术语时，本领域普通技术 人员应当理解，该使用的目的仅为强调公知区别。例如，词语“一个细 胞或细胞系”可强调初始的原代分离株与作为所述初始的原代分离株直 接衍生物的永生形式之间的对比。
“分离的”指与天然状态不同的和/或相对于起始材料是经修饰的操 控状态，在这种情况下所述术语的含义与被纯化的概念一致。例如，分 离的原代细胞是从宿主生物的天然组织或其他来源被切除，并且保持与 原始来源分开。另一个实例是，可将细胞成分放置在培养物中，或进一 步与基于肺灌洗液的样品分开，因此获得相对分离的细胞。
“肽”或“多肽”是氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成 的、或天然和合成的序列的修饰或组合。
“猪繁殖与呼吸综合征”或“PRRS”指有时被称为“神秘猪疾病”、 “猪不育和呼吸综合征”和“蓝耳病”的疾病的致病因素。术语“猪繁 殖与呼吸综合征”或“PRRS”意欲包括Wensvoortetal.1992,J.Vet. Diagn.Invest.,4:134-138和Mardassietal.,1994,J.Gen.Virol., 75:681-685中所述的PRRS病毒分离株之间的抗原、遗传和致病差异， 所述文献内容以引用形式纳入本文。
“纯化的”指这样一种状态，其中相对于起始材料，物质已经相 对富集、分离和/或移除。所述术语可包含至少部分纯化的状态，并 且不必意指绝对纯净状态。例如，所述术语可应用于这样的PRRS病 毒，即其存在混合的原液中但主要是同基因的，并且在遗传上可以是 至少75％、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、 99.4、99.5、99.6、99,7、99.8、99.9或100％同源的。“纯化的”可 独立地适用于通常可被认为是纯的病毒制品或原液的那些。
当指保护动物免受疾病时，“疗法”或“治疗”意指预防、遏制、 抑制或完全消除疾病。预防疾病包括在发病前给予动物本发明的组合 物。遏制疾病包括在疾病诱导之后但在其临床表现之前给予动物本发 明的组合物。抑制疾病包括在疾病临床表现之后给予动物本发明的组 合物。
当指本文所公开的蛋白序列时，“变体”意指具有与参考序列具 有至少50、55、60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序 列的蛋白。所述变体还可保留参考蛋白的至少一种生物活性，并且还 可保留参考序列的至少一种免疫或免疫原性特性。所述生物活性可以 是使IFNα活性增加。
2.猪繁殖与呼吸综合征病毒
a.病毒
本文提供了一种病毒，其可以是PRRS病毒。所述病毒可以是分 离的，可以是纯化的，可以是减毒的，以及可以是修饰的活病毒。所 述病毒与参考89-46448-40病毒相比能够在猪肺泡巨噬细胞中刺激更 强的IFNα应答。
所述病毒可包含编码以下蛋白的基因组，所述蛋白可以是可包含 图4、10、11或12中所示的序列或其变体的NSP2、E、GP3或GP4。 所述病毒还可包含编码以下蛋白的基因组，所述蛋白可以是GP2 (SEQIDNO:31)、GP5(SEQIDNO:32)、基质蛋白(SEQID NO:33)、核衣壳蛋白(SEQIDNO:34)、NSP1α(SEQIDNO:35)、 NSP1β(SEQIDNO:36)、NSP2(SEQIDNO:37)、NSP3(SEQID NO:38)、NSP4(SEQIDNO:39)、NSP5(SEQIDNO:40)、NSP6 (SEQIDNO:41)、NSP7(SEQIDNO:42)、NSP8(SEQIDNO:43)、 NSP9(SEQIDNO:44)、NSP10(SEQIDNO:45)、NSP11(SEQ IDNO:46)或NSP12(SEQIDNO:47)，或其变体。
所述NSP2蛋白可包含可代表NSP2蛋白的第63-72位氨基酸 SEQIDNO:4的序列或其变体。参照SEQIDNO:4中的位置，所述 NSP2蛋白可在第5位包含缬氨酸(其可以是NSP2蛋白中的67V)。 所述NSP2蛋白还可包含可代表全长NSP2蛋白的第334-343位氨基 酸的SEQIDNO:6的序列或其变体。参照SEQIDNO:6中的位置， 所述NSP2蛋白可在第5位包含组氨酸(其可以是NSP2蛋白中的 338H)。所述NSP2蛋白可包含可代表全长NSP2蛋白的第488-497 位氨基酸的SEQIDNO:8的序列或其变体。参照SEQIDNO:8中的 位置，所述NSP2蛋白可在第3位包含脯氨酸(其可以是NSP2蛋白 中的490P)，以及可在第8位包含亮氨酸(其可以是NSP2蛋白中的 495L)。所述NSP2蛋白的序列还可包含SEQIDNO:5、7、9和10 中的一个或多个。
所述E蛋白可包含SEQIDNO:25的序列或其变体。参照SEQID NO:25中的位置，所述E蛋白可在第31位包含缬氨酸(31V)，以 及可在第60位包含丙氨酸(60A)。所述E蛋白的序列可包含SEQID NO:26。参照SEQIDNO:25中的位置，所述E蛋白的序列还可在 第27-36位包含SEQIDNO:11或12，以及参照SEQIDNO:25中 的位置，还可在第56-65位包含SEQIDNO:13或14。
所述GP3蛋白可包含SEQIDNO:21的序列或其变体。参照SEQ IDNO:21中的位置，所述GP3蛋白可在第94位包含缬氨酸(94V)， 可在第96位包含丝氨酸(96S)，以及可在第213位包含苯丙氨酸 (213F)。所述GP3蛋白的序列还可包含SEQIDNO:22。参照SEQ IDNO:21中的位置，所述GP3蛋白的序列还可在第90-99位包含 SEQIDNO:15或16，以及参照SEQIDNO:21中的位置，还可在第 209-218位包含SEQIDNO:17或18。
所述GP4蛋白可包含SEQIDNO:23的序列或其变体。参照SEQ IDNO:23中的位置，所述GP4蛋白可在第32位包含丝氨酸(32S)。 所述GP4蛋白的序列可包含SEQIDNO:24。参照SEQIDNO:23 中的位置，所述GP4蛋白的序列可在第28-37位包含SEQIDNO:19 或20。
所述病毒的基因组可编码包含V31和60A的E蛋白，以及包含 94V的GP3蛋白。所述病毒的基因组还可编码包含495L的NSP2蛋 白，以及包含94V的GP3蛋白。所述病毒的基因组可编码包含338H 和495L的NSP2蛋白、包含94V和213F的GP3蛋白，以及包含32S 的GP4蛋白。
所述病毒的基因组可包含G16X、794A61或111698病毒基因组 的序列。所述G16X病毒可以是按照《布达佩斯条约》在2013年10 月22日保藏在美国典型菌种保藏中心(ATCC，10801University Boulevard,Manassas,VA20110USA)的病毒毒株，所述保藏单位指 定其登录号为PTA-120658，并且保藏人鉴定参考为PRRSV病毒 G16X。G16X、794A61和111698病毒基因组的序列可分别为SEQID NO:1、2和3，或其RNA等价序列。SEQIDNO:1-3缺失G16X、 794A61和111698病毒基因组5’端的前31个核苷酸。所述病毒的基 因组还可以是本文所公开的序列的变体。所述基因组变体可以与SEQ IDNO:1、2或3具有至少40、50、55、60、65、70、75、76、77、 78、79、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、 99.6、99,7、99.8、99.9或100％的同一性。所述病毒还可包含本文所 述的PRRS病毒基因组序列的RNA等价序列(即与某一DNA100％ 互补的RNA，所述DNA与参考DNA序列100％互补)。
通过本领域已知方法可确定基因组序列与另一个目的序列的同 一性百分数(％)。例如，可通过GAP(NeedlemanandWunsch,1970) 分析(GCG程序)来确定序列的同一性百分数(％)，空位生成罚 分＝5，空位延伸罚分＝0.3。查询序列的长度可以为至少150个核苷酸， 所述GAP分析可在至少150个核苷酸的区域比对两个序列。查询序 列的长度可以为至少300个核苷酸，所述GAP分析可在至少300个 核苷酸的区域比对两个序列。所述GAP分析可在其全长上比对两个 序列。
所述变体还可包含一个或多个相对于G16X、794A61或111698 病毒基因组的突变，所述突变可以是病毒基因组的缺失、插入或置换。 在给予哺乳动物所述变体时，所述变体允许所述病毒在哺乳动物中提 供有效的免疫应答，并且可以使得所述病毒在哺乳动物中不导致疾 病。所述变体中的突变可以是天然存在的(即可从天然来源分离)， 或可以是合成的(可通过定向诱变产生)。可通过本领域中已知的任 何方法引入所述变体中的突变。
所述变体可在严格条件下与G16X、794A61或111698基因组杂 交。本文所使用的术语“严格杂交条件”等指本领域所熟知的参数， 包括杂交温度随寡核苷酸长度的变化。例如，本文所使用的严格杂交 条件可以指65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％聚蔗糖，0.02％ 聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白(BSA)，2.5mMNaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mMEDTA)中杂交，然后50℃下在0.2×SSC， 0.01％BSA中冲洗一次或多次。或者，在核酸扩增技术(例如PCR) 中所使用的条件下，核酸和/或寡核苷酸(其还可被称为“引物”或 “探针”或“siRNA分子”或“反义分子”)与目的基因组区域杂交。
b.组合物
本文还提供了包含所述病毒或其免疫原性(抗原)组分的组合物。 所述组合物可以是疫苗。所述疫苗可以能够在哺乳动物中刺激免疫应 答。所述病毒还可减轻哺乳动物中PRRS病毒感染的严重程度及其后 遗症或症状，并且可预防哺乳动物被PRRS病毒感染。所述组合物可 包括载体(其可为可药用的载体)，还可包括免疫学上可接受的佐剂。 所述载体和佐剂可以是兽医用途(例如用于猪)可接受的。所述组合 物还可包括至少一种免疫刺激分子。
(1)佐剂
佐剂可以是能够增强免疫系统对疫苗的应答的分子，并且基本上不 会抑制免疫应答。佐剂的实例记载于“Vaccinedesign:thesubunitand adjuvantapproach,”MichaelF.PowellandMarkJ.Newman,eds., PharmaceuticalBiotechnologyv.6,PlenumPress1995,NewYork，参见 例如chapter7“AcompendiumofVaccineAdjuvantsandExcipients”by FrederickR.VogelandMichaelF.Powell和chapter29, “Cytokine-containingliposomesasadjuvantsforsubunitvaccines”by Lachmanetal.，所述文献的内容以引用的方式纳入本文。
所述佐剂可以是干扰素，所述干扰素可以是干扰素α、干扰素β或 可在猪细胞中表达的编码干扰素β的核酸。所述佐剂还可以是多聚IC、 多聚ICLC，或诱导或增强干扰素α或β中至少一种的活性的物质。所 述干扰素可以是干扰素蛋白，例如干扰素α蛋白，或可以是能够表达干 扰素(例如干扰素α)的核酸。通过外源给予的核酸序列的表达产生的 干扰素可单独发挥功能，或与通过哺乳动物自身的内源核酸序列表达产 生的干扰素结合发挥功能，以增强对给予至所述哺乳动物的疫苗的免疫 应答。所述干扰素可直接或间接促进免疫增强；例如，外源给予的核酸 所表达的干扰素可诱导或激活一种或多种中间物质，其进而可以促进免 疫增强。
所述佐剂可能以足以增强对给予至哺乳动物的疫苗的免疫应答的水 平存在。佐剂所带来的免疫应答增强可被测量为，通过本领域中认可的 任何方法评估的与不存在所述佐剂时的对照应答相比的免疫应答中的任 何显著增加(其可以是统计上显著的)。所述佐剂可包括本领域中已知 的其他成分，以促进可表达的核酸向用于表达的细胞或组织中的递送， 或促进干扰素诱导剂或增强剂向适合的细胞或组织中的递送。所述佐剂 的剂量水平可以通过熟知的方法确定。
所述佐剂可同时包括能够表达干扰素的核酸以及能够诱导或增强干 扰素活性的免疫刺激物质。所述核酸及所述干扰素诱导剂或增强剂的结 合量可足以导致对疫苗的免疫应答的可测量的增强。
所述佐剂可包括编码干扰素α的可表达的核酸、诱导或增强干扰素 β的活性的物质，或者包括两者。诱导或增强干扰素α的活性的物质可 以是多聚IC或多聚ICLC。多聚IC或多聚ICLC的量可以是1-200微克 /千克体重的范围。所述佐剂还可包括免疫刺激序列(ISS)或编码细胞 因子的核酸。所述佐剂还可以是细胞因子、明矾(氢氧化铝)、磷酸铝 或磷酸钙。所述细胞因子可以是IL-2、IL-12或包含细胞因子的脂质体。
所述佐剂还包括含有猪IFNαcDNA的哺乳动物表达载体，可使用从之前用假狂犬病病毒感染(以刺激IFNα产生)的猪淋巴细胞分离的RNA通过RT-PCR制备所述猪IFNαcDNA。可根据猪IFNαcDNA的核苷酸序列(如LefevreandLaBonnardiere1986中所描述，所述文献内容以引用的方式纳入本文)设计用于进行RT-PCR的引物。将获得自RT-PCR的具有预期大小(590bp)的产物克隆到质粒(InvitrogenCorp.,Rockville,MD)中，并且对具有预测的限制性酶切位点的插入片段进行测序。可从所述重组质粒切下IFNαcDNA并将其置于pcDNA3(Invitrogen)中的巨细胞病毒启动子的转录调控之下以产生pINA3。为了验证有活性的细胞因子是由所扩增的cDNA编码的，可用pINA3转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞并制备具有遗传霉素抗性的单细胞克隆。检测所述克隆的上清液抑制水疱性口炎病毒(VSV)的干扰素诱导剂阴性毒株在马达氏牛肾(MadinDerbybovinekidney，MDBK)细胞中的复制的能力。可检测到产生0至大于200000单位(1个单位抑制50％的VSV复制)的IFNα的克隆。
所述佐剂还可包括所述化合物多聚ICLC。所述佐剂还可包括以下 化学品：多聚L-赖氨酸、多聚IC和低粘度的羧甲基纤维素。可在无热 原的0.85％NaCl中制备多聚IC(500ml；4.0mg/ml)；多聚L-赖氨酸 (250ml；6.0mg/ml)；和2％羧甲基纤维素(250ml)。可按照Baer 等人(1975)的Levy法制备多聚ICLC(稳定的多聚核苷酸)，所述文 献内容以引用的方式纳入本文，有少量修改。通过在71℃下加热1小时 并缓慢冷却使多聚I:C重新退火。然后将退火的多聚I:C与等体积的溶 于生理盐水中的6.0mg/ml的多聚L-赖氨酸和2％羧甲基纤维素混合。多 聚I:C的最终浓度为1mg/ml。将该制品贮存于4℃下直到需要时。
(2)免疫刺激物质
所述组合物还可包括诱导或增强干扰素(例如干扰素α)的活性的 免疫刺激物质。所述免疫刺激物质可发挥诱导或增强干扰素的活性的作 用，所述干扰素是由外源给予的可表达的核酸产生或由哺乳动物自身的 内源核酸产生。所述免疫刺激物质可直接发挥诱导或增强干扰素活性的 作用，或通过诱导或增强中间物质的活性或表达而间接发挥作用。所述 免疫刺激物质可发挥诱导或增强干扰素表达水平的作用，或可增强或激 活干扰素以用于增强免疫应答。所述免疫刺激物质可以是干扰素α、白 细胞介素12(IL-12)、IL-18或IL-15。
(3)载体
所述载体可包括盐水或本领域中已知的另一种适合的载体。所述载 体可以为如Arnon,R(Ed.),SyntheticVaccines1:83-92,CRCPress,Inc., BocaRatonFL(1987)中所描述的，所述文献内容以引用的形式纳入本 文。所述载体可使所述组合物被配制成适合于口服摄取的片剂、丸剂、 胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、悬液等。所述载体还可包括其他佐剂， 在这种情况下可基于所使用的抗原、给药方式和受试者通过标准条件来 对其进行选择。所述载体可包括促进将所述组合物加工成可药用制品的 赋形剂或助剂。
(4)剂量
所述组合物可包括一个剂量的所述病毒的病毒颗粒，其可以为102至1010、102至109、102至108、102至107、102至106、102至105、102至104、103至1010、103至109、103至108、103至107、103至106、103至105、104至1010、104至109、104至108、104至107、104至106、105至1010、105至109、105至108或105至107个病毒颗粒。
(5)制剂
所述组合物可包括阳离子脂质体、阴离子脂质体、蜗形体(cochleate) 或微胶囊。所述脂质体或蜗形体可增强所述病毒的体内转染。所述脂质 体可以是具有水性内部的球形脂双层。在脂质体形成时存在于水性溶液 中的所有分子都可被纳入水性内部中。脂质体内含物可被保护以避免接 触外部环境，并且由于脂质体与细胞膜融合而被高效地递送到细胞质中。 此外，由于某些小的有机分子的疏水性，可直接将其给予到细胞内。所 述组合物还可包括另一种药用试剂、药物试剂或稀释剂。
可将所述组合物配制成水溶液、液体溶液或悬液、适用于在注射前 成为液体溶液或悬液的固体形式，或乳剂。为了进行注射，可将所述组 合物配制在水性溶液中，所述水性溶液可以是生理上相容的缓冲液形式， 例如汉克斯溶液(Hanks’solution)、林格氏溶液(Ringer’ssolution) 或生理盐水缓冲液。对于经粘膜(transmucosal)给药，在所述制剂中 使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。在本领域中此类渗透剂通常是已知 的。可用阳离子脂质或脂质体来配制所述组合物。所配制的用于口服给 药的组合物可以是片剂、锭剂、胶囊或溶液形式，并且可以被配制为用 于延迟释放或仅在药物到达小肠或大肠时释放。
用于胃肠外给药的组合物可以被配制成水溶形式的水性溶液。所述 悬液可被制备为油性注射悬液。所述悬液可包括适合的亲脂溶剂或载体， 其可以是脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三 酯，或脂质体。用于水性注射的悬液可包含增加所述悬液粘度的物质， 例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。所述悬液还可包含适合的稳定 剂或增加所述组合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
可通过将活性化合物和固体赋形剂结合来获得用于口服的所述组合 物。获得所述组合物还可包括在添加适合的助剂之后研磨所获得的混合 物，以及加工颗粒混合物以获得片剂或锭剂核心。所述固体赋形剂可以 是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂例如 玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪树胶(gum tragacanth)、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)。所述组合物还可包括崩解剂，其可以是交联聚乙烯 吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐(例如海藻酸钠)。
所述组合物可以是锭剂核心，其可具有适合的包衣。所述包衣可包 括浓缩的糖溶液，以及可包括阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚 羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液，或适合的有机溶剂或溶剂 混合物。片剂或锭剂可包括含有着色剂或染料的包衣，所述着色剂或染 料可用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
所述组合物可被配制成用于口服给药，作为包含明胶的推入式 (push-fit)胶囊形式，或可被配制成包含明胶或增塑剂(例如丙三醇或 山梨糖醇)的密封胶囊。所述推入式胶囊可包括与填充剂(例如乳糖)、 粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)或稳定剂混合的 所述组合物。用于口服给药的所述组合物可被配制成软胶囊，并且所述 组合物可被溶解或悬浮于适合的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体 聚乙二醇。所述软胶囊还可包括稳定剂。
在组合物包括DNA疫苗的情况下，所述组合物可包括被纳入脂质体 或蜗形体中以增强体内转染的DNA。所述组合物可包括遗传佐剂，所述 遗传佐剂可以是免疫刺激序列(ISS)或编码细胞因子的核酸。所述遗传 佐剂可以是如HornerA.A.etal.,1998,ImmunostimulatoryDNAisa potentmucosaladjuvant,CellImmunology,190:77-82中所记载的，所述 文献内容以引用的方式纳入本文。
(6)制备方法
可以通过其自身已知的方式来制备所述组合物，例如通过常规的混 合法、溶解法、粒化法、锭剂制备法、悬浮法(levitating)、乳化法、 包囊法、包埋法(entrapping)或冷冻干燥法。
3.产生免疫应答的方法
本文提供了一种在哺乳动物中产生或诱导免疫应答的方法，所述哺 乳动物可以是猪。所述方法可包括将包括所述病毒的组合物给予需要其 的哺乳动物。所述方法还可包括给予免疫原性组合物，其可以是加强剂 (booster)，以及可包括给予本文所述的佐剂。所述组合物可为所述哺 乳动物提供针对PRRS病毒的保护性免疫。与未被给予所述组合物的哺 乳动物相比，所述组合物还可在所述哺乳动物中导致更多的体重增加和 更少的病毒血症。与未被给予所述组合物的哺乳动物相比，所述组合物 可在所述哺乳动物中诱导免疫，这可以有助于在所述哺乳动物中实现更 少的流产和/或正常产仔，或减轻呼吸疾病的严重程度和死亡率。
a.给药方式
可通过任何有效途径给予所述包含病毒的组合物，所述途径可以是 全身或局部途径。所述给药可以是胃肠外、肌肉内、真皮内、皮下、口 服、粘膜、舌下、眼内、鼻内、静脉内、腹膜内、髓内、局部或经皮肤 给药。所述给药还可以是直肠、阴道或肠道给药。所述给药可以是通过 注射，其可使用针头和注射器来进行。所述给药还可以是通过电穿孔、 阳离子微粒、超声波分散(ultrasonicdistribution)或通过生物射弹颗粒 (biolisticparticle)。
所述给药还可是基于具有阳离子脂质或脂质体的组合物制剂，所述 阳离子脂质或脂质体适用于细胞因子佐剂的DNA形式或蛋白形式，或适 用于化学品(例如能够进行免疫刺激的化学品，例如通过诱导内源细胞 因子)。此类给药的实例记载于Pachuketal.,2000,CurrOpinMolTher Apr2(2):188-98；VanSlootenetal.2001,BiochimBiophysActa1530: 134-45；VanSlootenetal.,2000,PharmRes17:42-48；Lachmanetal., 1996,EurCytokineNetw7:693-8，所述文献内容以引用的方式纳入本文。
所述佐剂可被包含在所述包含病毒的组合物中。还可在给予所述包 含病毒的组合物同时给予所述佐剂，或在给予所述包含病毒的组合物的 1、2、4、8、12、18或24小时之内给予所述佐剂。
b.给药时间
可在所述哺乳动物为约2周龄到约30周龄时或在所述哺乳动物成年 时，将所述组合物给予所述哺乳动物。还可在初次给药后约2周到约5 周时第二次给予所述组合物，还可再给予数次。还可将所述组合物给予 交配的雄性或雌性，可在交配前或产仔后给予所述组合物。
可由各临床医生或鉴于患者的状况来选择用于产生免疫应答的准确 制剂、给药途径和剂量，例如Finglet.al.,inThePharmacologicalBasisof Therapeutics,1975,Ch.1p.1中所描述的，所述文献内容以引用的方式 纳入本文。主治兽医或医生应了解如何及何时因毒性或因器官功能障碍 或其他负作用而终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不充分(排 除毒性)，主治医生也知道将治疗调整到更高的水平。在目的疾病的处 理中给药剂量的大小可随待治疗的病症的严重程度和给药途径而变化。 例如，可通过标准预后评估方法对病症的严重程度进行部分评估。此外， 剂量和可能的剂量频率也可根据各个患者的年龄、体重和反应而变化。 与以上所述的程序相当的程序也可用于兽医学中。
本发明具有多个方面，其可通过以下非限制性实例来举例说明。
实施例
实施例1
PRRS疫苗组分
实施例1.本实施例示出了本文所述的疫苗的具体实例。具体而言， 本实施例描述了三种名为794A61、111698和G16X的分离并纯化、几乎 同基因的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，每种病毒均衍生自天然表 现出可忽略的毒力的原始北美PRRS病毒分离株89-46448-40的原液。 所述起源的89-46448-40病毒原液包含遗传上相关的PRRS病毒变体的 混合种群，使用标准噬菌斑测定或终点稀释从所述混合种群将所述三种 毒株纯化至同质(homogeneity)。对所述三种毒株的基因组序列分析揭 示出，它们与存在于89-46448-40病毒原液中的病毒基因型的差异在于若 干同义和非同义点突变。后一类型的核苷酸突变导致三种结构病毒蛋白 和一种非结构病毒蛋白具有亲代病毒种群中不存在的新的氨基酸改变。 所述三种分离的毒株与亲代病毒89-46448-40的生物学差异还在于，它们 刺激病毒感染的猪肺泡巨噬细胞的相当强的干扰素α应答的能力。此外， 与亲代89-46448-40不同的是，G16X毒株不抑制暴露于多聚(I:C)的 猪肺泡巨噬细胞的干扰素α合成，而是增强它们对此激活分子的应答。 值得注意的是，尽管这三种毒株几乎是同基因的，它们在其疫苗潜能方 面彼此之间差异显著，如随后用遗传上不同的(异源的)PRRS病毒分 离株进行激发后它们在提供保护方面的疫苗效力的程度(差，794A61； 中等，111698；以及良好，G16X)所证明的。一种疫苗分离株(G16X) 本身与其他两种分离株(794A61和111698)的区别在于，它在为经免 疫的猪提供更大保护的能力方面胜出，如从组织中更快减少和/或清除有 毒力的激发病毒时所证明的。
通过噬菌斑纯化(794A61和G16X)或通过终点稀释(111698)从 PRRS病毒89-46448-40的低传代原液获得所述三种PRRSV毒株 (G16X、794A61和111698)。在爱荷华州埃姆斯(Ames)的国家兽医 服务实验室(NVSL)，从作为诊断例(被指定为89-46448)被提交的 动物的样本中分离所述89-46448-40病毒，所述诊断例来自在1989年经 历了PRRS爆发的爱荷华农场(Wesleyetal,1998)。值得注意的是，所 述89-46448诊断例代表最早公开记录的从中回收PRRS病毒的PRRS爆 发之一(Wesleyetal.,1998)。因此，所述89-46448-40病毒可能代表在 美国分离的时间上最古老的PRRS病毒之一。在NVSL的病毒分离是通 过用从被感染的动物制备的浸渍组织的澄清悬液覆盖MA-104非洲绿猴 细胞系的单层细胞完成的。通过所述细胞培养物接种后6-8天之内的细 胞病变效应的发生来指示病毒分离，如Kim等人所描述(1993, “Enhancedreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome (PRRS)virusinahomogeneoussubpopulationofMA-104cellline,”Arch. Virol.133,477-83)。在接种后第10天时收集培养液，并贮存于-70℃。 随后在NVSL使用Kim等人(1993)所描述的方法在MA-104细胞中进 行89-46448-40病毒分离株的传代。在1992年年末至1993年年初，NVSL 将若干PRRS病毒分离株(包括89-46448-40分离株)的等分试样作为 参考PRRS病毒分发给美国的若干兽医诊断实验室(VDL)。伊利诺伊 大学的VDL(Urbana,IL)收到了含有约1ml培养基的小瓶，所述培养 基收集自89-46448-40分离株在MA-104细胞中的第二次传代 (89-46448-40MA104/2)，所述89-46448-40分离株来自从中分离出它 的样品。在伊利诺伊大学VDL，将MARC-145细胞系——源自MA-104 细胞的受纳PRRS病毒的细胞克隆——用作宿主，以从89-46448-40 MA104/2等分试样制备89-46448-40病毒原液。使用本领域中已知的方 法使所述病毒增殖，并且使用在包含Eagle’s最低必需培养基(MEM) 的75cm2组织培养瓶中培养的MARC-145细胞的单层，所述培养基的 pH被调至7.2，并且已向其中添加5％胎牛血清、0.15％碳酸氢钠和抗生 素(完全MEM)。将含有MARC-145细胞和10ml培养基的培养瓶在 37℃下在5％CO2的气氛中孵育数天，直到建立汇合的细胞单层。这时， 用1ml稀释的病毒悬液接种细胞单层，并且在37℃下孵育1h以使病毒 吸附。然后除去所述接种物并添加10ml新鲜的完全MEM。然后在37℃ 下在5％CO2的气氛中孵育所述细胞培养物，直到观察到细胞病变效应 (该效应在4天内发生)。一旦单层细胞中>75％的细胞表现出细胞病变 效应，收集培养瓶的内含物，合并到单个容器中，在无菌玻璃小瓶中分 为1-2ml等分试样并贮存于-80℃下直到需要时。通过使用标准技术和 MARC-145细胞来测定所述病毒原液的效价(参见实施例1，材料和方 法)。例如，在1994年7月制备的原液(“794原液”)的效价为107.4TCID50并对应于在伊利诺伊大学VDL的PRRS病毒分离株89-46448-40 在MARC-145细胞中的第二次传代，即该病毒在所培养的细胞中的第四 次总传代，包括其在MA-104细胞中的分离。
从所述“794原液”PRRS病毒中直接分离所述111698和794A61 病毒毒株。为了产生111698病毒，将1.0ml“794原液”的3000倍稀释 物(MOI＝0.001)用作接种物，以感染75cm2组织培养瓶中的MARC-145 细胞的单层(一式三份)。在37℃下在潮湿的5％CO2的气氛中4天之 后，当三个单层中的每一个的>75％表现出细胞病变效应时，收集培养瓶 的内含物。将合并的收集物在4℃下以2000rpm离心10min以除去细 胞碎片，将指定为111698病毒的上清液分成等分试样并贮存于-80℃。 与此不同，所述794A61病毒是“794原液”的6倍噬菌斑纯化的产物。 首先，用MEM(pH7.2)中的“794”原液的连续10倍稀释物覆盖直径 为35mm的组织培养皿中的MARC-145细胞单层，所述MEM补充了 10％胎牛血清和50μg/ml庆大霉素。在室温下振荡1h后，除去接种物 并用3ml2XMEM的1:1混合物覆盖所述单层，所述MEM补充了6％ 胎牛血清、100μg/ml庆大霉素和2％低熔点琼脂糖。在室温下30min后 (以使琼脂糖变硬)，将平板放置在37℃下湿润的5％CO2的气氛中4 天。此时为了增强噬菌斑的可视性，在每个琼脂糖覆盖层的上方放置100 μl的100mg/ml噻唑蓝溴化四唑(甲基噻唑二苯基-溴化四唑，MTT)， 并在噬菌斑以具有黑暗边界的清晰区域形式出现之前，将细胞放回37℃ 下湿润的5％CO2的气氛环境中2-3h。使用巴斯德移液管挑取以接种物 的最大稀释物成功感染的那些单层中的若干明显分离的噬菌斑，并将其 转移到包含0.5mlMEM的小瓶中，所述MEM补充了10％胎牛血清和 50μg/ml庆大霉素。在将所选择的噬菌斑之一用作接种物之前，在-80℃ 下对其进行两轮冷冻。再重复5次这一噬菌斑纯化过程，将第6轮之后 挑取的噬菌斑指定为794A61。在-80℃下进行两轮冷冻之后，使用0.1ml 所述794A61制品来感染直径为35mm的组织培养平板，如以上所述。 但是，在该情况下，用3ml补充了3％胎牛血清和50μg/ml庆大霉素的 MEM覆盖单层。在37℃下湿润5％CO2的气氛环境中3天之后，约20％ 被感染的单层表现出细胞病变效应。此时，收集培养基，在4℃下以2000 rpm离心10min以除去细胞碎片，将上清液指定为794A61P1病毒并贮 存于-80℃。如上所述，在75cm2组织培养瓶中的MARC-145单层细胞 中对该病毒进行再次传代(MOI＝0.01)以产生794A61P2病毒。
G16X病毒的分离间接从“794原液”病毒开始，其中接种物来源是 “794原液”病毒在75cm2培养瓶中的MARC-145细胞单层中的连续传 代。在这种情况下，用1ml未稀释的“794原液”感染每个单层(MOI ＝1)。在37℃下湿润的5％CO2气氛中3天之后，当三个单层中的每个 的>90％均表现出细胞病变效应时，收集培养瓶的内含物。将合并的收集 物在4℃下以2000rpm离心10min以除去细胞碎片，将上清液指定为 VR病毒，分成等分试样并贮存于-80℃。如上所述，对该VR病毒制品 进行5倍噬菌斑纯化，除了在感染后4-5天之外，将各个噬菌斑被鉴定 为在相对清晰的未感染细胞单层背景下的不透明区域。在以上所述条件 下，在直径为35mm的组织培养皿中对来自所述第5次噬菌斑纯化的分 离的噬菌斑进行传代，其是以不同的MOI在25或75cm2组织培养瓶中 对MARC-145细胞的此次感染和随后四次感染的后代。将来自病毒的第 5次未经选择的传代的上清液培养基作为初始接种物，用于如上所述的 使用MTT进行噬菌斑可视化的第6轮噬菌斑纯化。将第6轮之后所挑 取的明显分离的噬菌斑指定为G16X，如上所述，首先使其在直径为35 mm的组织培养平板中的MARC-145细胞单层中增殖(G16XP1)，然 后在cm2培养瓶中连续增殖两次(G16XP2和G16XP3)以产生所述 794A61病毒。
已有记载表明，PRRS病毒分离株的致病性水平差异相当大。此外， 显而易见的是，在1987-1988年的PRRS的北美首次爆发后的25年中， 美国和世界其他地区的PRRS病毒的毒力水平已上升到令人担忧的程 度。PRRS病毒毒力的第一次显著上升发生在1996年，当时猪的兽医和 诊断医生开始报道疾病爆发，所述疾病爆发被描述为“猪流产与死亡综 合征”、“非典型PRRS”或“急性PRRS”。这在实验研究中被确认， 所述研究表明，不但20世纪80年代后期的PRRS流行开始时在美国猪 群中传播的毒株的毒力小于1996年夏天出现的那些毒株的毒力，而且后 者导致更高严重程度的PRRS爆发。但是，即使是在20世纪90年代早 期，PRRS爆发的不同疾病严重程度也是显而易见的。尽管主要是10周 龄以下的猪患上强度范围从中度到严重的呼吸疾病而未出现繁殖障碍， 但是也观察到在更大的猪中爆发严重呼吸疾病并表现出繁殖障碍，主要 是怀孕母猪的晚期流产。为了试图区分PRRS病毒毒力的不同水平，开 发了呼吸致病性的具体测量方法。其包括对受到明显可见的肺炎影响的 肺部的百分数进行评分，所述明显可见的肺炎是由用被报道表现出不同 毒力水平的PRRS病毒的9种不同分离株之一实验性感染幼猪所引起的。 这种方法使得能够将1993年或更早获得的PRRS病毒分成高和低毒力分 离株。但是，使用这种评分方法获得了不一致的结果，并且不同的疾病 特征被用于评估毒力。在这种情况下，根据被感染的猪肺部的总体病理 学(grosspathology)，两种分离株的毒力水平(之前被分为高(VR-2385) 或低(VR-2431))与对所述病毒诱导晚期生殖障碍的能力的方面进行 评估时所得的毒力水平相似。
一种用来测定PRRS病毒毒力的更可靠和更常用的参数是监测被感 染的猪的血流中传染性病毒的量(病毒血症)。例如，用被归类为表现 出中等或高水平毒力的PRRS病毒分离株接种幼猪可重复地产生高水平 病毒血症，所述病毒血症在病毒接种后3天内发生并可持续28天以上。 相反，给予等价剂量的减毒(疫苗)PRRS病毒毒株——其是通过在猿 猴细胞中连续传代由有毒力的菌株获得——产生显著更低水平的病毒血 症，尽管具有相似的(>28天)持续时间。值得注意的是，由PRRS病 毒感染所引起的病毒血症与猪生长负相关，并且与临床疾病的严重程度 正相关。缺乏食欲也是PRRS病毒感染的一个标志，在年幼的和快速生 长的猪中感染负面影响其体重增加速度和饲养效率。同样，感染中度或 高毒力的PRRS病毒分离株强烈降低生长中的猪的体重增加速度。另一 方面，用减毒的PRRS病毒毒株接种猪会最小程度或完全不减少猪的生 长。因此，尽管有毒力的PRRS病毒显著抑制幼猪的生长速度并产生强 烈的病毒血症，但是通过在细胞培养物中连续传代而使得不具备毒力(减 毒)的PRRS病毒毒株不影响幼猪生长并产生相对较弱的病毒血症。
实施例2
PRRS病毒的分离
实施例2.本实施例说明突变的PRRS病毒的分离。PRRS病毒分离 株89-46448-40天然表现出可忽略的毒力水平，其类似于(如果不低于的 话)所描述的通过体外连续传代产生的PRRS病毒减毒毒株的毒力水平。 通过评估之前被用来测定PRRS病毒毒力的参数，来测定PRRS病毒分 离株89-46448-40所具有的毒力水平，所述参数包括被病毒感染的猪的体 重增加、被病毒感染的猪中病毒血症的程度和时间长短，以及被病毒感 染的猪的肺部的总体病理学。测量全部所述参数所获得的结果支持以下 结论：89-46448-40分离株在猪中的毒力是可忽略不计的。
为了确定89-46448-40病毒分离株所表现出的毒力水平，用 89-46448-40分离株或作为比较用高毒力的“非典型PRRS”病毒分离株 NADC-20接种来自未感染PRRS病毒的猪群的9-10周龄猪的组。对照 组由被给予模拟接种物的猪组成。在病毒接种前和接种后第4、7、10和 14天，从每只猪的颈静脉采集静脉血并通过测量每只动物血清中存在的 传染性病毒的量来定量测定病毒血症的程度。在研究的第0、7和14天 记录所有猪的体重，并计算从激发那天起的体重改变。在接种后第14天 使用已知方法对猪肺部的总体病理学程度进行评分。
使用组织培养瓶(Corning,Corning,NY)在含有L-谷氨酰胺(Mediatec,Herndon,VA)的RPMI-1640培养基中培养猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC(Calzada-Novaetal.,2012)并保持在37℃下5％CO2的气氛中，所述培养基补充了10％胎牛血清(Invitrogen,GrandIsland,NY)、1mM丙酮酸钠(Mediatec)和1×非必需氨基酸(Mediatec)。因为猪肺泡巨噬细胞是所述病毒的天然宿主细胞，ZMAC细胞对野生型PRRS病毒是完全受纳的。因此，使用此细胞系来进行对来自临床(血清)样品的PRRS病毒的滴定，并且制备用于动物接种的病毒原液。所述ZMAC细胞系不含有外来的病原体，包括牛病毒性腹泻病毒、猪环病毒(circovirus)、支原体、PRRS病毒、猪细小病毒和猪腺病毒。
为了产生用于动物接种的病毒原液，将直接来自于患病动物血清的 “急性PRRS”病毒分离株NADC-20在ZMAC细胞中传代一次。已证 明NADC-20在幼猪中产生显著的呼吸疾病，总体肺损伤评分范围为 30-45％，以及导致显著的病毒血症，其程度与针对其他有毒力的PRRS 病毒分离株所观察到的病毒血症程度相似。89-46448-40病毒的接种物是 从ZMAC细胞中的第7次传代制备，所述传代起始于由NVSL所制备的 89-46448-40病毒的初始小瓶(89-46448-40MA104/2)。获得自NVSL 的所述小瓶中的病毒代表来自病例89-46448样品的89-46448-40病毒在 MA-104细胞中的第2次传代。为了进行动物接种，在补充了0.05％的 新生猪血清的磷酸盐缓冲溶液(Mediatech)(稀释剂)中稀释所述病毒 以获得104TCID50/ml的病毒效价。模拟接种物仅由稀释剂组成。然后通 过在ZMAC中进行滴定(TCID50)来验证从89-46448-40或NADC-20 病毒原液制备的那些接种物中传染性病毒的预期效价。
如下测定传染性病毒的效价。在包含0.9ml补充了5％胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640培养基(Mediatech)的管中，将每个病毒接种物连续稀释10倍至最终稀释率为10-5-10-8，这取决于样品的类型。将每个被检测的稀释样品的0.1ml等分试样单独地转移到96孔组织培养板的四个孔中，每个孔包含0.1ml培养基，所述培养基中含有3-4×104ZMAC细胞。在37℃下湿润的5％CO2氛围的环境中96h后，使用倒置显微镜检查每个孔中的细胞中细胞病变效应的存在。当其中>90％的细胞表现出细胞凋亡和/或已裂解时，孔被评分为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方法来测定每个样品的TCID50数。对从感染了病毒或未感染病毒的各个猪中采集的每个血清和支气管肺泡灌洗(BAL)液样品进行相似的病毒感染力滴定。
使用具有数字读数的天平来测量每只猪的体重。在每次使用前和使 用后使用校准重量来对所述天平进行校准。在研究的第1天(临病毒感 染前)和病毒感染后第7和14天对全部猪进行称重。计算各个猪在接种 后第7和14天时相对于病毒暴露当天其各自体重所达到的体重增加。将 结果表示为每个处理组的平均调整体重改变±均值的标准误差(SEM)。
获得支气管肺泡灌洗(BAL)样品。在病毒激发后第14天对动物实 施安乐死，将其肺从胸腔内完整移出。通过使用20cc塑料注射器将无菌 Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(Mediatech)输注到每个肺的右中肺叶，而 从每个肺获得BAL液样品，所述塑料注射器与去掉了针头的管状输注装 置(Butterfly19x7/812”管,AbbottLaboratories,Chicago,IL)连接。 将管插入到通向右中肺叶的支气管中并用线将二者绑在一起以避免渗 漏。然后，将10mlDulbecco’s磷酸盐缓冲溶液缓慢推入所述肺叶。轻 轻按摩被灌洗的肺叶之后，通过缓慢缩回活塞将液体移出。通常可容易 地回收一半(5ml)输注液。然后将BAL液转移至无菌的15ccFalcon 聚丙烯锥形管(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)，收集后在4℃ 下保存不超过4h。然后通过以2000rpm离心10min，使所述BAL液 澄清，将所获得的液体分成1ml等分试样，放入无菌的无RNA酶和DNA 酶&热原的1.7mlPosi-Click管(DenvilleScientific)中，并贮存于-80℃ 直到用于检测病毒载量。
如下进行总体肺损伤评分。接种后14天，对全部动物实施安乐死。 将其肺从胸腔中移出并根据Halbur等人(1995)所描述的评分系统计学 估该器官中总体损伤(grosslesion)的程度。简言之，为每个肺叶指定 一定量的点以反映该肺叶所代表的整个肺的近似体积百分数。例如，给 右前肺叶、右中肺叶、左前肺叶的前部和左前肺叶的尾部指定10点(背 侧5点，腹侧5点)。副叶被分配5点，右肺和左肺尾叶各分配27.5点 (背侧15点，腹侧12.5点)以达到总计100点。根据对每个肺叶中的 显微结构肺损伤的存在情况的检查，评估每个肺叶中肺炎的程度，该百 分数乘以每个指定的肺叶点产生一个数值，当该数值与所确定的所有其 他肺叶的数值加在一起时产生一个得分，其表示遭受显著可见的肺炎的 整个肺部的总体百分数。
将来自无PRRS农场的混合喂养的猪(Yorkshire×Landrace×Duroc) 随机分配到伊利诺伊大学(伊利诺伊州厄巴纳)动物生物控制设施的具 有独立空气调节的两个独立套间(8个隔间/套间)的隔间(3-4只猪/隔 间)。用基于玉米的无药物猪II期饮食(UniversityofIllinoisFeedMill, Champaign,IL)喂养动物。根据生物医学分级措施圈养所述猪，保持 12h光照/黑暗周期并使其任意饮水和进食。在9-10周龄时，用2ml(每 种途径1ml，104TCID50/ml)两种病毒之一(89-46448-40或NADC-20) 或模拟接种物(仅为稀释剂)经鼻内和肌肉内途径感染动物。通过在每 个套间中仅用一种类型的病毒分离株接种猪，使一个隔间中的全部动物 都感染相同类型的病毒分离株，从而避免研究期间猪的交叉感染。模拟 接种的动物被保留在与圈养病毒感染的动物相同的套间但是地理位置不 同的隔间中。遵守严格的生物控制措施以使所述模拟接种猪不会感染 PRRS病毒并避免套间之间的交叉污染。从病毒引入的当天直至之后的 14天的时期内，每天监测动物的活力的改变和呼吸性窘迫的征象。在接 种之前及接种后的第4、7、10和14天使用没有添加剂的MONOJECTTM血液采集管(TycoHealthcareGroup,Mansfield,MA)从颈静脉采集血 液样品。通过离心从凝固血液中分离血清，收获并以在无菌的1.5ml微 量离心管中的小等分试样的形式冷冻保存在-80℃下直至检测。通过如上 所述在ZMAC细胞中测量所制备的血清样品中传染性病毒的量来测定 猪中病毒血症的水平。血清样品的临床观察和分析确认，未发生控制套 间之间PRRS病毒分离株的交叉感染和模拟接种的对照猪感染PRRS病 毒。在临病毒感染前和病毒感染后第7和14天测定每只猪的体重。在病 毒暴露后14天对全部动物实施安乐死，将其肺从胸腔内移出并如上所述 对总体病理学进行评分。
如所述进行统计学分析。应用一般线性模型单变量措施和Fisher’sLSD检验来评估组之间关于病毒血症的程度(log10TCID50/ml)和总体肺部病理学得分(为了分析进行log10变换)的差异。使用Dunnett’st检验(双侧)将从病毒暴露时到之后7和14天猪的体重改变比例与参考(模拟接种)组中测量的相同参数进行比较。使用软件(Cary,NC)进行统计学分析。P值<0.01被认为是统计学上显著的。
结果：PRRS病毒89-46448-40或NADC-20对被感染的猪的体重增 加的影响。用PRRS病毒89-46448-40(n＝6)或NADC-20(n＝10)分 离株感染养殖的猪或模拟感染(n＝10)养殖的猪，测定在感染后第7和 14天时各个动物体重增加的百分数并计算每组成员的平均值(图1)。 在病毒感染后第7天，模拟处理的对照组表现出24.8±1％的平均体重增 加，而对于用89-46448-40病毒接种的组这一改变是18.6±2.2％。 89-46448-40病毒感染的猪所实现的平均生长为对照组动物所实现的平 均生长的3/4，这两组的体重增加平均值没有统计上的差异(p>0.09)。 相反，在相同的时期中，NADC-20病毒感染的组平均体重增加仅为 6.4±2.4％，其与相应的模拟处理的动物所获得的增加(几乎是其4倍) 在统计学上有显著差异(p<0.001)。同样，在病毒接种后的14天间隔 后，89-46448-40病毒感染的猪和模拟感染的猪的平均体重增加为 45±2.5％和52±1.6％，两者之间没有显著差异(p>0.2)，在这种情况下 体重增加分别为45±2.5％和52±1.6％。再一次，NADC-20病毒接种组的 生长与对照动物的生长相比被显著削弱(p<0.001)，因为前者仅实现了 26.5±3.6％的平均增加。
测定用PRRS病毒分离株89-46448-40或NADC-20感染的猪中病毒 血症和肺部的病毒载量。当在临接种前取样时，未在任何动物的血清中 检测到传染性病毒，确认它们的无PRRS病毒状态(图2)。同样，对 于模拟接种组，在其他动物病毒接种后所取的任何样品中都未发现活病 毒，确认未发生对照组的非故意感染。在接种后4天，用NADC-20或 89-46448-40病毒感染的所有动物都有病毒血症。但是，与表现出组平均 值为104.1±0.12TCID50/ml的NADC-20组相比，用89-46448-40感染的猪 组表现出显著更低(p<0.001)的病毒血症水平，其组平均值为102.9±0.19TCID50/ml。在感染后第7天两组的病毒血症水平都达到峰值，NADC-20 病毒感染的猪的血清表现出的平均病毒血症水平为104.6±0.27TCID50/ml， 其比在89-46448-40病毒感染的动物的血清中检测到的103.0±0.14TCID50/ml高>30倍(p<0.001)。到了感染后第10天，两组的病毒血症 水平都开始下降，但是用89-46448-40分离株感染的猪中速率更快，这可 由以下事实说明：89-46448-40病毒接种的组的血清中的平均病毒浓度 (102.0±0.4TCID50/ml)与NADC-20分离株接种的组中检测到的平均病毒 浓度(103.9±0.14TCID50/ml)相比低>70倍(p<0.001)。4天后，这两组 中检测到的平均病毒血症水平仍保持显著差异(p<0.005)。但是，此 时89-46448-40病毒感染的动物中仅有50％有病毒血症，而用NADC-20 病毒接种的动物中90％仍然有病毒血症。在实施安乐死时(病毒暴露后 14天)，暴露于NADC-20病毒的猪中90％的肺中发现了传染性病毒， 得到的组几何平均值为103.3TCID50/ml。相比之下，对于用89-46448-40 病毒接种的组，这个值仅为101.1TCID50/ml，仅一半成员在其肺中具有 可检测的传染性病毒。
在用PRRS病毒89-46448-40或NADC-20病毒接种后第14天，为 了对肺炎程度进行定量，对研究中所有动物的肺部总体损伤进行评分。 就个体而言，评估的模拟接种或89-46448-40病毒接种组的所有猪，其总 体肺部损伤得分都<25％。相比之下，NADC-20病毒感染组的10个成员 中的6个被评估为具有≥25％的总体肺部损伤得分，包括两只猪的得分为 >75％。如预期的那样，模拟接种对照组的动物大多数具有正常的肺，个 体得分范围为0至15％，取平均值至平均组得分为3.5±2％(图3)。当 计算89-46448-40病毒接种组的猪时，平均值升高至12.3±3.3％。就个体 而言，其肺部得分从低至0.7％到高至24％。当评估NADC-20病毒接种 的猪的肺部时，这些个体得分要高得多。在此，个体总体肺部损伤得分 范围从7至78％，导致组平均得分为36.5±7.7％。由于每个处理组内部 的个体猪的得分差异>10倍，因此将该数据转化为log10数值用于进行统 计学分析。之后，确定模拟处理组和89-48448-40病毒接种组的平均总体 肺部损伤得分之间没有统计学上的差异。但是，当在模拟处理组和 NADC-20病毒接种组之间进行该比较时，观察到显著的差异(p<0.001)。
本实施例中的数据说明，89-46448-40PRRS病毒分离株天然表现出 可忽略不计的毒力水平。例如，用89-46448-40分离株接种的猪保持与模 拟处理组的猪相等的生长速度。此外，由用89-46448-40病毒分离株接种 猪所引起的病毒血症的程度显著低于接受有毒力的PRRS病毒分离株 NADC-20的同龄组(cohort)中所观察到的病毒血症的程度。此外，用 89-46448-40病毒分离株感染幼猪后，病毒血症的时间长短和肺中病毒的 存在时间比所报道的用PRRS病毒的其他野生型或减毒毒株感染同龄动 物后的持续时间更短。最后，当考虑模拟感染组和89-46448-40病毒接种 组时，由平均总体肺部损伤得分所指示的肺炎程度没有统计学上的差异。 总之，PRRS病毒分离株89-46448-40所天然表现出的可忽略的毒力水平 类似于(如果不低于)使用通过体外连续传代产生的PRRS病毒减毒毒 株时所观察到的毒力水平。
实施例3
亲代89-46448-40病毒与G16X、794A61和111698PRRS病毒毒株 之间的基因组和生物学差异
实施例3.本实施例说明PRRS病毒分离株89-46448-40的原始原液 包括遗传上相关的病毒的离散混合物。使用标准噬菌斑测定(794A61和 G16X)或终点稀释(111698)从89-46448-40病毒原液获得三种PRRS 病毒毒株并将其纯化至具有同质。纯化的794A61、111698和G16X病毒 毒株的基因组与存在于初始的89-46448-40病毒原液中的病毒种群的差 异在于，若干非同义和同义核苷酸点突变。后者导致分别在794A61、 G16X和111698病毒毒株的结构和非结构病毒蛋白中分布的2、3或5 个氨基酸改变，不认为89-46448-40亲代病毒原液的翻译基因组中具有所 述氨基酸改变。使所述三种衍生毒株与亲代89-46448-40原液中的病毒区 分开的具有预测的氨基酸序列改变的病毒蛋白包括非结构蛋白(Nsp)2、 结构蛋白E和糖蛋白(GP)3和GP4。参见图4A-4D。所述794A61、 G16X和111698病毒毒株与亲代89-46448-40病毒分离株还具有生物学 上的差异，如其刺激猪肺泡巨噬细胞的相当高的干扰素α应答的能力所 证明的。此外，不同于89-46448-40病毒分离株，G16X毒株不抑制猪肺 泡巨噬细胞产生干扰素α，而是响应于多聚(I:C)对猪肺泡巨噬细胞的 刺激而增强干扰素α合成。
表1PRRS病毒毒株794A61、111698和G16X之中与祖先病毒 89-46448-40相关的氨基酸。
如表1所示，所述病毒在包括NSP2、E、GP3和/或GP4在内的 蛋白中具有一个或多个突变，所述突变包括以下中的一个或多个：对 于NSP2，495Leu、338His；对于E，31Val、60Ala；对于GP3， 94Val、213Phe；对于GP4，32Ser。
在包含完全MEM的75cm2组织培养瓶中制备猿猴细胞系MARC-145的单层，所述完全MEM由pH被调至7.2，并补充有5％胎牛血清、0.15％碳酸氢钠和抗生素的Eagle’s最低必需培养基(MEM)组成。在37℃下在5％CO2的气氛中孵育包含MARC-145细胞和10ml培养基的培养瓶。使用超低粘附的75cm2组织培养瓶(Corning)在RPMI-1640培养基中培养猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC(ATCC编号PTA-8764)并保持在37℃下和5％CO2的气氛中，所述RPMI-1640培养基含有L-谷氨酰胺(Mediatec,Herndon,VA,USA)并补充了10％胎牛血清(Invitrogen,GrandIsland,NY,USA)、1mM丙酮酸钠(Mediatec)和1×非必需氨基酸(Mediatec)。所述ZMAC细胞系不含有外来的病原体，包括牛病毒性腹泻病毒、猪环病毒、支原体、PRRS病毒、猪细小病毒和猪腺病毒。
本研究中所使用的全部PRRS病毒分离株在MARC-145细胞单 层中增殖，如Kim等人(1993)所描述。为了这一目的，用1ml病 毒悬液接种MARC-145细胞de汇合的单层并在37℃下孵育1h以使 病毒吸附。然后移除所述病毒接种物并添加10ml新鲜的完全MEM。 然后在37℃下在5％CO2的气氛中孵育细胞培养物，直到观察到细胞 病变效应(4天)。一旦单层中>75％的细胞表现出细胞病变效应， 收集培养瓶的内含物并纯化或将其分成若干1-2ml等分试样，装于 无菌玻璃或塑料小瓶中并贮存于-80℃直到需要时。用于生物测定的 病毒的纯化从以下步骤开始：首先通过在4℃下以2000rpm离心10 min使细胞培养基澄清。然后将上清液覆盖在SW28转子管(Beckman, PaloAlto,CA)中包含15％蔗糖的3mlTE缓冲液(10mMTris，pH 8.0，1mMEDTA)的上方。然后在4℃下以20000rpm离心3h。然 后将包含病毒的片状沉淀重新悬浮于1mlTE缓冲液中，通过0.2μM 注射器式滤器(Nalgene,Rochester,NY)并以等分试样贮存于-80℃ 直到需要时。
本研究中使用的病毒的来源已在上文中描述。其基因组被用于核 苷酸测序分析的病毒是：由NVSL提供给伊利诺伊大学VDL的原始 89-46448-40分离株(89-46448-40MA104/2)；“794原液”的6倍 噬菌斑纯化的初次传代，所述“794原液”是在伊利诺伊大学进行的 89-46448-40MA104/2在MARC-145细胞中的第二次传代(794A61 P1)；“794原液”在MARC-145细胞中的终点稀释(MOI＝0.001) 传代；以及获得自病毒的两轮噬菌斑纯化的噬菌斑的第二次传代，所 述病毒是从“794原液”在MARC-145细胞中在高MOI(MOI＝1.0) 下的初次随后传代中获得(G16XP2)。用于评估PRRS病毒对猪肺 泡巨噬细胞产生干扰素α的影响的病毒制品是：i)89-46448-40 MA104/2在MARC-145细胞中的第三次传代(89-46448-40P3)；ii) 794A61最终噬菌斑在MARC-145细胞中的第三次传代(794A61P3)； iii)111698病毒在MARC-145细胞中的第三次传代(111698P3)；iv) G16X最终噬菌斑在MARC-145细胞中的第五次传代(G16XP5)； v)野生型NADC-20病毒制品的第二次传代，即是直接从被感染的猪 的血清初次传代到ZMAC细胞中并在MARC-145细胞中传代一次 (NADC-20P2)；以及vi)FL-12病毒的第三次传代，即由该病毒的 传染性克隆转染ZMAC细胞而获得病毒品开始，然后在MARC-145 细胞中传代两次(FL-12P3)。
如下进行传染性病毒效价的测定。在包含0.9ml完全MEM的管 中将病毒制品连续稀释10倍。将每个被检测的稀释样品的0.1ml等 分试样单独地转移到96孔组织培养板的四个孔中，所述孔包含覆盖 在几乎汇合的MARC-145细胞单层上的0.1ml培养基。在37℃下和 湿润的5％CO2气氛环境中培养5天后，使用倒置显微镜检查每个孔 中细胞的细胞病变效应的存在。当其中>90％的细胞表现出细胞凋亡 和/或已裂解时，将孔评分为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方 法来测定每个样品的TCID50数。
为了分离PRRS病毒基因组RNA，使用QIAamp病毒RNAmini 试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)，根据制造商以下所述的使用说 明，从PRRS病毒原液89-46448-40MA104/2、G16XP2、794A61P1 和111698(如上文所述)的样品中提取RNA。在1.5mlEppendorf 管中使140μl的每种样品与560μl包含5.6μl载体RNA的缓冲液 AVL结合，加脉冲涡旋15秒并在室温下孵育10min。向每个管中加 入560μl100％乙醇，对内容物进行脉冲涡旋15秒并以6000×g离心 10秒。将630μl的每种混合物加到QIAampMini旋转柱的上表面， 并以8000×g离心1min。弃掉洗脱液，对每种混合物的剩余部分重 复所述过程。然后依次用500μl缓冲液AW1(8000×g，1min)和500 μl缓冲液AW2(20000×g，3min)冲洗每个柱。之后，将干燥的柱 子以20000×g离心1min，然后向每个柱中加入60μl缓冲液AVE。 在室温下孵育1min之后，在以6000×g离心1min过程中将RNA洗 脱到1.5mlEppendorf管中。将洗脱的RNA贮存于-80℃直到需要时。
如下法进行PRRS病毒基因组RNA的反转录(RT)和聚合酶链 式反应(PCR)扩增。在每μl反应物中存在50μM随机六聚物 (Invitrogen,Carlsbad,CA)、50mMTris(pH8.3)、75mMKCl、 3mMMgCl2、10mMDTT、各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP和 dTTP，以及25个单位的小鼠鼠白血病病毒逆转录酶(Promega, Madison,WI)的情况下进行PRRS病毒89-46448-40MA104/2和 794A61P1RNA的反转录。用于PRRS病毒G16XP2和111698基因 组的RT的反应混合物的组成相同，除了用0.5μMRTREV引物 (CAACTGCAGAGCTCATATGCAT)(SEQIDNO:30)或其序列 与所述病毒基因组RNA互补的其他引物替代所述随机六聚物引物之 外。在0.5mlEppendorf管或0.2mlPCR管中的RNA和引物在70℃ 变性10min并在4℃冷却2min之后，加入其他组分。对全部混合物 进行一个循环的25℃10min、一个循环的45℃50min和一个循环的 70℃15min(随机六聚物引物)，或者进行一个循环的42℃60min 和一个循环的70℃15min。将所获得的cDNA贮存于-80℃直到需要 时。
在12.5或25μl反应混合物中进行PRRSVcDNA的PCR扩增以 获得用于核苷酸测序的扩增子。它们的组成是相同的，并且是由1μl cDNA(按照上述方法制备)和0.25单位的IPROOFTM高保真DNA 聚合酶(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)/12.5μl反应混合物、 1×IPROOFTMHF缓冲液，以及各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP 和dTTP组成。在加入PRRS病毒特异性正向和反向引物至终浓度为 0.45mM之前，将0.2mlPCR管中的PCR反应混合物保持在70℃热 循环仪中或保持在4℃冰上。在后一种情况下，然后立即将样品转移 到预加热至70℃的热循环仪中。对于扩增，使样品进行一个循环的 98℃下变性30秒，37个循环的98℃下变性10秒、56℃至58℃下引 物退火30秒和72℃下产物延伸1-3min，以及一个循环的72℃下5 min。将所获得的扩增子贮存于-20℃直到在0.7％琼脂糖凝胶中电泳。 使用长波紫外光(366nm)使代表具有预期大小的扩增子的溴化乙锭 染色的条带可视化，将该条带切下，使用Zymoclean凝胶DNA回收 试剂盒(ZYMOResearch,Orange,CA)进行纯化并从Zymo旋转I 柱中将每个样品洗脱到10μl无RNA酶的水中。
在用于核苷酸序列分析的制备中，将2.8μl每种纯化的扩增子的等分试样与5.2μl12.5％的甘油、2.0μl5X测序缓冲液(400mMTris,pH9.0,10mMMgCl2)和1.0μlTerminatorv3.0orv3.1循环测序RR-24(AppliedBiosystems,Austin,TX)合并到0.2mlPCR管中并保持在4℃。加入各个测序引物至终浓度为1.5mM之后，将每个管转移到预加热至70℃的热循环仪中。然后对反应物进行以下反应：一个循环的95℃下1min，以及35个循环的95℃下15秒、50℃下5秒和60℃下4min。所完成的反应物是通过伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校(UIUC)核心DNA测序设备处理，对所获得的色谱图进行肉眼检查并用SeqEd程序(AppliedBiosystems)进行编辑。
为了评估猪肺泡巨噬细胞对PRRS病毒的干扰素α应答，在包含0.5mlRPMI-1640的12×75mm聚苯乙烯圆底管(BDFalcon,Bedford,MA)中制备猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC的培养物(每管2.5×105细胞)，所述RPMI-1640含有L-谷氨酰胺和HEPES(Mediatec,Herndon,VA)并补充了10％胎牛血清(Invitrogen,GrandIsland,NY)、1mM丙酮酸钠(Mediatec)和1×非必需氨基酸(Mediatech)。将每种培养物与缺乏(模拟处理)或包含以下PRRS病毒毒株中的一种的0.1ml培养基混合：89-46448-40、G16X、111698、794A61、FL-12或NADC-20，确定所述毒株的浓度可提供0.04至5的感染复数(MOI)。将所述培养物放置在37℃下5％CO2气氛中，8小时后收集，在4℃下以2000rpm离心10min。除去得到的无细胞上清培养基，并通过使用特异性ELISA检测干扰素α的存在。
为了评估PRRS病毒对于巨噬细胞的针对多聚肌苷酸：多聚胞苷 酸[多聚(I:C)]的干扰素α应答的影响，将包含0.5ml补充的 RPMI-1640培养基的圆底管中的2.5×105ZMAC细胞的各个培养物与 缺乏(模拟处理)或包含以下PRRS病毒毒株中的一种的培养基混合： 89-46448-40、G16X、111698、794A61、FL-12或NADC-20，确定所 述毒株的浓度可提供的MOI为5。在37℃下5％CO2的气氛中孵育2 h后，将细胞培养物暴露于10μg/ml多聚(I:C)(Amersham PharmaciaBiotech,Inc.Piscataway,NJ)并将其重新放回37℃下5％ CO2的气氛环境中。再过8h后，收集培养物，在4℃以2000rpm离 心10min。移出得到的无细胞上清培养基，并通过使用特异性ELISA 检测干扰素α的存在。
结果表示为在仅用多聚(I:C)刺激的ZMAC细胞培养物中检测 到的IFNα量的百分数，给定所述IFNα的量为100％的值。在多聚 (I:C)处理的ZMAC细胞培养物的上清液中检测到的IFNα量在该 细胞浓度下为11-35ng/ml。图6中所示数据代表至少三个独立实验 的平均值(±SEM)。
如下进行通过使用特异性ELISA的猪干扰素α的定量。在4℃ 下用50μl溶于0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的5μg/ml抗猪干扰 素αmAbF17(PBLInterferonSource,Piscataway,NJ,USA)包被 NuncImmulonII96孔板的各个孔，持续16h，用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS–T)冲洗3次，然后在25℃下用200μl乳封闭液(BioFix, OwingsMills,MD,USA)孵育1h。用PBS–T冲洗三次之后，将在 RPMI完全培养基中稀释的50μl细胞培养物上清液或重组猪干扰素 α标准品(PBLInterferonSource)加入到两个孔中并在25℃下放置 1.5h。用PBS–T冲洗5次后，在25℃下用50μl包含0.3μg/ml生物 素标记的抗猪干扰素αmAbK9(PBLInterferonSource)和0.5％乳 封闭液的PBS–T孵育每个孔，持续1.5h。用PBS–T冲洗5次之后， 在25℃下用50μl包含20ng/ml与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素 (BIOSOURCETM，Invitrogen)的PBS–T孵育每个孔，持续20min， 然后再用PBS–T冲洗5次。在25℃下向每个孔添加100μlTMB底 物(KPL,Gaithersburg,MD,USA)开始显色，并用100μl1M磷酸 终止反应。用SPECTRAMAXPlus酶标仪(platereader)(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在450nm下测定光密度。计算结果的平均 值并通过与标准曲线进行比较来确定干扰素α的量，所述标准曲线是 由使用已知量的该细胞因子而获得的值产生的。
结果。测定了PRRS病毒89-46448-40与三种衍生毒株794A61、 111698和G16X的蛋白之间的氨基酸差异。包含三种PRRS病毒毒 株(794A61、111698和G16X；表3-5)的99％以上的全部基因组的 核苷酸序列——其对应于导致衍生自89-46448-40病毒分离株的这三 种PRRS病毒毒株(还参见表1-2和图4A-4D)中每一种的表达蛋白 的病毒基因组翻译部分——的对比揭示出各核苷酸序列之间24个单 核苷酸差异。此外，794A61病毒在Nsp2基因中具有独特的111个核 苷酸缺失(第674-710位氨基酸)。在影响氨基酸序列的13个单核 苷酸置换中，7个导致89-46448-40病毒原液基因组中不存在的氨基 酸改变。使这三种病毒与其祖先89-46448-40分离株区分开的7个氨 基酸分布于Nsp2、蛋白E、GP3和GP4的部分(在图4A-4D中以粗 体字母指出)中。此外，对于亲代89-46448-40病毒原液，分析表明， 根据在基因组序列色谱图中三个相关位置出现双峰，预测Nsp2的第 67和490位氨基酸，以及GP3的第96位氨基酸(在图4A和4C中 以加框字母指出)可能是多态性的。因此，在NVSL制备的初始的 89-46448-40原液(89-46448-40MA104/2)似乎由异源的但密切相关 的病毒种群组成。在这点上，已知PRRS病毒作为相关病毒基因型的 准种分布存在。因此，89-46448-40MA104/2病毒原液内这种有限的 多样性与在未纯化的PRRS病毒原液中通常所观察到的情况一致。相 比之下，在794A61、111698和G16X病毒的基因组测序过程中未观 察到具有这类与核苷酸同一性相关的模糊性(ambiguity)，因此表 明它们基因组的同质性。对所述三种纯化的病毒毒株的基因组同质性 的其他证明是，在89-46448-40病毒原液中观察到的每个多态性位点 处两个可替代的氨基酸(图4中的加框字母)中仅有一个被预测存在 于它们各自基于病毒基因组序列的蛋白中(在图4中以斜体字母表 示)，所述病毒基因组序列在各病毒基因组序列色谱图中的相对位置 表现出单一清晰的峰。要重点注意的是，7个氨基酸改变中的一些是 所述衍生病毒之一独有的。例如，111698毒株分别在Nsp2、GP3和 GP4的第338、213和32位具有独特的氨基酸。此外，G16X毒株在 蛋白E的第31和60位氨基酸是独特的(图4B)。值得注意的是， 对于全部三种PRRSV毒株794A61、111698和G16X，GP3中第94 位氨基酸的突变是共同的。
不希望局限于任何具体的理论，认为蛋白E中第60位编码丙氨 酸而非苏氨酸的突变单独地或与蛋白E中第31位异亮氨酸到缬氨酸 的改变结合导致或促成G16X分离株的有利的免疫表型，所述结合进 一步促成了这一表型。应当了解，图4A-4D中所示的其他改变的氨 基酸也促成了G16X分离株的所述表型。
测定PRRS病毒89-46448-40和三种衍生毒株对猪肺泡巨噬细胞 产生干扰素α的影响。之前的研究表明，当暴露于PRRS病毒时，猪 肺泡巨噬细胞产生非常低到可忽略的量的干扰素α，不同的PRRS病 毒野外分离株所引发的应答之间有一些微小变化。为了确定亲代 89-46448-40分离株与其三种衍生毒株之间的差异，研究了猪肺泡巨 噬细胞细胞系ZMAC对其暴露于所述四种相关病毒的任一种的干扰 素α应答。为了进行对比，还研究了由两种野生型PRRS病毒分离株 NADC-20和FL-12刺激的干扰素α应答。ZMAC细胞暴露于 89-46448-40、FL-12或NADC-20病毒分离株导致少量干扰素α应答， 其程度类似于由其他野生型PRRS病毒分离株刺激的来自猪肺泡巨 噬细胞的应答。相比之下，肺泡巨噬细胞暴露于所检测的最高感染复 数(MOI)(MOI＝5)的G16X毒株时所引发的应答量级是相同MOI 的其祖先分离株(89-46448-40)所引发的应答的二倍(图5)。值得 注意的是，111698或794A61病毒对ZMAC细胞的感染引发了大量 干扰素α分泌，分别是对它们的祖先89-46448-40分离株的应答所释 放的量的34或40倍。当所述细胞在暴露于多聚(I:C)之前暴露于 PRRS病毒时，获得了G16X毒株与89-46448-40病毒分离株具有生 物学差异的其他证据，所述多聚(I:C)强烈刺激猪肺泡巨噬细胞产 生干扰素α(Lovingetal.,2006)。ZMAC细胞仅暴露于多聚(I:C) 导致产生10-30ng/ml的干扰素α。在用多聚(I:C)刺激ZMAC细胞 之前使其暴露于89-46448-40、NADC-20或FL-12病毒2h，强烈抑 制了(>25％)ZMAC细胞对多聚(I:C)的干扰素α应答。相比之下， 在G16X病毒存在的情况下，响应于多聚(I:C)刺激的ZMAC细胞 的干扰素α分泌不但没有被抑制，还增强了约30％(图6)。
总之，所述数据表明，来源于NVSL的89-46448-40病毒分离株 的原液(89-46448-40MA104/2)是由具有相关基因型的病毒混合物 组成。本实施例还表明，所述三种纯化的PRRS病毒毒株794A61、 111698和G16X与亲代89-46448-40病毒种群的差异在于若干同义和 非同义核苷酸点突变。后一种类型的突变分别导致产生分布于Nsp2 和结构蛋白E、GP3和GP4之中的2、3或5个氨基酸改变，所述氨 基酸改变使它们与亲代病毒相区分。如通过它们刺激猪肺泡巨噬细胞 产生干扰素α的独特能力所证明的，这三种毒株还与祖先89-46448-40 病毒具有生物学差异。
实施例4
PRRS病毒疫苗
实施例4.本实施例说明了在饲养猪的实验性PRRS呼吸激发模 型中PRRS病毒毒株794A61、111698和G16X的疫苗效力的差异。 疫苗效力考虑了可指示免患临床疾病的保护作用的因素，包括猪生长 速度、猪病毒血症的程度和持续时间，以及病毒在猪肺部的存在情况。 在表2中总结所述结果。根据这些参数，将这三种几乎同基因的PRRS 病毒毒株针对相同的异源激发病毒的保护性效力被评价为差 (794A61)、中等(111698)或良好(G16X)。
表2疫苗激发研究的结果
关键：+++表示强烈效应；++表示良好效应；+表示中度效应；-表示 无效应。(1)，(2)，(3)：当比较所指示的接种组与未接种激 发对照组时的统计显著性水平。(1)p≤0.001；(2)p<0.005；(3) p>0.4(不显著)。
材料和方法。在包含完全MEM的75cm2组织培养瓶中制备猿猴细胞系MARC-145的单层，所述完全MEM是由pH调至7.2并补充了5％胎牛血清、0.15％碳酸氢钠和抗生素的Eagle’s最低必需培养基(MEM)组成。在37℃下5％CO2的气氛中孵育包含MARC-145细胞和10ml培养基的培养瓶。使用超低粘附的组织培养瓶(Corning,Corning,NY)在RPMI-1640培养基中培养猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC(ATCC编号PTA-8764)并保持在37℃下5％CO2的气氛中，所述RPMI-1640培养基含有L-谷氨酰胺(Mediatec,Herndon,VA)并补充了10％胎牛血清(Invitrogen,GrandIsland,NY)、1mM丙酮酸钠(Mediatec)和1×非必需氨基酸(Mediatec)。
如本领域中所述，使在本研究中被用作潜在疫苗的三种PRRS 病毒分离株(794A61、111698和G16X)在MARC-145细胞单层中 增殖。用1ml病毒悬液接种MARC-145细胞的汇合单层，并在37℃ 下孵育1h以使病毒吸附。然后除去所述病毒接种物并添加10ml新 鲜的完全MEM。然后在37℃下5％CO2的气氛中孵育所述细胞培养 物，直到观察到细胞病变效应(在4天内)。一旦所述单层中>75％ 的细胞表现出细胞病变效应，收集培养瓶中的内含物，纯化或分为 1-2ml等分试样，装到无菌玻璃或塑料小瓶中，并贮存于-80℃直到 需要时。为了产生用于动物接种的病毒原液，使直接来自患病动物血 清的被用作激发病毒的“急性PRRS”病毒分离株NADC-20在ZMAC 细胞中传代一次。已证明NADC-20病毒在幼猪中产生显著的呼吸疾 病，总体肺损伤得分范围为30-45％并产生与在其他有毒力的PRRS 病毒分离株中观察到的程度相似的显著的病毒血症。为了进行动物接 种，在补充了0.05％新生牛血清的磷酸盐缓冲溶液(Mediatech)(稀 释剂)中稀释所述病毒以获得104TCID50/ml的病毒效价。模拟接种 物仅由稀释剂组成。
用于本研究的所述三种疫苗病毒的来源已在上文中详述。用于接 种的这些病毒的原液是：“794原液”的6倍噬菌斑纯化的分离株的 第二次传代，所述“794原液”是89-46448-40MA104/2(由NVSL 提供给伊利诺伊大学VDL的原始89-46448-40分离株)在MARC-145 细胞中的第二次传代(794A61P2)；“794”原液在MARC-145细 胞中的终点稀释(MOI＝0.001)传代(111698)；以及获得自病毒的 两轮噬菌斑纯化的噬菌斑的第三次传代，所述病毒是从“794原液” 以高MOI(MOI＝1.0)在MARC-145细胞中的初次随后传代中获得 (G16XP3)。
接种前，在补充了0.05％新生猪血清的Dulbecco’s磷酸盐缓冲溶 液(Mediatech,Manassas,VA)中稀释疫苗和激发病毒原液，以获得 分别为104.1或104.7TCID50/ml的传染性剂量。在使用当天通过在 MARC-145细胞(三种疫苗)或ZMAC细胞(NADC-20激发病毒) 中进行滴定来验证每种接种物的预期效价，如以下所述。
为了对用于接种的制品中传染性病毒的量(传染性病毒效价)进 行定量，在包含0.9ml完全MEM的管中将所述病毒原液连续稀释 10倍。将被检测的每种稀释样品的0.1ml等分试样分别转移到96孔 组织培养板的四个孔中，所述孔包含覆盖在几乎汇合的MARC-145 细胞单层的0.1ml培养基。在37℃下湿润的5％CO2的气氛环境中 培养5天后，使用倒置显微镜检查每个孔中的细胞的细胞病变效应的 存在。当其中>90％的细胞表现出细胞凋亡和/或已裂解时，将孔评分 为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方法(ReedandMuench,1938) 来测定每个样品的TCID50数。
为了测定激发病毒制品中传染性病毒的量，在包含0.9ml的RPMI-1640培养基(Mediatech)(补充了5％胎牛血清(Gibco))的管中将NADC-20原液连续稀释10倍。将被检测的每种稀释样品的0.1ml等分试样分别转移到96孔组织培养板的四个孔中，所述孔包含0.1ml培养基且具有3-4×104ZMAC个细胞/孔。在37℃下湿润的5％CO2的气氛环境中孵育96h后，使用倒置显微镜检查每个孔中的细胞的细胞病变效应的存在。当其中>90％的细胞表现出细胞凋亡和/或已裂解时，将孔评分为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方法来测定每个样品的TCID50数。对从感染了病毒或未感染病毒的各个猪中采集的每个血清和支气管肺泡灌洗(BAL)液样品进行使用ZMAC细胞的病毒感染力的类似滴定。
使用具有数字读数的天平来测量每只猪的体重。在每次使用前和使 用后使用校准重量来对所述天平进行校准。在病毒激发的当天(临接种 前)和激发后第7天对全部猪进行称重。计算每只猪在激发后第7天的 体重相对于其各自在NADC-20病毒接种当天体重的体重增加。将结果 表示为每个处理组的平均校准体重改变±均值的标准误差(SEM)。
在NADC-20病毒激发后第7天对动物实施安乐死，并将其肺从胸腔 内完整移出。通过使用与去掉了针头的管道输注装置(Butterfly19x7/8 12”tubing,AbbottLaboratories,Chicago,IL)连接的20cc塑料注射器 将Dulbecco’s磷酸盐缓冲溶液(Mediatech)注入右中肺叶来从每个肺中 获得支气管肺泡(BAL)液样品。将管插入到通向右中肺叶的支气管中 并用线将二者绑在一起以避免渗漏。然后，将10mlDulbecco’s磷酸盐 缓冲溶液轻轻推入肺叶。在轻轻按摩被灌洗的肺叶之后，通过缓慢缩回 活塞将液体移出。通常可容易地回收一半(5ml)输注液。然后将BAL 液转移至无菌的15ccFalcon聚丙烯锥形管(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)并保存在4℃，收集后在4℃下保存不超过4h。然后通过在 2000rpm离心10min，使所述BAL液澄清，将所获得的液体分成1ml 等分试样。装在无菌的无RNA酶和DNA酶&热原的1.7mlPosi-Click 管(DenvilleScientific)中并贮存于-80℃直到用于检测病毒载量。
检测病毒血症，并使用下文中所述引物使用定量RT-PCR来测 量。使用QIAamp病毒RNAmini试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)， 根据制造商的使用说明和下文所述，从血清样品中提取RNA，所述 血清样品获得自用NADC-20病毒激发后第7天时接种PRRS病毒的 猪和未接种的猪。在1.5mlEppendorf管中使140μl每种样品与560 μl包含5.6μl载体RNA的缓冲液AVL合并，脉冲涡旋15秒并在室 温下孵育10min。向每个管中加入560μl100％乙醇，将内容物脉冲 涡旋15秒并以6000×g离心10秒。将630μl每种混合物加到QIAamp Mini旋转柱的上表面，并以8000×g离心1min。弃掉洗脱液，对每 种混合物的剩余部分重复所述过程。然后用500μl缓冲液AW1 (8000×g，1min)和500μl缓冲液AW2(20000×g，3min)依次冲 洗每个柱。之后，将干燥的柱以20000×g离心1min，然后向每个柱 加入60μl缓冲液AVE。在室温下孵育1min之后，在以6000×g离 心1min的过程中将RNA洗脱到1.5mlEppendorf管中。将洗脱的 RNA贮存于-80℃直到需要时。
在0.5μM反向互补引物(CACACGGTCGCCCTAATTG)(SEQ IDNO:27)、50mMTris(pH8.3)、75mMKCl、3mMMgCl2、 10mMDTT、各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以及25 个单位的小鼠鼠白血病病毒逆转录酶(Promega,Madison,WI)/μl 反应物的存在下，对血清RNA样品进行反转录。在0.5mlEppendorf 管或0.2mlPCR管中的RNA和引物在70℃下变性10min并在4℃ 下冷却2min之后，加入其他组分。对全部混合物进行一个循环的 25℃下10min、一个循环的45℃下50min和一个循环的70℃下15 min(随机六聚物引物)，或者进行一个循环的42℃下60min和一 个循环的70℃下15min。将所获得的cDNA贮存于-80℃直到需要时。
使用TaqManUniversalPCRMasterMix、ABISDS7000仪器 (AppliedBiosystems,FosterCity,CA)、正向引物 TGGTGAATGGCACTGATTGAC(SEQIDNO:28)、以上所述的 反向引物和TaqMan探针6-FAM-TGTGCCTCTAAGTCACC(SEQ IDNO:29)(其中FAM是6-羧基荧光素)，在反应混合物中进行用 于扩增/检测PRRSV基因组的实时PCR。使用PrimerExpress(2.0 版本)软件(AppliedBiosystems)设计引物和探针，并分别从 IntegratedDNATechnologies,Inc.(IDT,Coralville,IA)和Applied Biosystems购买。通过比较所获得的阈值循环(CT)值与使用已知 量的RNA转录产物产生的标准曲线来测定PRRS病毒RNA拷贝数， 所述已知量的RNA转录产物对应于PRRS病毒毒株G16X基因组的 约9％的3′末端区域。
从伊利诺伊大学兽医学院猪研究农场(伊利诺伊州厄巴纳)中的 无PRRS病毒的猪群中获得30只35±2日龄的杂交育种 (Yorkshire×Landrace)猪。将这些猪随机分配到伊利诺伊大学生物 控制设施的隔间(n＝3只猪/隔间)。在隔间中保持24℃到28℃的热 型气候。用基于玉米的II期饮食喂养猪，所述饮食提供满足或超过 高度瘦型猪的预估需求的营养浓度。根据生物医学分级措施在10个 182×243cm隔间中圈养所述动物(每组3只猪)，保持12h光照/ 黑暗周期并使其任意饮水和进食。在适应环境5天之后，使用2ml 包含104.1TCID50/ml的G16X-P3、794A61-P2或111698病毒的悬液 在臀部区域经肌肉内途径对6个隔间中的动物进行一次注射，每种疫 苗病毒共2个隔间(n＝6只猪)。使用2ml稀释剂(补充了0.5％猪 血清的PBS)对其他两个隔间中的6只动物进行模拟接种。剩余两个 隔间中的6只猪未被免疫并被用作严格对照。在接种后第39.5±0.5 天，用105.3TCID50的有毒力的PRRS病毒分离株NADC-20激发所 有被免疫的动物以及6只模拟接种的猪。所述激发接种物由4ml浓 度为104.7TCID50/ml的NADC-20病毒组成，其是以2ml剂量经鼻内 和肌肉内途径给予。在病毒激发前不久和激发后第7天测定每只动物 的体重。从激发当天直至之后7天的时期内，每天监测动物的活力的 改变和呼吸性窘迫的征象。在临激发和激发后第7天采集血清样品， 并使用定量实时PCR通过测定每ml血清中PRRS病毒基因组的量来 确定病毒血症的水平。激发后7天对动物实施安乐死并将其肺从其胸 腔完整移出。从右中肺叶采集BAL样品并通过在ZMAC细胞中滴定 来测定其中传染性病毒的量。
如下进行统计学分析。应用一般线性模型单变量措施和Fisher’sLSD检验来评估组之间关于病毒血症的程度(病毒基因组拷贝数/ml)和肺中传染性病毒的量(TCID50/ml)的差异。为了进行分析，将这两个测量值都转化为log10数值并与模拟接种-激发组的组平均值对比。使用Dunnett’st检验(双侧)对在病毒激发之前和之后接种的猪的差异性体重改变与参照模拟接种-激发组中测定的相同参数进行比较。使用统计学的软件(Cary,NC)进行分析。P值<0.01被认为是统计学上显著的。
为了评估PRRS病毒毒株794A61、111698和G16X的疫苗效力， 用这些病毒之一对猪进行免疫或对猪进行模拟接种，约5.5周之后用 有毒力的“急性PRRS”毒株NADC-20激发。另一组猪保持未感染 PRRS病毒的状态并作为严格对照。在激发当天，研究中全部30只 猪的平均体重为49.9±3kg。在对三个接种组的任何一组与模拟接种 组或严格对照组所确立的平均体重之间未发现显著差异。因此，暴露 于所述三种疫苗毒株的任一种对动物生长没有明显影响。相比之下， 用NADC-20病毒接种未免疫接种的动物与在接下来的7天内它们可 能的生长的急剧减少相关，这可由微小的3±1.6％体重改变来证明， 该体重改变值为严格对照组的平均18.5±1.54％的体重增加的1/6(图 7)。同样，在这点上，用794A61疫苗对猪进行免疫是不成功的， 因为这些用病毒激发的动物经历的平均体重增加为5.7±1.5％，其与 病毒激发的模拟接种组的记录值没有统计学上的差异(p>0.4)。但 是，与该对照组相比，先用G16X或111698病毒对动物进行接种显 著(p≤0.001)抵消了用NADC-20病毒进行激发的负面效应——这 两组的平均体重增加分别为9.8±0.54％和10.5±1.1％(图7)。
测定了PRRS病毒接种对NADC-20病毒激发的猪中病毒血症水 平的影响。如所预期的，在NADC-20病毒激发后第7天对严格对照 的猪和其他动物进行血清取样时，未直接暴露于PRRS病毒的严格对 照的猪的血清中没有可测量数量的传染性病毒。因此，未发生隔间之 间的交叉污染。同样，此时在用G16X病毒接种的任何一只猪的血清 中明显没有传染性病毒。另一方面，全部6只模拟接种动物以及分别 用794A61或111698接种的6只组成员中的3只和4只动物的血清中 容易地检测到传染性PRRS病毒。为了更准确地测定这些动物——特 别是G16X接种组中似乎为PRRS病毒阴性的成员——中病毒血症的 水平，使用定量实时PCR测定(图8)。如所预期的，在任何的严 格对照的猪的血清中未检测到PRRS病毒基因组。相比之下，病毒激 发的模拟接种动物的血清中具有非常高的病毒载量，组平均值为 107.85病毒基因组拷贝/mL。对于用794A61、111698或G16X病毒进 行免疫的猪，其病毒血症的水平显著更低(p≤0.001)，如分别为106.3、 105.0和104.6病毒基因组拷贝/mL的各组平均值所示的。应当注意的 是，通过使用这种非常灵敏的测定，在用111698和G16X病毒接种 的6只动物中的2只和3只动物的血清中无法检测到PRRS病毒基因 组。
测定PRRS病毒接种对NADC-20病毒激发的猪的肺部中病毒载 量的影响。在用NADC-20病毒激发后第7天，从之前模拟接种或用 794A61或111698病毒进行免疫的猪的肺部采集的BAL液具有相似 量的传染性病毒，其统计学上相似的组平均值分别为104.5、104.8和 104.1TCID50/ml(图9)。相比之下，来自G16X病毒接种组的BAL 液样品具有102.4TCID50/ml的平均效价，其显著小于(p<0.005)对 模拟接种组所测定的数值。此外，用G16X病毒接种的一只猪的BAL 液中缺少可检测的传染性病毒，表明所述激发病毒已被从其体内清 除。
根据所述结果可确定，可合理地将几乎同基因的PRRS病毒毒株 794A61、111698和G16X的疫苗效力分别评定为差、中等和良好的 等级。
实施例5
G16XPRRS病毒疫苗
实施例5.本实施例说明了G16X病毒的为用这种病毒接种并用 不同谱系(即谱系1)的有毒力的2型PRRS病毒激发的猪提供异源 的保护性免疫的能力。在本研究中，检测了两种PRRS疫苗病毒的效 力。用疫苗候选物G16X接种一组动物。用市售的IngelvacPRRS MLV接种第二组猪。本研究是双盲、安慰剂对照研究。为了实现盲 法实验(masking)，对参与日常观察、临床评分、总体和显微结构 肺病理学评估、样品处理以及实验结果解释的全体人员在整个实验阶 段研究中保持盲法实验。
从伊利诺伊大学兽医学研究农场购买24只6周龄猪。已知该农 场的猪群未感染所有主要的猪病原体，包括PRRS病毒、流感病毒、 支原体和环病毒。在研究开始之前通过血清学确认研究动物中PRRS 抗体的阴性状态。在全部24只动物的耳上做标记，并将其随机指定 到处理组(4组，每组6只猪)，然后将其转移到BSL2动物控制设 施。将被分配到同一处理组的所有猪(6只猪)圈养在一起。在7天 适应期之后，根据以下的处理安排对每组猪进行接种：
组1：对假疫苗组的每只猪经肌肉内注射2ml疫苗稀释剂。
组2：该组的每只猪接受1个剂量的IngelvacPRRSMLV(系列 号：245-D45)。根据制造商的使用说明将所述疫苗复原并通过肌肉 内途径给药(对接种物的滴定表明给药的总剂量为4×104TCID50)。
组3：该组的每只猪接受2ml的肌肉内注射，其包含总计4×104TCID50的G16X活PRRS病毒疫苗。
第4组作为严格(环境)对照并且未被接种。接种后28天，用4×104TCID50高毒力的PRRS病毒分离株LTX1激发组1、2和3中的全部 动物。根据对GP5基因核苷酸序列的系统发生分析，LTX1病毒被认 为属于2型(北美样)PRRSV的谱系1。LTX1病毒的GP5与所使 用的两种疫苗中的任一种具有<88％的同源性。LTX1病毒是在2012 年从伊利诺伊州的一个遭受严重的PRRS病毒爆发的母猪农场中分 离。观察到的症状的特征在于受孕率为60％、晚期流产和死产。此 外，在6周的时期内断奶前死亡率(pre-weanmortality)为100％， 之后的2周内断奶前猪的死亡率为80％。这次爆发如此严重，以致 农场主和主治兽医决定减少农场中猪的数量。使用鼻喷雾器经鼻内途 径给予一半剂量的激发病毒，通过肌肉内注射给予另一半剂量的激发 病毒。随后在接下来的14天，每天监测动物的临床征象。在病毒激 发不久和激发后第7、10和14天采集血液样品。在激发当天和激发 后第7、10和14天记录体重。在激发后第14天，对所有动物实施安 乐死并检查肺部的总体病理学。取样进行组织病理学并进行支气管肺 泡灌洗。使用的所有方法为本领域中之前所记载的方法，除了使用猪 肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC来检测所采集的BAL液中传染性病毒载 量之外。
a.用G16X病毒进行的接种在接种后4天刺激了强的干扰素α 应答
在本研究中，发现G16X病毒具有独特的生物学特性，即将G16X 疫苗病毒经肌肉内给予猪之后4天，在猪的血清中可检测到强烈的全 身性干扰素α应答。该应答在4天后(接种后第8天)减退并且在接 种后第14天仍然存在(图13)。相比之下，用IngelvacPRRSMLV 疫苗接种的猪在应答高峰时期(接种后第4天)表现出低得多(4倍) 的应答并且到第14天检测不到所述应答。这些结果确认了，在猪对 G16X病毒暴露的干扰素α应答方面，G16X病毒具有独特的生物型。
b.G16X疫苗在用高毒力的PRRS病毒激发的猪的体重增加方面 的效力
激发时，本研究中24只猪的平均体重是51±4kg，并且组之间平 均体重没有差异。同样，在用商用的PRRSMLV疫苗或G16X病毒 进行免疫的动物中未观察到临床征象。这些结果表明，同市售的MLV 疫苗一样，来源自天然无毒力病毒的G16X病毒也是无毒力的。因此， 暴露于疫苗G16X或IngelvacPRRSMLV对猪的生长或健康没有明 显影响。
为了测量由两种被检验的疫苗引起的对猪生长的保护性免疫，从 病毒激发当天到病毒激发后第7、10和14天计算每只动物的体重增 加百分数。未激发(严格对照)组的猪表现出稳定生长率，在14天 内平均增加32％(图14)。与严格对照组相比，用PRRS病毒LTX1 感染模拟接种猪使其生长率显著降低并导致从激发后第7天到第10 天的净体重减少。之后动物的体重开始增加，最终与激发时相比体重 增加14％(图14)。之前用任何一种疫苗对动物进行免疫都抵消了 用LTX1病毒激发所带来的负面影响——接受任何一种疫苗的组表 现出相似的平均体重增加，其在激发后第7、10和14天分别为约12％、 19％和29％。
c.G16X疫苗在控制用异源的高毒力PRRS病毒感染的猪中病毒 血症方面的效力
激发时(接种后第28天)，实验中所有猪的血清中都不具有可 检测的传染性病毒。在激发后第7、10和14天，所有进行模拟接种 然后用LTX1病毒激发的动物表现出高水平的病毒血症(图15)。 在激发后第7天，两个接种组的所有猪都具有病毒血症，这两个组之 间没有显著差异。但是，到第10天，用G16X病毒接种的5只猪中 仅有1只仍然有病毒血症。相比之下，用IngelvacPRRSMLV接种 的6只动物中的5只有病毒血症。到接种后第14天，两个接种组的 所有动物的血流中都不再有可检测的传染性病毒。
d.G16X疫苗在控制用高毒力PRRS病毒感染的猪的肺中病毒载 量方面的效力
在用LTX1病毒激发后第14天，好不令人吃惊的，对于未接种组的 全体成员，在猪的BAL液中发现了最大的病毒载量(图16，平均值为 105.8TCID50/ml)。此时，用在ZMAC细胞中生长的G16X病毒进行免 疫的5只动物中仅有3只在其BAL液中仍有可检测量的PRRS病毒。这 三只阳性动物的平均病毒载量为102.9TCID50/ml。这代表与未接种并激 发的对照猪的肺中存在的组平均病毒量相比组平均病毒量下降>700倍。 相比之下，用IngelvacPRRSMLV接种的6只猪中的5只的BAL液中 仍可检测到传染性病毒。此外，在这5只阳性动物中其平均病毒载量为 103.8TCID50/ml，其约为G16X病毒免疫的免疫组的测定值的10倍。
总之，本实施例说明，与商用的MLV疫苗类似，G16X病毒没有毒 力，但是在用不同谱系的有毒力的2型PRRS病毒异源激发时，G16X 的效力比市售的MLV疫苗更优异。
实施例6
序列信息
实施例6.本发明的实施方案可涉及一个或多个核酸或蛋白序列，其 包括本文所记载的项目。任何序列信息(包括以电子格式单独提交的序 列信息)被认为是本说明书的一部分并以引用的形式纳入本文。
表3.SEQIDNO:1
表4.SEQIDNO:2
表5.SEQIDNO:3
表6.其他SEQIDNO:项目和某些序列表信息