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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610466398.7 (22)申请日 2016.06.23 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安南路199号 (72)发明人 蒋育澄樊雪婷胡满成李淑妮 翟全国 (74)专利代理机构 西安永生专利代理有限责任 公司 61201 代理人 高雪霞 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C02F 101/38(2006.01) (54)发明名称 一种花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶。
2、杂化纳 米反应器及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种花球状Co3(PO4)2/氯过氧化 物酶杂化纳米反应器及其应用， 该纳米反应器是 将氯过氧化物酶、 醋酸钴加入pH值为36的磷酸 缓冲液中， 所得混合液经静置、 除去上层清液、 真 空干燥， 即可得到直径较小、 致密性较好、 结构稳 定的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反 应器。 本发明制备方法简单， 所得花球状Co3 (PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器热稳定性 好、 对反应环境的耐受性高， 且暴露在表面的氯 过氧化物酶总量较多， 增加了其在反应中与底物 的接触面积， 用于降解三苯甲烷类水溶性染料时 表现出较高的催化活性。
3、， 5分钟内对结晶紫的降 解率可达到80以上， 具有较好的应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 106047852 A 2016.10.26 CN 106047852 A 1.一种花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器， 其特征在于它由下述方法制 备得到： 向pH值为36的磷酸缓冲液中加入氯过氧化物酶、 醋酸钴， 混合均匀， 所得混合液 中氯过氧化物酶的浓度为0.250.6 mol/L、 醋酸钴的浓度是59mmol/L； 然后将所得混合 液静置后除去上层清液， 再真空干燥， 得到Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器。 2.根据权利要求1所述的花球状Co。
4、3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器， 其特征在 于： 向pH值为5.56的磷酸缓冲液中加入氯过氧化物酶、 醋酸钴， 混合均匀， 所得混合液中 氯过氧化物酶的浓度为0.40.5 mol/L、 醋酸钴的浓度是68mmol/L。 3.根据权利要求1所述的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器， 其特征在 于： 将所得混合液放入恒温培养箱中20静置3天后除去上层清液， 再在32下真空干燥。 4.权利要求1所述的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器在催化降解三苯 甲烷类水溶性染料中的应用。 5.根据权利要求4所述的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器。
5、在催化降解 三苯甲烷类水溶性染料的应用， 其特征在于： 所述的三苯甲烷类水溶性染料为结晶紫、 孔雀 石绿、 苯胺蓝中的任意一种。 6.权利要求4或5所述的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器在催化降解三 苯甲烷类水溶性染料中的应用， 其特征在于： 向pH值为24的磷酸缓冲液中加入花球状Co3 (PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器、 待降解的三苯甲烷类水溶性染料样品和H2O2水溶 液， 混合均匀， 所得混合液在室温下避光静置35分钟。 7.权利要求6所述的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器在催化降解三苯 甲烷类水溶性染料中的应用， 其特征在于： 所述的花球状。
6、Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米 反应器中固载的氯过氧化物酶与H2O2、 三苯甲烷类水溶性染料的摩尔比为1:4050:150 750。 8.权利要求6所述的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器在催化降解三苯 甲烷类水溶性染料中的应用， 其特征在于： 所述的H2O2水溶液的浓度为0.1mol/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106047852 A 2 一种花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器及其 应用 技术领域 0001 本发明属于酶的固定化技术领域， 具体涉及一种Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳 米反应器及其合成方法和在催化降解三苯甲烷类水。
7、溶性染料结晶紫中的应用。 背景技术 0002 酶促反应有诸多优点， 例如： 反应条件温和(常温常压和接近生理状态下的pH)、 反 应快、 选择性好等， 而且在有机反应中可以避免复杂的官能团保护或活化等步骤， 因而比一 般的有机合成更高效、 更经济、 更绿色。 然而尽管具有上述优势， 由于酶在高温、 强酸强碱、 存在有机溶剂等实际反应环境中长时间操作的稳定性较差以及难以从反应体系中分离而 重复使用等缺点， 使得其大规模产业化的应用受到阻碍。 这些缺点一般来说可以通过酶的 固定化得到改善。 酶的固定化可增强酶蛋白对环境的适应能力， 提高其操作稳定性， 实现酶 蛋白的重复使用， 从而提高其经济效益。。
8、 0003 酶的固定化技术可以分为如下三大类： 0004 1、 与固体载体结合： (a)通过吸附结合， 即通过氢键疏水相互作用； (b)通过离子键 相结合； (c)通过共价键结合。 0005 2、 交联法： 指通过双功能试剂， 将酶和酶联结成网状结构的固定化方法。 例如通过 戊二醛的交联作用。 0006 3、 包埋： (a)包埋在各种凝胶中， 如藻酸钙； (b)包埋在膜反应器中， 如中空的纤维 反应器； (c)包埋在可逆的胶束、 囊泡中。 0007 2012年， RichardN.Zare课题组通过自组装的方法， 第一次制备出了以Cu()作 为无机部分、 各种蛋白质作为有机部分的有机-无机杂化。
9、纳米花。 蛋白质与Cu()之间的作 用使得材料生长成了具有纳米尺寸的花瓣状结构。 当酶作为杂化纳米花的有机部分时， 与 游离酶相比， 该材料上酶的催化活性与稳定性都得到了提高。 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定性和催化活性高的Co3(PO4)2/氯过 氧化物酶杂化纳米反应器， 以及该纳米反应器在氧化降解三苯甲烷类水溶性染料中的应 用。 0009 解决上述技术问题所采用的技术方案是该纳米反应器由下述方法制备得到： 向pH 值为36的磷酸缓冲液中加入氯过氧化物酶、 醋酸钴， 混合均匀， 所得混合液中氯过氧化物 酶的浓度为0.250.6 mol/L、 醋酸钴的浓度是59m。
10、mol/L； 然后将所得混合液静置后除去 上层清液， 再真空干燥， 得到Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器。 0010 本发明的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器优选由下述方法制备得 到： 向pH值为5.56的磷酸缓冲液中加入氯过氧化物酶、 醋酸钴， 混合均匀， 所得混合液中 氯过氧化物酶的浓度为0.40.5 mol/L、 醋酸钴的浓度是68mmol/L； 然后将所得混合液 说明书 1/4 页 3 CN 106047852 A 3 放入恒温培养箱中20静置3天后除去上层清液， 再在32下真空干燥。 0011 本发明花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应。
11、器在催化降解三苯甲烷类水 溶性染料中的应用， 其中所述的三苯甲烷类水溶性染料为结晶紫、 孔雀石绿、 苯胺蓝中的任 意一种， 具体使用方法为： 向pH值为24的磷酸缓冲液中加入花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物 酶杂化纳米反应器、 待降解的三苯甲烷类水溶性染料样品和H2O2水溶液， 混合均匀， 所得混 合液在室温下避光静置35分钟， 其中所述花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应 器中固载的氯过氧化物酶与H2O2、 三苯甲烷类水溶性染料的摩尔比为1:4050:150750， 所述的H2O2水溶液的浓度为0.1mol/L。 0012 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 001。
12、3 1、 本发明直接在磷酸缓冲液中加入氯过氧化物酶和醋酸钴， 钴离子与氯过氧化物 酶分子表面的羧基、 氨基、 羟基及酰胺键等官能团配位， 形成晶核， 然后在结构引导剂氯过 氧化物酶的作用下， 晶核之间通过氯过氧化物酶分子的黏合作用逐渐生长成片状结构， 片 状结构继续生长并自组装成纳米级的繁密的多层花瓣状的球形纳米花结构Co3(PO4)2/氯过 氧化物酶杂化纳米反应器。 其中醋酸钴中的CH3COO-离子直接影响产品的形貌、 大小、 致密程 度。 0014 2、 本发明纳米反应器的制备方法简单， 所得花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化 纳米反应器直径较小， 致密性较好， 结构较稳定， 暴露。
13、在表面的氯过氧化物酶总量较多， 增 加了其在反应中与底物的接触面积， 且热稳定性以及对反应环境的耐受性都有所提高。 0015 3、 本发明花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器用于降解三苯甲烷类水 溶性染料表现出较高的催化活性， 5分钟内对结晶紫的降解率可达到80以上， 具有较好的 应用前景。 附图说明 0016 图1是实施例1制备的Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器的扫描电镜图。 0017 图2是对比例1中未固定氯过氧化物酶合成的Co3(PO4)2化合物的扫描电镜图。 0018 图3是实施例1制备的Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器的XRD图。 具体实施。
14、方式 0019 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明， 但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。 0020 实施例1 0021 向9.375mL0.1mol/LpH值为5.8的磷酸缓冲液中加入25 L0.2mmol/L氯过氧化物 酶水溶液、 600 L0.1mmol/L醋酸钴水溶液， 混合均匀， 所得混合液中氯过氧化物酶的浓度为 0.5 mol/L、 醋酸钴的浓度为6mmol/L， 然后将所得混合液放入恒温培养箱中20静置3天后 除去上层清液， 再置于真空干燥箱中在32下真空干燥， 得到花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物 酶杂化纳米反应器。 0022 对比例1 0023 向9.4mL0。
15、.1mol/LpH值为5.8的磷酸缓冲液中加入600 L0.1mmol/L醋酸钴水溶 液， 混合均匀， 所得混合液中醋酸钴的浓度为6mmol/L， 然后将所得混合液放入恒温培养箱 说明书 2/4 页 4 CN 106047852 A 4 中20静置3天后除去上层清液， 再置于真空干燥箱中在32下真空干燥。 0024 采用Quanta200型环境扫描电子显微镜(FEI公司)、 D/Max2550VB+/PC型全自动X射 线衍射仪(日本理学公司)分别对对比例1和实施例1所得产品进行表征， 结果见图13。 由 图1和图2可见， 对比例1中未添加氯过氧化物酶得到的产品虽然也为层状结构， 但没有特定 的。
16、形貌形成。 而实施例1中得到的产品是由纳米片自组装而成的花球状结构， 它呈现多层花 瓣状的表面形貌， 比表面积较大， 说明氯过氧化物酶在花球形成的过程中是通过酶分子的 黏合作用使纳米片形成了规则的球状结构。 由图3可见， 实施例1所得产品的XRD衍射曲线与 Co3(PO4)2标准卡片一致， 说明所得产品为花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器， 其中氯过氧化物酶的固载量为53.5mg/g。 0025 实施例2 0026 向9.475mL0.1mol/LpH值为3的磷酸缓冲液中加入25 L0.1mmol/L氯过氧化物酶 水溶液、 500 L0.1mmol/L醋酸钴水溶液， 混合均匀。
17、， 所得混合液中氯过氧化物酶的浓度为 0.25 mol/L、 醋酸钴的浓度为5mmol/L， 然后将所得混合液放入恒温培养箱中20静置3天 后除去上层清液， 再置于真空干燥箱中在32下真空干燥， 得到花球状Co3(PO4)2/氯过氧化 物酶杂化纳米反应器， 其中氯过氧化物酶的固载量为45.7mg/g。 0027 实施例3 0028 向9.070mL0.1mol/LpH值为5的磷酸缓冲液中加入30 L0.2mmol/L氯过氧化物酶 水溶液、 900 L0.1mmol/L醋酸钴水溶液， 混合均匀， 所得混合液中氯过氧化物酶的浓度为 0.6 mol/L、 醋酸钴的浓度为9mmol/L， 然后将所得混。
18、合液放入恒温培养箱中20静置3天后 除去上层清液， 再置于真空干燥箱中在32下真空干燥， 得到花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物 酶杂化纳米反应器， 其中氯过氧化物酶的固载量为50.6mg/g。 0029 实施例4 0030 实施例1制备的花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器在催化降解结晶 紫中的应用， 具体方法如下： 0031 分别向1.5mL0.1mol/LpH值为2、 2.5、 2.75、 3、 3.5、 4的磷酸缓冲液中加入43mg花 球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器、 200 L0.1mmol/L结晶紫水溶液和23 L0.1mol/LH2O2水溶液。
19、， 混合均匀， 其中花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应器中 固载的氯过氧化物酶与H2O2、 结晶紫的摩尔比为1:43:370， 室温避光静置5分钟。 采用紫外可 见分光光度计在特征吸收波长为583nm处测定降解前后体系的吸光度值， 根据下述公式计 算降解率： 0032 0033 其中， A0表示降解前体系在583nm处的吸光度值， At表示降解后体系在583nm处的吸 光度值。 测试结果见表1。 0034 表1pH值对降解率的影响 0035 pH22.52.7533.54 结晶紫降解率97.6597.9999.6697.9995.3086.24 0036 由表1可见， 在pH值为24时， 采用本发明花球状Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳 说明书 3/4 页 5 CN 106047852 A 5 米反应器催化降解水溶性染料结晶紫， 避光5分钟结晶紫的降解率即可达到86以上， 而且 在pH值为2.75时， 结晶紫几乎完全降解， 说明本发明Co3(PO4)2/氯过氧化物酶杂化纳米反应 器具有较高的催化活性。 说明书 4/4 页 6 CN 106047852 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 106047852 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 106047852 A 8 。