技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因植物中aad1基因的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
2014年全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫和抗除草剂。CP4EPSPS、bar、dmo、aad-1等基因是目前在转基因植物中应用最广的抗除草剂基因，其中aad1基因已广泛应用到转基因玉米新品种研究中，含有aad1基因的转基因玉米已获准进口我国用作加工原料。针对aad1基因开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。
转基因成分检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4h），难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。
LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：可通过肉眼或浊度仪观察反应管内的沉淀变化，或在反应管中加入染色剂后通过肉眼观察颜色变化等方法，对扩增产物进行便捷的检测。
LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因植物中aad1基因的检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种转基因植物中aad1基因的LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于公开一种转基因植物中aad1基因的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因植物中aad1基因的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
根据aad1基因的核苷酸序列，设计aad1基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~4；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。
转基因植物中aad1基因的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物F3：GCAGAGAAGCCAATGAGTCT（SEQIDNO：1）；
外引物B3：GCTTGCATGGTTGGAGACAA（SEQIDNO：2）；
内引物FIP：CAGCAGCTGGAGGTGCATCAGGGTGATTGGTGATGACTGG（SEQIDNO：3）；
内引物BIP：AGATGTTCCTGAGCATGGCGGGGTCTCCCAAGCTGTGTAC（SEQIDNO：4）。
转基因植物中aad1基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由上述4条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L；
（2）具有链置换活性的BstDNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，40~100mmol/LMgSO4，6~14mol/L甜菜碱；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料。
优选的，所述的检测引物溶液中含有5μmol/L外引物F3、5μmol/L外引物B3、40μmol/L内引物FIP、40μmol/L内引物BIP。
优选的，所述的BstDNA聚合酶的浓度为8U/μL。
优选的，所述的10×反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L和8mol/L。
利用以上所述的试剂盒检测aad1基因的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μLPCR反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；
（3）在反应管盖上加1μL的显色剂，盖到反应管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，65℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：颠倒反应管，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
通过实验证明，本发明提供的aad1基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。
附图说明
图1是实施例2中进行特异性检测的结果图，1~8依次为转cry1Ie基因玉米IE09S034、转cry1C基因水稻T1c-19、转cry1F基因玉米TC1507、转cry34Ab和cry35Ab基因玉米59122、转vip3A基因MIR162、转dmo基因大豆MON87708、转aad1基因玉米DAS40278-9和非转基因玉米对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1试剂盒及其检测方法。
按下列配方制备aad1基因的LAMP检测试剂盒，每个试剂盒的规格为100次反应：
（1）检测引物溶液：合成外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，将引物干粉用超纯水分别配成浓度为100μmol/L的母液，然后分别取5μL外引物F3、5μL外引物B3、40μL内引物FIP、40μL内引物BIP、10μL超纯水，放入一个新的1.5mL离心管中，充分混匀，配成100μL的aad1基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：
外引物F3：GCAGAGAAGCCAATGAGTCT（SEQIDNO：1）；
外引物B3：GCTTGCATGGTTGGAGACAA（SEQIDNO：2）；
内引物FIP：CAGCAGCTGGAGGTGCATCAGGGTGATTGGTGATGACTGG（SEQIDNO：3）；
内引物BIP：AGATGTTCCTGAGCATGGCGGGGTCTCCCAAGCTGTGTAC（SEQIDNO：4）；
（2）BstDNA聚合酶：浓度为8U/μL，分装100μL放入一个新的1.5mL离心管中；
（3）10×反应缓冲液：包含200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，80mmol/LMgSO4和8mol/L甜菜碱，分装250μL放入一个新的1.5mL离心管中；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500μL放入一个新的1.5mL离心管中；
（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料，分装200μL放入一个新的棕色1.5mL离心管中。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
（1）提取待测样品的基因组DNA：采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA，稀释至25ng/μL；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：采用25μL的反应体系，在200μL反应管内依次加入超纯水15.5μL、模板DNA2μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液3μL；
（3）在反应管盖上加1μL的显色剂，盖到反应管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，65℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：颠倒反应管，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
实施例2试剂盒及检测方法的特异性实验。
按实施例1所述的试剂盒制备方法准备试剂盒，并对其检测方法进行特异性测试：
（1）提取转cry1Ie基因玉米IE09S034、转cry1C基因水稻T1c-19、转cry1F基因玉米TC1507、转cry34Ab和cry35Ab基因玉米59122、转vip3A基因MIR162、转dmo基因大豆MON87708、转aad1基因玉米DAS40278-9和非转基因玉米等8种试验材料的基因组DNA，用ND1000核酸微量测定仪测定DNA浓度，用超纯水稀释至25ng/μL；
（2）在200μL的八联管中，按照实施例1所述的步骤，在每个管中依次加入超纯水15.5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液3μL，然后在1-8号管中分别加入2μL的IE09S034、T1c-19、TC1507、59122、MIR162、MON87708、DAS40278-9、非转基因玉米样品的DNA对照；
（3）在八联管盖的每个管盖上加1μL的显色剂，盖到八联管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将八联管放置在恒温水浴锅中，65℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：颠倒反应管，使八联管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
本实施例中，仅在含有aad1基因的转基因玉米DAS40278-9样品管中显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对aad1基因具有很好的特异性。
应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。