发明领域
本发明涉及蛋白质复合物，其具有能结合并激活生长因子受体如 I型胰岛素样生长因子受体及玻连蛋白(vitronectin)或纤连蛋白 (fibronectin)的整联蛋白(integrin)受体的各自的结构域。在特定的实施 方案中，本发明涉及嵌合蛋白质，其包含胰岛素样生长因子-I、胰岛 素样生长因子-II、血小板衍生生长因子或血管内皮衍生生长因子受体 结合结构域及玻连蛋白或纤连蛋白的整联蛋白受体结合结构域。更特 别地，本发明涉及刺激细胞迁移的蛋白质复合物及涉及促进或诱导细 胞迁移和/或增殖的组合物和方法。这些组合物和方法可用于需要上 皮细胞迁移和/或组织的伤口愈合、组织工程、美容和治疗性处理如 皮肤置换和皮肤补充及烧伤的治疗中。在其它实施方案中，本发明提 供了关于防止或抑制癌细胞转移特别是乳腺癌的治疗方法。本发明的 嵌合蛋白也可以用于蛋白质复合物生物学作用的激动剂和拮抗剂的 产生，所述蛋白质复合物包含胰岛素样生长因子、玻连蛋白和胰岛素 样生长因子结合蛋白。
发明背景
胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF)，IGF-I和 IGF-II，是参与众多细胞过程(包括增生、DNA合成、分化、细胞周 期行进及细胞凋亡抑制)的促有丝分裂肽生长因子(Keiss et al.，9 19949 Hormone Research 41 66；Wood & Yee，2000，J.Mammary Gland Biology and Neoplasia 51；Jones & Clemmons，1995，Endocrine Rev.16 3)。这些作用是通过结合其酪氨酸-激酶连接的细胞表面受体即I型 IGF受体(IGF-IR)而介导的。IGF也由一个称为IGFBP的特异性结合 蛋白家族紧密调节，其最初的作用是结合游离的IGF并由此调节其半 衰期、特异性和活性(Clemmons，1998，Mol.Cell.Endocrinol.140 19)。
最近已经显示玻连蛋白(vitronectin，VN)直接结合IGF-II(Upton et al.，1999.Endocrinology 140 2928-31)，而IGF-I在存在一定的IGFBP 的情况下可结合VN，如国际公开WO 02/24219所述。VN(一种ECM 组构和粘着分子)以与IGF-IR(IGF-II生物学相关受体)对IGF-II 的亲和性(Upton et al.，1999，如前)相似的亲和性结合IGF-II的发现揭 示了ECM中IGF作用与VN之间的特异性物理联系。另外，结合 VN的IGF-II在体外在人角质细胞中可刺激协同功能应答(国际公开 WO 02/24219)。
VN是在血液和ECM中高度富集的一种糖蛋白。VN最初在肝脏 中合成，但被许多其它类型细胞表达，VN在血液中以闭合的构象循 环并以开放的或伸展的构象沉积在ECM中(Schvartz et al.，1999，The International Journal of Biochemistry and Cell Biology 31 531-44)。确信 这两种构象均结合IGF-II(Upton et al.，1999，如前；国际公开WO 02/24219；McMurty et al.，1996，Endocrinology 150：149-60)并还结合 多种其它配体包括胶原(Morris et al.，1994，Journal of Biological Chemistry 269 23845-52)、糖胺聚糖(Francois et al.，1999，Journal of Biological Chemistry 274：37611-19)、许多其它ECM蛋白及各种整联 蛋白，特别是αv整联蛋白。实际上，玻连蛋白最初的作用是作为ECM 组构分子，通过RGD结合基序提供与这些细胞表面整联蛋白受体的 粘附连接。已经显示VN受体(αv整联蛋白)调节生长和侵入所需的肌 动蛋白细胞骨架重排，因此，VN结合协同细胞粘着和运动(DePasquale， 1998，Histochemistry and Cell Biology 110：485-94；Huang，2000， Oncogene 19 1915-23)。
然而，蛋白质复合物中存在的IGF和VN在刺激生物应答如细胞 迁移和/或增殖中各自的相关作用还不明白，但是在IGF/IGFBP和VN 之间具有蛋白质-蛋白质相互作用的位点。
发明概述
本发明的发明人发现包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP及 VN的蛋白质复合物通过结合并协同地共激活IGF-I受体(IGF-IR)和 VN结合的整联蛋白受体而刺激细胞迁移和/或增殖。
另外，本发明鉴别了VN的多阴离子结构域，猜测是IGF或IGFBP 的结合位点。
因此，本发明一般地涉及分离的蛋白质复合物，其包含一个生长 因子结构域的受体结合结构域及能结合整联蛋白受体的一个玻连蛋 白或纤连蛋白的结构域，其中所述分离的蛋白质复合物可以共激活生 长因子和整联蛋白受体，从而激发生物学应答。
第一方面，本发明提供了一种分离的蛋白质复合物，其包含：
(i)一种生长因子，或者生长因子的能结合关联的生长因子受体 的至少一个结构域；和
(ii)玻连蛋白(VN)或纤连蛋白(FN)，或者VN或FN的至少一个 整联蛋白结合结构域。
第二方面，本发明提供了合成的嵌合蛋白形式的分离的蛋白质复 合物，其包含：
(i)一种生长因子，或者生长因子的能结合关联的生长因子受体 的至少一个结构域的氨基酸序列；和
(ii)玻连蛋白(VN)或纤连蛋白(FN)，或者VN或FN的至少一个 整联蛋白结合结构域
的氨基酸序列。
根据前述方面，所述生长因子优选是IGF-I或IGF-II。
更优选地，所述生长因子是IGF-I。
在其中所述生长因子是IGF-I的实施方案中，适当地所述IGF-I 的至少一个结构域包括IGF-I的第24位残基。
在其中所述生长因子是IGF-II的实施方案中，适当地所述IGF-II 的至少一个结构域包括IGF-II的第27位残基。
在另一个实施方案中，所述生长因子是VEGF或PDGF。
优选地，所述整联蛋白受体是αv整联蛋白。
更优选地，所述整联蛋白受体是αvβ3整联蛋白或αvβ5整联蛋白。
本发明的这个方面在其范围内还包括相应于上述(i)和(ii)的氨基 酸序列中的氨基酸缺失、添加、取代和/或突变。
第三方面，本发明提供了编码第二方面的分离的蛋白质复合物的 分离的核酸。
第四方面，本发明提供了一种遗传构建体，其包含第三方面的分 离的核酸，其可操纵地与表达载体内的一或多个调节序列连接。
优选地，所述遗传构建体是一种表达构建体。
第五方面，本发明提供了包含第四方面的遗传构建体的一种宿主 细胞。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第一方面的分 离的蛋白质复合物或者第二方面的合成的蛋白质及药物可接受的载 体、稀释剂或赋形剂。
本发明的这个方面还涵盖了包含第五方面的宿主细胞的药物组 合物，该细胞表达所述合成的蛋白质。
第七方面，本发明提供了特异于第二方面的合成的蛋白质的抗 体。
第八方面，本发明提供了促进细胞迁移的一种方法，包括使用合 成的蛋白质结合生长因子受体和整联蛋白受体的步骤。
优选地，所述生长因子受体是IGF-IR。
优选地，所述整联蛋白受体是αv整联蛋白。
更优选地，所述整联蛋白受体是αvβ3整联蛋白或者αvβ5整联蛋 白。
在一个优选的实施方案中，本发明的这个方面涉及上皮细胞迁移 和/或增殖的促进或诱导，以促进哺乳动物(优选人体)伤口愈合。
优选地，所述合成的蛋白质如本发明的第一方面所述。
第九方面，本发明提供了一种防止细胞迁移和/或增殖的方法， 包括通过包含生长因子和玻连蛋白或纤连蛋白的复合物防止、抑制或 另外降低生长因子受体与整联蛋白受体结合的步骤。
优选地，所述生长因子受体是IGF-IR。
优选地，所述整联蛋白受体是αv整联蛋白。
更优选地，所述整联蛋白受体是αvβ3整联蛋白或αvβ5整联蛋白。
在一个优选的实施方案中，本发明的这个方面涉及在哺乳动物 (优选人体)中防止或抑制转移的癌细胞迁移和/或增殖。
本发明的这个方面涵盖的一个特殊实施例是防止或抑制乳腺癌 转移。
也应意识到第八和第九方面的方法可以涵盖预防和治疗方法。
第十方面，本发明提供了第一方面的分离的蛋白质复合物或第二 方面的合成的蛋白质在产生一种分子的应用，所述分子是：(i)包含生 长因子和玻连蛋白或纤连蛋白的蛋白质复合物的激动剂；或者(ii)包 含生长因子和玻连蛋白或纤连蛋白的蛋白质复合物的拮抗剂。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了第一方面的合成的蛋白 质在产生一种分子中的应用，所述分子是：(i)IGF-II：VN或 IGF-I：IGFBP：VN蛋白质复合物的激动剂；或者(ii)IGF-II：VN或 IGF-I：IGFBP：VN蛋白质复合物的拮抗剂。
根据本发明的这个方面产生的激动剂和/或拮抗剂在促进伤口愈 合、组织工程、皮肤再生和/或预防癌细胞转移或者皮肤过度增殖疾 病如疤痕和银屑病(牛皮癣)中特别有效。
第十一方面，本发明提供了一种生物材料，其包含第一或第二方 面的分离的蛋白质复合物。
在独特的实施方案中，所述生物材料可以是包含本发明的分离的 蛋白质复合物的外科植入体、修补物、支架、伤口或烧伤敷料或者适 当地浸渍、包被或以其他方式包含本发明的分离的蛋白质复合物的材 料。
附图及表格简述
图1：接种进12μm孔TranswellsTM的上层腔室的HaCAT人皮肤 角质细胞迁移至下表面，这是对用与VN预结合的IGF-II(黑色柱)或 者在无VN情况下与平皿“结合”的IGF-II(灰色柱)包被的下层腔室 的应答。
图2：接种进12μm孔TranswellsTM的上层腔室的MCF-7人乳腺 癌细胞迁移至下表面，这是对用与VN预结合的IGF-II(条纹柱)或者 在无VN情况下与平皿“结合”的IGF-II(白色柱)包被的下层腔室的 应答。每个柱均代表温育5小时后下层膜上细胞的平均数，这一平均 数得自三个重复实验，在所述实验中所述处理在一式三份的孔中进行 分析。其中所述复合物的作用与单独使用VN的作用显著不同的数据 点以星号表示。
图3：接种进12μm孔TranswellsTM的上层腔的MCF-7人乳腺癌 细胞迁移至已经用VN、与VN结合的天然IGF-II(条纹柱)或与VN 结合的L27-IGF-II(黑色柱)包被的下层腔室中。每个数据点均与在无 VN的情况下含有同样数量的IGF-II的无VN对照组(白色柱)配对。 每个柱均代表在温育5小时后下层膜上细胞的平均数，所述平均数得 自两个重复实验，所述实验中所述处理在一式三份的孔中进行分析。
图4：接种进12μm孔TranswellsTM的上层腔的MCF-7人乳腺癌 细胞迁移至已经用单独的VN、与VN结合的天然IGF-II(条纹柱) 或与VN结合的Des(1-6)IGF-II(黑色柱)包被的下层腔室中。每个数 据点均与在无VN的情况下含有同样数量的IGF-II的无VN对照组 (白色柱)配对。每个柱均代表在温育5小时后下层膜上细胞的平均 数，所述平均数得自两个重复实验，其中所述处理在一式三份的孔中 进行分析。
图5：MCF-7人乳腺癌细胞在存在mAb2021Z(一种αv功能阻断 Ab)时应答IGF-II而通过TranswellsTM迁移。将已经用αv功能阻断 Ab处理的MCF-7细胞接种在已经用VN+/-IGF-II包被的TranswellsTM上，并使其通过多孔膜迁移5小时。然后通过从固定的细胞中提取染 色并读出光密度而确定横过该膜的细胞数目。然后将处理以在有或无 Ab存在时单独的VN上迁移的细胞百分比表示。数据从一个单一实 验的一式四份实验结果中集合。条杆表示SEM。星号表示未处理的 或Ab处理的细胞之间的显著差异(P＜0.1)。
图6：接种进12μm孔TranswellsTM的上层腔室的MCF-7人乳腺 癌细胞迁移至已经用VN(白色柱)、VN+IGFBP-5(灰色柱)、天然 IGF-I+VN(较浅的实心柱)，或天然IGF-I+IGFBP-5+VN(较深的实 心柱)、L24-IGF-I+VN(向左条纹柱)或L24-IGF-I+IGFBP-5+VN(向 右条纹柱)包被的下层腔室中。每个柱均代表在温育5小时后下层膜 上细胞的平均数目，其得自在一式三份的孔中进行分析的两个重复实 验。
图7：玻连蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，包括玻连蛋白内 各个结构域涉及的残基，以及残基修饰位点、配体结合位点和蛋白酶 识别位点。
图8：(a)全长VN(75kDa)与(b)显示配体结合位点的卵黄VN(54 kDa)的结构关系。哺乳动物和禽类血清VN均具有相同的结构域结 构，然而在氨基酸序列之间存在不同。卵黄VN(54kDa)是这些蛋白 质的截短形式。使用的缩写是：Som B：生长调节素B；连接：连接 结构域；血红素结合蛋白：血红素结合蛋白样重复；HBD：肝素结合 结构域；PAI-1：纤溶酶原激活物抑制剂-1；uPAR：尿激酶纤溶酶原 激活物受体；TAT：凝血酶-抗凝血酶III复合物；uPA：尿激酶纤溶 酶原激活物；----：多阴离子区域(碱性区域)；+++：多阳离子区域(酸 性区域)。
图9：从鸡卵黄中纯化54kDa卵黄VN。加样于Q-Sepharose基 质上的蛋白质样品(泳道L)及洗脱纯化的产物(泳道E)的SDS-PAGE 分析。泳道M表示分子量标记(BioRad Low Range Markers)(BioRad， Richmond，CA，USA)。使用预先设计的4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶 电泳(Gradipore，Frenchs Forest，NSW，Australia)分析蛋白质。
图10：评定[125I]-IGF-I/IGFBP-3结合纯化的VN能力的固相结合 试验(solid plate binding assay)。该固相结合试验如先前Kicker，et al.， 2003 Endocrinology 144 2807-2815所述进行。简而言之，用纯化的 VN在4℃预包被Immulon 96孔平板过夜。然后加入放射标记的 IGF-I/IGFBP-3复合物并使其结合VN过夜，之后除去未结合的原料。 [125I]-IGF-I/IGFBP-3与结合孔的VN的结合在γ-计数器中确定(数目 ＝18)。人VN：从人血清中纯化的VN；卵黄VN 75：纯化的75kDa 卵黄VN；卵黄VN 54：纯化的54kDa卵黄VN。
图11：细胞生长分析(MTT)(48小时)：应答IGF：VN复合物的 HaCAT细胞生长。IGF：VN复合物预包被于接种有HaCAT细胞的孔 上并使其生长48小时。此后使用MTT方法(Denizot & Lang，1986 The Joumal of Immunological Methods 89 271-277)通过代谢活性评定细胞 生长情况(n＝3)。人VN：纯化自人血清的VN；卵黄VN 75：纯化的 75kDa卵黄VN；卵黄VN 54：纯化的54kDa卵黄VN；IGF-I/BP3： 胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图12：TranswellTM迁移分析(5小时)：应答IGF：VN复合物的 HaCAT迁移。将HaCAT细胞接种进用IGF-I：IGFBP-3：VN复合物包 被的TranswellTM中，并如前所述使其迁移5小时(Kricker，et al.，2003， 如前)。已经迁移的细胞用结晶紫染色并在595nm读取光密度。每个 处理均一式两份进行(n＝2)。人VN：从人血清中纯化的VN；卵黄VN 75：纯化的75kDa卵黄VN；卵黄VN 54：纯化的54kDa卵黄VN； IGF-I/BP3：胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子结合蛋白3。
图13：(A)成熟玻连蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，(B)IGF-I 的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)及(C)优选的接头序列的氨基酸序列 (SEQ ID NO：4-8)。
图14：(A)-(N)：含有IGF-I和VN的嵌合蛋白的氨基酸序列 (SEQ ID NO：9-22)。
图15：(A)含有PDGF和VN的嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)，(B)含有VEGF和VN的嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO： 24)。
发明详述
本发明由以下发现发展而来：包含IGF-II和VN或IGF-I和IGFBP 及VN的蛋白质复合物通过应答细胞表达的IGF-IR受体和VN结合 整联蛋白受体而结合并发挥对细胞迁移的生物学作用。更特别地，这 种双重结合协同地刺激细胞迁移和/或增殖，这已经由本发明人在角 质细胞模型和乳腺癌细胞模型中揭示。
另外，令人惊奇地发现了表现为与IGF-II和IGFBP相互作用或 结合的VN的结构域是相应于成熟VN的第53-64位氨基酸的一个 多阴离子区域。
这个发现导致本发明人提供了一种分离的蛋白质复合物，其至少 包含与VN的整联蛋白结合结构域组合的能结合IGF-IR的IGF-I或 IGF-II的最小结构域或区域。更特别地，可以产生包含这些结构域的 单一的接近的蛋白质。
这种蛋白质复合物无论包含多个蛋白质还是单一合成的蛋白质 形式，均预期协同结合或共连接IGF-IR和VN结合的整联蛋白受体， 从而是促进细胞迁移和/或增殖及伤口愈合的有效制剂。相近地，本 发明人设想防止IGF-IR和与VN结合的整联蛋白受体共连接可以用 于防止癌细胞转移。还可以设想这个发现可以扩展为包含其它生长因 子如PDGF和VEGF的蛋白质复合物，也可扩展为(但不限于)其 它整联蛋白结合的蛋白质如纤连蛋白(fibronectin，FN)。
在本说明书中除非特别指出，所用术语“包含”的用法是包含性 的而不是特指性的，因此指定的整体或整体组可包括一或多个其它非 指定的整体或整体组。
在关于生长因子受体结合结构域和整联蛋白结合结构域的特定 描述中，这种结构域包含所述结构域的氨基酸序列加上其它额外的希 望的氨基酸。
还应理解这种结构域可以“基本由”所述结构域的氨基酸序列“组 成”，加上不超过10个、优选不超过5个、更优选不超过4、3、2、 或1个额外的氨基酸。
还应理解这种结构域可以“基本由”所述结构域的氨基酸序列“组 成”，没有任何额外的氨基酸。
对于本发明的目的，“分离的”是指材料已经从其天然状态中分 离或者另外进行人工操纵。分离的材料可以是完全或基本上没有在其 天然状态中正常伴随的成分，或者加以操纵以致于在其人工状态具有 在其天然状态中正常伴随的成分。分离的材料可以是天然的、化学合 成的或重组形式。
如本文所用，“合成的”是指非天然发生的，而是通过人工技术 干涉而产生的。对于合成的蛋白质和核酸而言，这涵盖了通过本领域 熟知的重组、化学合成或组合技术产生的分子。
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。所述氨基酸可以是本领域熟知的 天然或非天然氨基酸，D-或L-氨基酸。术语“蛋白质”还包括并涵 盖了如本领域所通常使用的“糖蛋白”、“脂蛋白”等这种术语。
“肽”是指具有少于50个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是指具有50或更多个氨基酸的蛋白质。
如前所述，本发明在一特殊方面提供了一种分离的蛋白质复合 物，其包含：
(i)一种生长因子或生长因子的能结合关联生长因子受体的至少 一个结构域；和
(ii)玻连蛋白或纤连蛋白的至少一个整联蛋白结合结构域。
如本文所用“生长因子”是指能在体外和/或体内调节细胞生长、 分化、存活和/或迁移的生物活性蛋白。
优选地，所述生长因子选自IGF-I、IGF-II、VEGF和PDGF。
更优选地，所述生长因子选自IGF-I和IGF-II。
然而，本发明还涵盖了调节细胞生长、分化、存活和/或迁移的 其它生物活性蛋白，如表皮生长因子(EGF；Heldin et al.，1981，Science 4 1122-1123)、成纤维细胞生长因子(FGF；Nurcombe et al.，2000，J.Biol. Chem.275 30009-30018)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Taraboletti et al.，1997，Cell Growth.Differ.8 471-479)、骨桥蛋白(osteopontin) (Nam et al.，2000，Endocrinol.141 1100)、血小板反应蛋白-1 (thrombospondin-1)(Nam et al.，2000，如前)、腱生蛋白-C(tenascin-C) (Arai et al.，1996，J.Biol.Chem.271 6099)、PAI-1(Nam et al.，1997， Endocrinol.138 2972)、纤溶酶原(Campbell et al.，1998，Am.J.Physiol. 275 E321)、纤维蛋白原(Campbell et al.，1999，J.Biol.Chem 274 30215)、纤维蛋白(Campbell et al.，1999，如前)或运铁蛋白(transferrin) (Weinzimer et al.，2001，J.Clin.Endocrinol.Metab.86 1806)。
本发明的分离的蛋白质复合物包含能结合关联生长因子受体的 一种生长因子或生长因子的至少一个结构域。
文中“结构域”是指至少能结合关联生长因子受体的生长因子的 一部分或区域。典型地，尽管非特有地，所述关联生长因子受体由一 种细胞表达，所述关联生长因子受体与所述生长因子的至少一个结构 域的结合或连接激发细胞应答如细胞生长、分化、存活和/或迁移。
特别对于IGF-I而言，所述结构域适当地包含第24位氨基酸残 基，其不是亮氨酸残基。
典型地，所述残基是酪氨酸。
特别对于IGF-II而言，所述结构域适当地包含第27位氨基酸， 其不是亮氨酸残基。
典型地，所述残基是酪氨酸。
特别对于IGF-I而言，在一个实施方案中所述结构域由IGF-I的 第1-70位氨基酸组成。
在另一个实施方案中，所述结构域由IGF-I的第4-70位氨基酸 组成。
还应理解本发明的分离的蛋白质复合物的另一种成分至少是玻 连蛋白或纤连蛋白的整联蛋白结合结构域。
这包括并涵盖了能结合αv整联蛋白的VN或FN的任何结构域。
更优选地，所述整联蛋白受体是αvβ3整联蛋白或αvβ5整联蛋白。
如在后文更详细的描述，本发明人显示VN(及相似的FN)的HBD 不是分离的蛋白质复合物的全部生物学活性所必需的。
从前述易于意识到本发明的分离的蛋白质复合物可以是非共价 结合的寡蛋白质复合物、已经共价交联的(可逆或不可逆的)寡蛋白 质复合物或者是合成的嵌合的蛋白质形式。
因此，本发明的一特殊方面提供了合成的嵌合蛋白质形式的分离 的蛋白质复合物，其包含
(i)一种生长因子或生长因子的能结合关联生长因子受体的至少 一个结构域的氨基酸序列；及
(ii)玻连蛋白(VN)或纤连蛋白(FN)，或者VN或FN的至少一个 整联蛋白结合结构域的氨基酸序列。
如本文所用，术语“嵌合蛋白”包含衍生自VN或FN的整联蛋 白受体结合结构域的连续的氨基酸序列及一种生长因子或生长因子 的至少一个受体结合结构域。
尽管不希望受限于任何特殊的理论，但设想所述合成的嵌合蛋白 质能共连接和共激活所述生长因子的关联受体及VN或FN的整联蛋 白受体，从而刺激、诱导、增加或另外促进细胞迁移。
本发明的嵌合蛋白的优势是其易于通过化学合成或重组方式产 生，并期望在体内更加稳定，因为它们不依赖于保持非共价寡蛋白质 复合物中需要的蛋白质之间的相互作用。
在这点上，尽管包含IGF-I的受体结合结构域的分离的蛋白质复 合物也包含IGFBP，但仍设想根据前述作用模式，IGFBP优选地不 存在于IGF-I/VN合成的嵌合体中。
关于VN，如在后文更详细的描述，本发明人显示很可能VN(及 相似的FN)的多阴离子区域是与IGF-II或IGF-I/IGFBP复合物相互 作用所必需的。
参考图7和图8，所述多阴离子区域是成熟VN序列(SEQ ID NO： 2)的第53-64位残基。
根据前文所述，本发明涵盖了合成的嵌合蛋白质的实施方案，其 不包括VN或FN的HBD和/或多阴离子区域。
关于不包括HBD和/或多阴离子区域的VN蛋白质及其氨基酸序 列，这些可以是天然发生的蛋白质如54kD鸡卵黄VN(缺少HBD)或 者可以是通过VN蛋白质或氨基酸序列的缺失、突变或截短而工程化 的，以便不存在HBD和/或多阴离子区域或者至少实质上是无功能的。
为此可利用如蛋白酶解和定点诱变的技术，这些技术为本领域技 术人员所熟知。
在特殊的实施方案中，VN的所述至少一个整联蛋白结合结构域 具有选自如下的一个氨基酸序列：
(i)VN的第1-459位氨基酸残基；
(ii)VN的第1-379位氨基酸残基；
(iii)VN的第1-130位氨基酸残基；及
(iv)VN的第1-52位氨基酸残基。
也可以包括的额外氨基酸序列选自：
(v)VN的第65-459位氨基酸残基；
(vi)VN的第347-459位氨基酸残基；及
(vii)VN的第347-379位氨基酸残基。
前述序列可以组合VN的第1-130位氨基酸残基与VN的第347 -459位氨基酸残基或者组合VN的第1-52位氨基酸残基与VN的 第65-459位氨基酸残基使用。
特别地，包含IGF-1和VN的嵌合蛋白质的非限制性实例如图14 所示。
另外，包含VEGF和VN或者PDGF和VN的嵌合蛋白质的非限 制性实例如图15所示。
优选地，嵌合蛋白进一步包含一个“接头序列”，该接头序列位 于生长因子序列和VN或FN氨基酸序列之间或与其邻近。
在一个实施方案中，所述接头序列包含一或多个甘氨酸残基及一 或多个丝氨酸残基。接头序列的独特实例可选自：Gly4 Ser(SEQ ID NO：4)、Gly4 Ser3(SEQ ID NO：5)和(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO：6)，但不限 于这些序列。
在另一个实施方案中，所述接头序列包括一个纤溶酶切割识别位 点，如序列Leu Ile Lys Met Lys Pro(SEQ ID NO：7)。
在又一个实施方案中，所述接头序列包括一个胶原酶-3切割识别 位点，如序列Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys(SEQ ID NO：8)。
本发明还扩展至本文例证的本发明的合成的嵌合蛋白质的生物 活性片段的应用和/或特殊的生长因子受体结合结构域和整联蛋白结 合结构域的生物活性片段的应用。
在一个实施方案中，所述“生物活性的片段”具有不少于其衍生 自的蛋白质的生物活性的10％，优选地不少于25％，更优选地不少 于50％，更优选地不少于75、80、85、90或95％。
在另一个实施方案中，所述“生物活性片段”具有其衍生自的蛋 白质的不少于10％、优选地不少于25％、更优选地不少于50％、更 优选地不少于75、80、85、90或95％的连续的氨基酸序列。
VN的生物活性片段的特异实施例，例如缺少HBD和/或多阴离 子结构域的片段，如图14所示。
本发明还涵盖了本发明的变体蛋白质复合物。
典型地及就蛋白质而言，“变体”蛋白质具有已经用不同的氨基 酸置换的一或多个氨基酸。本领域熟知一些氨基酸可以改变为具有普 遍相似性质的其它氨基酸而不改变该蛋白质的活性性质(保守取代)。
应意识到提及的序列如生长因子、生长因子的受体结合结构域、 VN或FN的整联蛋白结合结构域、IGFBP的一或多个氨基酸残基或 者合成的嵌合蛋白中存在的一或多个相应的残基可以被修饰或缺失， 或者加入额外的序列，而实质上不改变本发明的分离的蛋白质复合物 的生物学活性。
本发明涵盖的成熟VN(SEQ ID NO：2)中的特异性突变包括：(i) T50A、(ii)T57A、(iii)T50E、(iv)T57E、(v)S378E、(vi)S378A及(vii) S362E。
在一个实施方案中，蛋白质变体呈现与参考氨基酸序列具有至少 70％、优选地至少80％及更优选地具有至少90％、95％、98％或99％ 序列相同性。
优选地，序列相同性是在参考序列的至少60％、优选地至少75％、 更优选地至少90％或者更优选地至少95％、98％或基本全长序列之上 测定的。
为确定序列相同性百分比，氨基酸和/或核苷酸序列的最佳排列 对比可以通过算法的计算机执行进行(Intelligenetics的Geneworks程 序；Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0的GAP，BESTFIT， FASTA，及TFASTA(Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)，在此并入参考)或者通过检查和通过任何选择的 各种方法产生的最佳对比(即在对比窗上产生最高的同源百分比)进 行。也可以参考BLAST程序家族，如在此并入参考的Altschul et al.， 1997，Nucl.Acids Res.25 3389所述。
在另外的实施例中，“序列相同性”是指通过DNASIS计算机程 序(Version 2.5 for windows；得自Hitachi Software engineering Co.， Ltd.，South San Francisco，California，USA)计算的“匹配百分比”。
关于序列分析的详细论述可见于Unit 19.3 of CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel et al.(John Wiley & Sons Inc NY，1995-1999)。
本发明还涵盖了生长因子的受体结合结构域、VN或FN的整联 蛋白结合结构域或者包含其的分离的蛋白质复合物的衍生物。
如本文所用，本发明的“衍生的”蛋白质已经被加以改变，例如 通过本领域熟知的添加、缀合或复合其它化学成分或者通过翻译后修 饰技术加以改变。
氨基酸的“添加”可包括多肽或其变体与其它多肽或蛋白质的融 合。所述其它蛋白质可以例如有助于蛋白质纯化。例如，这些包括多 组氨酸标记、麦芽糖结合蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)、蛋白A或谷胱 甘肽S-转移酶(GST)。
本发明涵盖的其它衍生物包括但不限于侧链的修饰、非天然氨基 酸的掺入和/或其在肽、多肽或蛋白质合成期间的衍生物及交联剂和 对本发明的多肽、片段和变体施加构象影响的其它方法的应用而产生 的衍生物。本发明涵盖的侧链修饰例如包括通过用乙酸酐酰化对氨基 的修饰、用丁二酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基酰化、用甲基亚氨逐 乙酸酯脒化(amidination)、用氰酸盐对氨基氨甲酰化；用吡哆醛-5- 磷酸对赖氨酸哆醛化(pyridoxylation)，随后用NaBH4还原；通过与醛 反应进行还原烷化随后用NaBH4还原；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS) 对氨基进行三硝基苯化。
羧基基团可以例如通过脂酰基异尿素(O-acylisourea)形成进行碳 二亚胺活化修饰，随后衍生化而修饰为相应的酰胺。
精氨酸残基的胍基团可以通过与试剂如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛 和乙二醛形成杂环浓缩产物而修饰。
巯基基团可以通过如下方法修饰：过甲酸氧化为半胱磺酸；使用 4-氯汞苯基磺酸、4-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基酚、苯基汞氯化物 及其它汞剂形成汞衍生物；混和的二硫化物与其它硫醇化合物的形 成；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应；用碘乙 酸或碘乙酰胺羧甲基化；及在碱性pH下用氰酸盐氨甲酰化。
色氨酸残基可以例如通过用2-羟基-5-硝基苯溴化物或磺酰卤化 物对吲哚环烷化或者用N-溴琥珀酰亚胺氧化而修饰。
酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生 物而修饰。
组氨酸残基的咪唑环可以通过用二乙基焦碳酸进行N-乙酯化 (N-carbethoxylation)或者用碘乙酸衍生物烷化而修饰。
在肽合成期间掺入非天然的氨基酸和衍生物的实例包括但非限 于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、4-氨基-3- 羟基-6-甲基庚酸、t-丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、 鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
适于蛋白质化学衍生的方法的一个实例在CURRENT PROTOCOLSIN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan et al.，John Wiley & Sons NY(1995-2001)，第15章中提供。
分离的蛋白质复合物及其单独的蛋白质成分(包括片段、变体、 衍生物和同源物)可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法制 备。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质通过化学合成方法产生。化 学合成技术为本领域所熟知，可参见CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan et.al.，John Wiley & SonsNY (1995-2001)，第18章就适当的方法学所举例说明。
在另一个实施方案中，蛋白质可以作为重组蛋白质制备。
重组蛋白质的产生为本领域所熟知，技术人员可参考例如 Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，1989)所述，特别是在第16和17章节所述； CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel et al.，(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，特别是在第10和16章所 述；及CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan et al.，(John Wiley & Sons，Inc.1995-1999)，特别是在第1、5和6章所 述，以上内容在此均并入参考。
在一个实施方案中，重组蛋白质是通过包括如下步骤的方法产生 的：
(i)制备包含编码所述蛋白质的核酸的表达构建体，所述核 酸可操纵地与表达载体内一或多个调节核苷酸序列连 接；
(ii)用所述表达构建体转染或转化宿主细胞；和
(iii)在所述宿主细胞内表达重组蛋白质。
“表达载体“可以是自身复制染色体外载体如质粒，或者整合进 宿主基因组内的载体。
“可操纵地连接”是指所述调节核苷酸序列相对于本发明的重组 核酸定位，以起始、调节或另外控制核酸的转录，或者由所述核酸编 码的蛋白质的翻译。
调节核苷酸序列通常适于用于表达的宿主细胞。本领域已知多种 宿主细胞的众多类型的合适的表达载体及合适的调节序列。
典型地，所述一或多个调节核苷酸序列可以包括但非限于启动子 序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、 翻译起始和终止序列、剪接供体/接纳体序列及增强子或激活子序列。
组成型启动子(如CMV、RSV、腺病毒、SV40及人延伸因子启 动子)及可诱导的/可抑制的启动子(如tet-可抑制启动子和IPTG-、金 属硫蛋白-或蜕皮激素-可诱导的启动子)为本领域所熟知并涵盖在本 发明内。也应意识到启动子可以是组合一个以上启动子元件的杂交启 动子。
表达构建体也可以包括一个融合配偶体(典型地由表达载体提 供)，以便本发明的重组蛋白质表达为具有所述融合配偶体的融合多 肽。融合配偶体的主要优势是其有助于所述融合蛋白的鉴别和/或纯 化。
熟知的融合配偶体例如包括但非限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、 人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS6)，它们 特别用于通过亲和层析分离融合蛋白。对于通过亲和层析纯化融合蛋 白而言，亲和层析的相关基质分别是谷胱甘肽-、直链淀粉-、及镍- 或钴-缀合的树脂。许多这种基质可以以“试剂盒”形式获得，如用 于(HIS6)融合配偶体的QIAexpressTM系统(Qiagen)及Pharmacia GST纯 化系统。
在一些情况中，所述融合配偶体还具有蛋白酶如Xa因子或凝血 酶的切割位点，这使得相关蛋白酶部分消化本发明的融合蛋白，从而 从中释放本发明的重组多肽。释放的蛋白质然后通过层析分离从融合 配偶体中分离。
本发明的融合配偶体在其范围内也包括“表位标记(epitope tag)”， 表位标记通常是可利用特异性抗体的短肽序列。对于易于获得的特异 性单克隆抗体的表位标记熟知实例包括c-myc、血细胞凝集素和 FLAG标记。
对于表达而言合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞，如大肠杆 菌(Escherichia coli)(例如DH5α)、酵母细胞、利用杆状病毒表达系统 的Sf9细胞、CHO细胞、COS、CV-1、NIH 3T3和293细胞，但非 限于这些细胞。
表达构建体也可以包括一或多个选择标记核苷酸序列，其授予转 化的宿主细胞对选择剂的抗性。用于选择转化的细菌的选择标记包括 bla、kanR和tetR，转化的真核细胞可以通过如潮霉素、G418和嘌呤 霉素标记选择，但非限于这些标记。
关于将遗传物质导入细胞中，术语“转化”和“转染”通常用于 描述将遗传物质导入宿主细胞中。有许多熟知的方法将外源遗传物质 导入宿主细胞中，包括但非限于磷酸钙沉淀、电穿孔、通过脂转染胺 试剂(lipofectamine)、脂转染试剂(lipofectin)及其它亲脂性制剂输送、 DEAE-葡聚糖转染、微粒轰击、显微注射及原生质体融合。
分离的核酸
本发明提供了编码本发明的合成的嵌合蛋白的一种分离的核酸， 包括其变体和同系物。
本文所用术语“核酸”是指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA、 RNAi和包含cDNA及基因组DNA的DNA和DNA-RNA杂交体。
“多核苷酸”是具有80或更多个连续核苷酸的核酸，“寡核苷酸” 则具有少于80个连续的核苷酸。
“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，适当地标记以 例如在Northern或Southern印迹中检测互补的序列。
“引物”通常是单链的寡核苷酸，优选地具有15-50个连续的 核苷酸，其能退火为互补核酸“模板”及以模板依赖性方式通过DNA 聚合酶作用而延伸，所述DNA聚合酶如Taq聚合酶、RNA依赖性 DNA聚合酶或SequenaseTM。
本发明的合成的核酸可以通过本领域熟知的化学合成方法或者 通过利用核酸序列扩增技术的重组方法或者这些方法的组合而产生。
化学合成的引物及寡核苷酸、合成仪及本发明使用的相关技术在 大多数实验室中均可获得或者可以商购。
合适的核酸扩增技术是本领域所熟知的，包括聚合酶链反应 (PCR)和连接酶链反应(LCR)，例如Ausubel等(如前)在第15章所 述；链置换扩增(SDA)，例如美国专利No 5,422,252所述；滚环复制 (RCR)，例如Liu et al.，1996，J.Am.Chem.Soc.118 1587、国际申请 WO 92/01813及国际申请WO 97/19193；基于核酸序列的扩增 (NASBA)，例如Sooknanan et al.，1994，Biotechniques 17 1077所述； 及Q-β复制酶扩增，例如Tyagi et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 5395所述，但非限于这些技术。
优选的核酸序列扩增技术是PCR。
如本文所用，“扩增产物”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产 物。
在本发明的核酸的产生和表达中，还应意识到利用密码子序列丰 余性(redundancy)的优势，由此在此例证的核酸可易于修饰而不改变 其编码的氨基酸序列。
在特殊的实施方案中，核酸可以根据本领域熟知的用于重组表达 的宿主细胞优选的“密码子选择(codon usage)”而优化。这可以有效 地“裁剪”核酸以在特定生物体或其细胞中优化表达，其中优选的密 码子选择影响蛋白质表达。
因此，本发明包括合成的核酸，其与本文例证的核酸同源。
在一个实施方案中，核酸同系物呈现与编码所述任一个合成的嵌 合蛋白质构建体的核酸有至少70％、优选地至少80％、更优选地至 少90％、更优选地至少95％序列相同性。
优选地，序列相同性是在本发明的编码核酸的至少70％、优选地 至少80％、更优选地至少90％、95％或有利地基本全长序列之上测定 的。
在另一个实施方案中，核酸同系物在高度严格条件下与编码所述 任一种合成的嵌合蛋白构建体的核酸杂交。
本文所用术语“杂交”是指至少部分互补的核苷酸序列的配对以 产生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA双链体。如本领域所熟知， 杂交的序列通过互补嘌呤和嘧啶之间的碱基配对而发生。
在这点上，应意识到修饰的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺 苷)和修饰的嘧啶(硫尿嘧啶和甲基胞嘧啶)也参与碱基配对。
本文所用术语“严格性”是指在杂交期间的温度和离子强度条件， 及某些有机溶剂和/或去污剂的存在与否。严格性越高，则需要的杂 交核苷酸序列之间的互补水平越高。
“严格条件”是指在此条件下只有具有高频率互补碱基的核酸将 杂交的那些条件。
在此提及的高度严格条件包括并涵盖了如下条件：
(i)在42℃使用至少大约31％v/v至50％v/v甲酰胺及至少大约 0.01M至0.15M盐进行杂交，并在42℃使用至少大约0.01M至0.15 M盐洗涤；
(ii)在65℃使用1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、 7％SDS进行杂交，及在超过65℃温度使用(a)0.1×SSC、0.1％SDS 或者(b)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS 洗涤大约1小时；
(iii)在68℃或之上用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤大约20分钟。
通常地，洗涤是在Tm＝69.3+0.41(G+C)％-12℃进行。一般 而言，双链DNA的Tm随着错配的碱基数每增加1％则随之降低1℃。
虽然上文加以了描述，但严格条件是为本领域熟知的，如Ausubel 等(如前)在第2.9和2.10章特别是在第2.9.1至2.9.20页的描述。
抗体
本发明还涵盖了本发明的合成的嵌合蛋白包括嵌合蛋白质或其 片段、变体和/或衍生物的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体或 是单克隆抗体。可用于抗体产生、纯化和使用的熟知方法可见于例如 Coligan et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons NY，1991-1994)第2章及Harlow，E.L，Lane，D. Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Cold Spring Harbor Laboratory，1988所述，这两种方法在此均并入参考。
通常地，本发明的抗体与本发明的多肽、片段、变体或衍生物结 合或缀合。例如，所述抗体可包含多克隆抗体。这种抗体可以例如通 过将本发明的多肽、片段、变体或衍生物注射入生产物种中而制备， 以获得多克隆抗血清，所述生产物种可包括小鼠或兔。生产多克隆抗 体的方法为本领域技术人员所熟知。可以使用的方法例如Coligan et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，(如前)及Harlow & Lane，1988，(如前)所述。
代替在生产物种中获得的多克隆抗血清，单克隆抗体可以使用标 准方法产生，所述方法例如在此并入参考的Kohler & Milstein，1975， Nature 256，495所述，或者通过更现代的对其加以修改的方法，例如 Coligan et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(如前) 所述通过使衍生自已经接种了一或多种本发明的多肽、片段、变体或 衍生物的生产物种的脾或其它抗体生产细胞无限增殖化而产生。 本发明在其范围内还包括包含上述多克隆或单克隆抗体的Fc或Fab 片段的抗体。或者，所述抗体可包含本发明的BIXP蛋白的单链Fv 抗体(scFv)。这种scFv可以例如根据美国专利No 5,091,513、欧洲专 利No 239,400或者Winter & Milstein，1991，Nature 349 293的论文分 别描述的方法制备。
标记可以与抗体或抗体片段缔合。
所述标记可选自色原、催化剂、酶、荧光团、化学发光分子、镧 系离子如铕(Eu34)、放射性同位素及直接目测标记。在直接目测标记 情况中，可以使用胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有 机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有信号产生物质的其它囊泡，等等。
用作标记的大量酶在美国专利说明书U.S.4,366,241、 U.S.4,843,000和U.S.4,849,338中加以揭示，在此均并入参考。本发 明中使用的酶标记包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、β- 半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶，等等。所述酶 标记可以单独使用或者与另一种酶在溶液中组合使用。
例如，荧光团可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、oregon绿、异硫氰 酸四甲基罗丹明(TRITL)、别藻蓝蛋白(APC)和R-藻红蛋白(RPE)，但 非限于这些荧光团。
药物组合物
本发明还提供了包含本发明分离的蛋白质复合物包括其变体和 衍生物的药物组合物。
这种分离的蛋白质复合物可以是在体外形成的任何形式的多蛋 白质复合物或者是本发明的合成的嵌合蛋白质，但非限于这些形式。
本发明的药物组合物可用于促进或另外便于细胞迁移、组织再生 和伤口愈合。或者，可以给予药物组合物以通过防止或抑制肿瘤细胞 迁移至另一部位而防止肿瘤转移。
所述组合物可根据需要用于治疗性或预防性处理中。例如，药物 组合物可以治疗剂或化妆品形式应用，以用于皮肤修复、伤口愈合、 烧伤愈合及其它皮肤病学治疗。
在这点上，药物组合物可以与生物材料、生物聚合物、无机材料 如羟磷灰石或其衍生物、外科植入体、修补物、伤口或烧伤敷料、敷 布、绷带或其他材料联合应用或者作为其一种成分而应用，所有上述 材料适当地被所述药物组合物浸渍、包被或以其他方式包含所述药物 组合物。
适当地，所述药物组合物包含一种适当的药物可接受载体、稀释 剂或赋形剂。
优选地，所述药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂适于给予哺乳 动物，优选地给予人体。
“药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可安全用于全身给 予的固体或液体充填物、稀释剂或形成胶囊的物质。根据给予的特殊 途径，可以使用本领域熟知的多种载体。这些载体可以选自糖、淀粉。 纤维素及其衍生物、麦芽、凝胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、 多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐如无机酸盐 包括氢氯酸盐、溴化物和硫酸盐、有机酸如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸 盐及无致热原水。
描述药物可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考是 Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA， 1991)，在此将其并入参考。
可以应用任何安全的给予途径为患者提供本发明的组合物。例如 可以应用口服、经直肠、非肠道、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌 内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮等途径。
剂型包括片剂、分散剂、悬浮液、注射剂、溶液、糖浆、药片、 胶囊、栓剂、气雾剂、经皮贴片等。这些剂型还可包括为此目的特别 设计的注射或植入的控制释放的设备或者修改的以此方式作用的其 它形式植入体。治疗剂的控制释放可以通过例如用疏水性聚合物包括 丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙二醇酸、及某些纤维素 衍生物如羟丙基甲基纤维素包被而影响。另外，所述控制释放可以通 过使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球而实现。
上述组合物可以与剂型配方相适合的方式给予，并且是以药物有 效量给予。在本发明中给予患者的剂量应足以在一段适当时期在患者 体内达到有益的应答。给予的制剂的量可以由研究人员根据治疗对象 的年龄、性别、体重及其一般健康状况而决定。
关于伤口愈合的药物组合物特别参见于在此并入参考的美国专 利5,936,064及国际公开WO99/62536所述。
本发明的药物组合物还可以包括表达载体如病毒载体如牛痘及 用于基因治疗中的病毒载体。后者包括腺病毒和腺病毒相关病毒 (AAV)，如Braun-Falco et al.，1999，Gene Ther.6 432所述；逆转录病 毒和慢病毒载体，如Buchshacher et al.，2000，Blood 95 2499所述；及 衍生自单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的载体。内分泌基因治疗中应用的 病毒载体的综述见Stone et al.，2000，J.Endocrinol.164 103所述。
本发明还可以利用将基因表达靶定于表皮细胞的特异性表达载 体，如美国专利5,958,764所述，及体内伤口愈合应用，如美国专利 5,962,427所述。
治疗应用
本发明提供了使用本发明的分离的蛋白质复合物包括合成的嵌 合蛋白质的治疗方法。这些方法特别针对于治疗性和/或预防性处理 哺乳动物，优选人。
然而，本发明的治疗应用也可以用于哺乳动物如驯养动物和宠 物、工作动物如马、骆驼和灰狗(greyhound)、家畜、实验动物及用 作异种移植的细胞、器官和组织来源的动物。
本发明还涵盖了化妆品处理方法，其中给予本发明的分离的蛋白 质复合物包括合成的嵌合蛋白质以改良或增强皮肤性质或皮肤表观。
这种处理可包括防止或矫正皮肤病变如皮肤细胞异常增殖所致 的银屑病和肥大性疤痕。
或者，所述处理方法涵盖了通过阻断肿瘤细胞迁移至另外的部位 而防止或抑制肿瘤转移。另外，本发明还涵盖了通过阻断细胞增殖而 治疗癌症的方法。
在特殊的实施方案中，治疗性或预防性处理可使用本发明的分离 的蛋白质复合物，包括与生物材料、生物聚合物、无机材料如氟羟磷 灰石、外科植入体、修补物、伤口或烧伤敷料、敷布、绷带或者其他 材料一起使用或者作为上述材料成分的本发明的合成的嵌合蛋白，所 有上述材料适当地被所述分离的蛋白质复合物浸渍、包被或另外包含 所述分离的蛋白质复合物。
这种方法包括如上述给予药物组合物，并可以经由显微针注射进 特异的组织部位(如美国专利6,090,790所述)、局部乳液、洗剂或用 于伤口、烧伤或溃疡的密封敷料(如美国专利6,054,122所述)、或释 放所述组合物的植入物(如国际公开WO99/47070所述)。
在这点上也可以应用基因治疗，如根据美国专利5,929,040和美 国专利5,962,427所述方法进行。
还有这样的方法，通过这种方法皮肤细胞可以针对产生皮肤替代 品而加以遗传修饰，如通过遗传工程化希望的生长因子表达而实现 (Supp et al.，2000，J.Invest.Dermatol.114 5)。这个领域的综述的实例 见Bevan et al.，Biotechnol.Gent.Eng.Rev.16 231所述。
本发明还涵盖了用转染的或转化的细胞“接种”一个受体，如国 际公开WO99/11789所述。
这些方法可用于刺激细胞迁移并从而便于或促进伤口或烧伤愈 合、皮肤损伤如溃疡的修复、组织置换和移植如通过体外培养自体皮 肤而进行、内脏如肾和肺的再上皮化及损伤的神经组织的修复。
皮肤置换治疗在本领域已经熟知，可以应用共培养的上皮/角质 细胞系，例如Kehe et al.，1999，Arch.Dermatol.Res.291 600所述，或 者应用在体外培养的原始(通常是自体的)表皮、真皮和/或角质细 胞。这些技术也可利用工程化的生物材料及合成的聚合物“支架”。
此领域综述的一般实例参见Terskikh & Vasiliev，1999，Int.Rev. Cytol.188 41和Eaglestein & Falanga，1998，Cutis 62 1所述。
更特别地，颅面外科中使用的置换口腔粘膜的产生见Izumi et al.， 2000，J.Dent.Res.79 798.所述。胎儿角质细胞和皮肤成纤维细胞可以 在体外扩展产生进行移植的皮肤以治疗皮肤损伤，如Fauza et al.，J. Pediatr.Surg.33 357所述，在体外在透明质酸衍生的生物材料上培养 的来自真皮和表皮元素的皮肤替代品已经显示出在烧伤治疗中的潜 在用途(Zacchi etal.，1998，J.Biomed.Mater.Res.40 187)。
本发明还涵盖了聚合物支架以便于置换皮肤工程化，例如 Sheridan et al.，2000，J.Control Release 14 91和Fauza et al.，1998，(如 前)所述，作为微球体制剂以将皮肤细胞输送至伤口和烧伤处 (LaFrance & Armstrong，1999，Tissue Eng.5 153)。
激动剂和拮抗剂的产生
本发明涵盖了本发明的分离的蛋白质复合物包括合成的嵌合蛋 白在鉴别、筛选、设计或另外产生包含生长因子和玻连蛋白或纤连蛋 白的复合物如IGF-II：VN或IGF-I：IGFBP：VN复合物的激动剂或拮抗 剂中的应用。这种制剂可以是“模拟物(mimetic)”。在此所用术语“模 拟物”是指设计为与蛋白质或肽的特殊功能性区域相似的分子，在其 范围内包括术语“激动剂”、“类似物”和“拮抗剂”，这是为本领域 所熟知的。
在一个实施方案中，产生了模拟通过IGF-II：VN或 IGF-I：IGFBP：VN复合物而发生的IGF-IR与VN受体结合的激动剂。 这种分子可用作如在伤口愈合、皮肤再生等情况中需要的细胞迁移的 刺激剂。
在另一个实施方案中，产生了防止或抑制通过IGF：VN或 IGF：IGFBP：VN复合物而发生的IGF-IR与VN受体结合的拮抗剂。这 种分子可用作细胞迁移和/或细胞增殖的抑制剂，并从而可作为有效 的抗肿瘤制剂，也可以用于细胞异常增殖所致的皮肤疾病如银屑病和 肥大性疤痕的治疗中。
前述模拟物、激动剂、拮抗剂和类似物可以是经由希望的生物活 性和半衰期的肽、多肽或其它有机分子，优选小的有机分子。
计算机辅助的结构数据库搜索愈加用作鉴别模拟物的程序。数据 库搜索方法在原则上可适于鉴别模拟物，可见于国际公开WO 94/18232(针对产生HIV抗原模拟物)、美国专利No.5,752,019及国 际公开WO 97/41526(针对EPO模拟物)所述，在此这些文献均并入 参考。
其它方法包括多种生物物理学技术，其鉴别分子的相互作用。这 些技术可以筛选候选分子，根据所述候选分子例如是否影响 IGF-IGFBP-VN复合物的形成而定。可潜在应用的方法如竞争性放射 配体结合分析(见Upton et al.，1999，(如前)的相关方法)、分析性超 速离心法、微量量热法、表面胞质基因组共振和基于光学生物传感器 方法在CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan et al.，(John Wiley & Sons，1997)的第20章提供，在此并入参考。
为了使本发明更易于理解并付诸于实践，技术人员可参考如下非 限制性实施例。
实施例
实施例1
材料和方法
细胞培养
将MCF-7(ATCC编号HTB-22)人乳腺癌细胞系在含有10％FCS 的DMEM/Hams′F12(DMEM/F12)培养基(1∶1)(Life Technologies， Mulgrave，VIC，Australia)中生长。每日更换一次培养基，并使用0.25％ 胰蛋白酶/0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(Oxoid，Hampshire， England)传代细胞至80％铺满。
HaCAT人体皮肤角质细胞系得自Prof.Norbet Fusenig(German Cancer Research Center(DKFZ)Im Neuenheimer Feld，Heidelberg)。将 HaCAT细胞系在含有10％FCS的DMEM培养基(Life Technologies) 中生长。每日更换一次培养基并使用0.25％胰蛋白酶/0.5mM EDTA 溶液(Oxoid)传代细胞至80％铺满。
IGF与VN和IGFBPS的预结合
检测细胞功能的大多数体外分析在溶液中加入外源因子，因此在 整个分析中细胞沐浴在含有所述物质的溶液中。这不是细胞在体内遇 到的环境。当然，组织中的细胞是由细胞合成的ECM支持和环绕的， 激素和其它因素定位于其中。在这个特别关于生长因子与ECM分子 结合的研究中，应用VN、IGF和IGFBP与组织培养塑胶于24孔平 板中预结合及与12.0μl孔Costar TranswellTM(Costar，New York，NY， USA)的下层腔室和膜表面的预结合的策略，以尝试更精确地反映体 内环境。
将含有300-1000ng VN(Promega，Annandale，NSW，Australia)的 300μl DMEM或DMEM/F12培养基加入24孔组织培养平皿中，或者 加入TranswellTM的下层腔室中，在37℃温育2小时。除去含有未结 合的VN的培养基并将孔用含有0.5％牛血清白蛋白(RIA-级)(BSA) (Sigma Aldrich)的1mL Hepes结合缓冲液(HBB)洗涤。然后向孔中加 入含有1.0％BSA的300μL HBB，在37℃温育30分钟以封闭组织培 养皿中非特异性结合位点。然后将该孔再用含有0.5％BSA的1mL HBB洗涤。然后加入含有0.5％BSA和IGF-II或IGF-I+IGFBP(GroPep， Adelaide，SA，Australia)的300μL HBB，将平板再温育2小时。除去含 有未结合的IGF和IGFBP的溶液，将孔用HBB洗涤并在层流罩中通 风干燥。
迁移分析
基本如Leavesley et al.，1993，Journal of Cell Biology 121：163-70 所述进行迁移分析。将已经在无血清培养基中温育4小时的血清饥饿 的50,000个细胞接种在12.0μm孔Costar TranswellTM的上层腔室中 (12孔平板形式)。将在37℃在5％CO2中温育5小时后已经迁移至多 孔膜的下表面的细胞固定，用0.1mM硼酸盐缓冲液(pH 9)中的结晶 紫染色。贴壁细胞的数目通过提取在10％乙酸中的结晶紫并通过分 光光度测量法确定这些提取物的吸光度而估定。
统计学分析
通过首先将所有数据以与阴性对照(-VN，-IGF，-IGFBP)的百分比 表示而分析数据。然后使用两个加尾的同方差Student t-检验检验相对 于仅有VN的对照组和仅有IGF对照组的反应的显著性。P值小于0.05 表示显著不同的反应。
结果
迁移
细胞迁移是伤口愈合中的关键过程，VN和IGF在细胞迁移的介 导中均有明确的作用。为了研究与VN结合的IGF-II改变HaCAT角 质细胞功能的能力，测定细胞通过Transwell的迁移。
图1显示在存在VN的情况中，存在HaCAT人角质细胞通过 TranswellTM的增强的IGF-II诱导的迁移，尤其在较低浓度时。每个柱 均代表来自3个重复实验的数据，每种处理均一式三份测试。
对乳腺癌细胞系MCF-7的迁移也进行测试。当1μg VN与12.0μm TranswellTM的较低孔预结合时，观测到至下层腔室的迁移增加5倍。 在无VN情况下，1-100ng IGF-II与孔的“预结合”刺激迁移增加2 倍。然而，当1-100ng IGF-II在下层腔室中与1μg VN预结合时， 观测到细胞迁移增加8-10倍(图2)。这些反应是显著高于(p＜0.01) 单独的IGF-II和单独的VN的作用。
[L27]-IGF-II是一种IGF-II类似物，其不结合IGF-IR，IGF-IR是 通过IGF介导的迁移确信被信号化的受体。因此，进行测试与VN预 结合的[L27]-IGF-II刺激MCF-7细胞通过TranswellsTM的迁移能力。 这些实验表明VN-[L27]IGF-II复合物不增强MCF-7迁移超过只用VN 所观测到的水平，迁移水平显著小于(p＜0.01)在应答与VN结合的 IGF-II中所观测到的结果(图3)。这些结果表明与VN预结合的IGF-II 产生的增强的迁移包括IGF-II与IGF-IR的相互作用。
IGFBP是IGF暴露于细胞的关键调节因子。为了确定IGFBP是 否参与在此观测的对VN：IGF-II复合物的迁移应答，使用与IGFBP 很少结合但仍保留与IGF-IR的亲和性的IGF-II类似物进行MCF-7细 胞迁移分析。使用这个类似物des(1-6)-IGF-II的分析表明与天然 IGF-II相比迁移应答无差别，提示IGF-II：VN复合物不依赖于IGFBP 而起作用以增强细胞迁移(图4)。
在图5中，数据显示αv整联蛋白封闭抗体充分降低应答VN和 IGF-II复合物的MCF-7细胞迁移。这些数据表明VN的αv整联蛋白 受体的连接与激活是应答IGF-II：VN复合物的最佳细胞迁移所必需 的。
图6中，在MCF-7细胞迁移分析中检测了与IGF-IR很少结合的 IGF-I类似物L24-IGF-I，数据表明：
(1)L24-IGF-I和IGF-I在存在VN而无IGFBP-5的情况下具有相 同作用；
(2)当存在IGF-I和VN时，IGFBP-5的存在增强了细胞迁移， 但当存在L4-IGF-I和VN时则否。
上述数据提示IGF-IR的激活是在应答IGF-I：IGFBP：VN复合物中 观测到的细胞迁移所必需的，另外需要VN的整联蛋白受体的共连 接。
这个研究的结果首次表明IGF-II：VN和IGF-I：IGFBP：VN复合物 显著刺激细胞迁移。结合这些数据表明VN：IGF复合物与伤口愈合在 功能上相关，并可能确实是乳腺癌发生和发展中的重要因素。另外， 增强的迁移包括IGF-IR及结合VN的整联蛋白受体均被激活。如果 确实如此，VN：IGF复合物确实促进细胞迁移及因此的乳腺癌细胞的 转移，针对抑制VN：IGF复合物形成或者生长因子与整联蛋白受体共 激活的药物可被证实是高效的治疗剂。
实施例2
材料和方法
卵黄玻连蛋白的纯化
卵黄玻连蛋白(VN)使用Nagano et al.，1992，The Journal of Biological Chemistry 267：24863-24870所述方法的修改方法进行纯化。 用于这一方法的所有溶液的pH均为7.4。将得自鸡蛋的卵黄 (Farmland，Coles-Myer，Toowong，QLD，Australia)悬浮于等体积 的含有2mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的冷磷酸缓冲盐水(PBS)(0.16M NaCl，10mM磷酸钠)中，在4℃、18000g离心20分钟。上清(卵黄 浆)在4℃对含有5mM 2-β-巯基乙醇的1mM磷酸钠透析过夜，之后 在4℃、20000g离心20分钟。回收上层固体(低密度脂蛋白(LDL) 部分)并重悬于15ml PBS中。
用3种色谱技术将卵黄VN从LDL部分中纯化出来，这三种技术 为凝胶过滤、Sepharose CL-6B(Amersham Biosciences，Uppsala， Sweden)；羟基磷灰石HTP(Bio-Rad，Richmond，CA，USA)；和 离子交换，Q Sepharose Free Flow(Amersham Biosciences)。
Sepharose CL-6B柱(10ml床体积，柱尺寸：2.5cm内径(ID) ×30cm)在两步中平衡，使用的是(i)含2M NaCl的PE缓冲液(5mM EDTA，10mM磷酸钠)和(ii)含有0.13M NaCl的PE缓冲液。用 PE缓冲液1∶1稀释50ml LDL部分并加样于Sepharose CL-6B柱，从 柱收集未结合的部分，然后分批加至预先用含有0.5M NaCl的10mM 磷酸钠平衡的羟基磷灰石基质。用平衡缓冲液、随后用20ml 10mM 磷酸钠洗羟基磷灰石。然后将所述基质填充进一个柱(1.5cm ID× 8cm)，用200mM磷酸钠洗脱蛋白质，收集10×5ml部分。洗脱部分 用预浇铸聚丙烯酰胺4-20％梯度凝胶(Gradipore，Frenchs Forest， NSW，Australia)、SDS-PAGE(Laemmli，1970)和考马斯亮蓝(G-250， BioRad)染色分析是否存在yVN。使用Bio-Rad低范围分子量标记确 定蛋白质的分子量。
合并相应于预期分子量的yVN(54kDa)的部分，并在4℃对10mM 磷酸钠透析过夜，然后加至预先用10mM磷酸钠平衡的Q Sepharose Fast Flow基质(5ml床体积，柱尺寸：1cm ID×10cm)。用在10mM 磷酸钠中的0.15M NaCl洗柱，并用在10mM磷酸钠中的0.25M NaCl 洗脱yVN。再次如上所述评估所收集部分的分子量。
IGF：VN复合物的制备
如先前所述(Kricker et al.，2003，文献同上)将IGF：VN复合物 预结合于96孔板和TranswellsTM。
结果
图8显示全长(75kDa)血清VN(a)和截短的(54kDa)卵黄 VN(b)之间的相似性。值得注意的主要相似性是这些蛋白质均具有 RGD细胞附着位点和多阴离子区域(推断的IGF结合位点)。值得注 意的主要区别在于卵黄VN缺乏肝素结合结构域。
图9表明存在于洗脱部分中的主要蛋白(泳道E)是具有预期大 小的卵黄VN(54kDa)。注意这一蛋白质用于随后的分析中。
图10证实在IGFBP-3存在下VN与放射标记的IGF-I结合的能力。 因此，该图显示54kD卵黄VN具有与全长卵黄VN相同水平的结合 IGF-I/IGFBP-3的能力。这提示IGF结合位点不是位于肝素结合结构 域中(卵黄VN(54kDa)缺乏该结构域)，并强调了多阴离子位点为 所推断的IGF结合位点。
图11显示出当与IGF-I/IGFBP-3复合时VN(血清或卵黄VN)增 强细胞增殖的能力(由MMT技术测量，评价线粒体脱氢酶活性)高 于无处理的对照、IGF-I/IGFBP-3和仅VN的能力。该图还提示截短 的(54kDa)卵黄VN当与IGF-I/IGFBP-3复合时可刺激与全长VN 所刺激的相同程度的细胞增殖。
图12证实当与IGF-I/IGFBP-3复合时VN增强细胞迁移的能力(经 TranswellTM迁移分析测定)高于无处理的对照、IGF-I/IGFBP-3和仅 VN的能力。因此从该图中可得出从图4中得出的相同结论，即截短 的(54kDa)卵黄VN当与IGF-I/IGFBP-3复合时可刺激与全长VN 所刺激的相同程度的细胞增殖。将这些附图一起考虑，提示截短的 (54kDa)卵黄VN当与IGF-I/IGFBP-3复合时可刺激与用全长 (75kDa)VN所观察到的类似水平的细胞迁移和增殖。
实施例3
以下提供了本发明的合成嵌合蛋白的建议的实施例，它们为 VN：IGF-I嵌合蛋白形式。
图14所示的建议的各种合成嵌合蛋白包括带有或不带有氨基酸 残基修饰的、与IGF-I融合的任何全长或截短形式的VN。另外，本 发明人还建议经或不经各种肽接头将VN和IGF-I进行融合。
另外，包含VN和生长因子如VEGF和PDGF的嵌合蛋白也包含 在本发明内，其特定实施方案如图15所示。
图13所示的用于本文的成熟VN(SEQ ID NO：2)和IGF-I(SEQ ID NO：3)的完整肽序列得自NCBI(登录号分别为NP_0000629和 1BQT)。VN的残基编号是成熟蛋白的，不包括信号肽。
玻连蛋白结构域结构和玻连蛋白配体结合位点分别参见图7和 图8。
全长和截短形式的VN
能够调节细胞迁移的合成嵌合蛋白的一个例子含有全长成熟VN 和IGF-I蛋白。
A)VN(1...459)：IGF-I(1...70)
能够调节细胞迁移的合成嵌合蛋白的另一个例子含有缺失了残 基380-459(C末端80个氨基酸)的成熟VN蛋白。
B)VN(1...379)：IGF-I(1...70)
血清中单体VN以两种形式存在：单链75kDa多肽，或者内源 性裂解的两条链形式的VN，其由经过二硫键与一10kDa较小片段连 接的65kDa大片段组成。最近的研究表明这些形式之间没有功能差 异，提示VN上的C末端80个氨基酸不赋予功能差异(Gibson and Peterson，2001，Biochim Biophys Acta 1545 289-304)。这一点由如下 发现支持，即猪VN丧失了这一C末端，但其功能活性得以保持 (Yoneda et al.，1996，J Biochem(Tokyo)120：954-60)。因此，我们推 荐一种更紧凑的嵌合分子，其含有C末端80个氨基酸截短的VN， 但仍赋予VN的所有功能性质。
另一种嵌合体仅含有与IGF-I连接的VN的生长调节素B结构 域。这一区域含有纤溶酶原激活物-1(PAI-1)、尿激酶纤溶酶原激活 物受体(uPAR)和整联蛋白结合位点(Schvartz et al.，1999，Int J Biochem Cell Biol 31：539-44)。
这一嵌合体不与ECM中的成分如胶原和糖胺聚糖相互作用。其 掺入了VN上残基53-459(连接区，中心β-推进(propeller)结构域 和肝素结合结构域)的缺失：
C)VN(1...52)：IGF-I(1...70)
已经预测VN的连接区在结合凝血酶—抗凝血酶复合物以及 ECM成分胶原中起作用。本文提议的嵌合体含有通过缺失VN上的 残基131-459(中心β-推进结构域和肝素结合结构域)而产生的VN 的生长调节素B结构域和连接区。
D)VN(1...130)：IGF-1(1...70)
在另一个实施例中，VN上的中心结构域是该蛋白质最大的、但 却是在功能方面了解得最少的结构域。但是，据推测在这一结构域中 观察到的β-推进结构可能负责VN的多聚化(Xu et al.，2001，Proteins 44：312-20)。
我们建议缺失这一结构域以产生更小的嵌合体，其保留VN的生 长调节素B结构域内的配体结合区域、多阴离子连接区和多阳离子 肝素结合结构域(HBD)但却不能自我结合。这涉及缺失VN上的残 基131-346(中心β-推进结构域)。
E)VN(1...130，347-459)：IGF-I(1...70)
另一种嵌合体由我们相信能够结合其胞外配体的最紧凑形式的 VN组成。这一蛋白质中VN的中心结构域和C末端80个氨基酸同 时除去。这需要在VN上缺失残基131-346和380-459(分别为中心 β-推进结构域和C末端80个氨基酸)。
F)VN(1...130，347-379)：IGF-I(1...70)
另一个嵌合体的实施例含有C末端截短的VN，其不具备肝素结 合结构域。因此，该蛋白质含有VN的生长调节素B结构域、连接 区和中心β-推进结构域。尽管已有人提示在VN的中心β-推进结构域 内有VN的推定的二级肝素结合位点，Gibson和其它人(Gibson et al.， 1999，J Biol Chem 274 6432-42)证实这些位点是无功能的，并且肝素 结合结构域负责总糖胺聚糖结合活性。因此，这一嵌合体不与肝素和 硫酸乙酰肝素相互作用。这一嵌合体在VN上缺失残基347-459。
G)VN(1...346)：IGF-I(1...70)
VN和IGF-I上的残基修饰
VN可以被酪蛋白激酶II(CK2)在残基T50和T57处磷酸化以促 进细胞粘附和扩散。尽管VN的CK2磷酸化的和非CK2未磷酸化的 类似物(分别由VN突变体(T50E，T57E)和(T50A，T57A)模拟) 都结合αvβ3和αvβ5整联蛋白而激活ERK信号途径，但是只有特异 性结合αvβ3整联蛋白的VN的CK2磷酸化类似物激活了磷酯酰肌醇 3激酶(PI3-K)途径(Seger et al.，1998，J Biol Chem 273：24805-13； Seger et al.，2001，J Biol Chem 276：16998-7006)。
据推测是PI3-K途径激活导致细胞粘附和扩散增加。因此我们提 出具有突变的嵌合体，其在结合αvβ3整联蛋白后促进或抑制PI3-K 途径的激活。因此具有VN上T50A和T57A取代的嵌合分子会类似 于CK2未磷酸化VN并且被限制为通过ERK途径(H)进行信号传 导，而具有VN上T50E和T57E取代的合成构建体会模拟CK2磷酸 化VN并且能激活ERK和PI3-K途径，导致改变的胞内信号传导(I)。
H)VN(T50A，T57A)：IGF-I
I)VN(T50E，T57E)：IGF-I
在VN上的残基S378有一cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)磷酸化 位点。已经用PKA磷酸化的和PKA未磷酸化的VN类似物(分别由 VN突变体S378E和S378A模拟)证实这一位点的磷酸化降低了PAI-1 与VN的结合，并因此调节VN在尿激酶系统中的作用(Schvartz et al.， 2002，Arch Biochem Biophys 397：246-52)。
我们因此提出含有VN上的S378E突变以抑制PAI-1结合(J) 和含有VN上的S378A突变以促进PAI-1结合和在嵌合蛋白内稳定 (K)的嵌合体。另外，S378A突变可以增强细胞迁移，因为已经表 明PAI-1与VN的结合抑制整联蛋白介导的细胞迁移(Kjoller et al.， 1997，Exp Cell Res 232：420-9)以及uPAR和整联蛋白介导的在VN上 的细胞粘附(Deng et al.，2001，J Cell Physiol 189 23-33)。令人感 兴趣的是观察到这些发现不依赖于PAI-1作为纤溶酶原激活的抑制剂 的功能。
J)VN(S378E)：IGF-I
K)VN(S378A)：IGF-I
Gechtman and Shaltiel，1997，Eur J Biochem 243 493-501，已经 显示蛋白激酶C(PKC)可以在残基S362磷酸化VN。这一磷酸化减 弱了在VN的肝素结合结构域内发生的VN的纤溶酶裂解。因此，在 这一位点的纤溶酶裂解调节VN对其结合这一区域的配体的亲和性， 并且还调节VN的半衰期。因此我们建议引入一S362E取代以模拟磷 酸化丝氨酸并由此抑制嵌合体被纤溶酶的裂解。
L)VN(S362E)：IGF-I
已经表明IGFBP需要IGF-I上的N-末端3个残基以便以高亲和 性结合这一生长因子(Tomas et al.，1991，J Endocrinol 128：97-105)。
因此看起来通过其N末端序列与VN连接的IGF-I不太可能结合 IGFBP。尽管如此，我们还建议一种含有N末端截短的IGF-I的 VN：IGF-I嵌合体以消除IGFBP可以与IGF-I结合的所有机会，由此 抑制VN：IGF-I嵌合蛋白的生物学活性。这一构建体包括缺失IGF-I 上的残基1-3(IGFBP结合区)。
M)VN：IGF-I(4...70)
已有提示VN的多阴离子区负责结合IGF-II和IGFBP。因此我们 建议另一种VN：IGF-I嵌合体，其去除了VN的多阴离子结构域。因 此这一嵌合体可能不能与IGF-II或IGFBP结合。
N)VN(1...52，65...459)：IGF-I(1...70)
VN与IGF-I融合
我们建议VN和IGF-I cDNA可以在表达之前互相融合，可以插入 也可以不插入肽接头序列。多种接头序列已经被用于成功融合蛋白 质，它们通常由甘氨酸和丝氨酸残基和/或蛋白酶裂解位点如凝血酶、 胶原蛋白酶或纤溶酶的裂解位点的组合组成。
接头序列的非限制性例子为：
(i)Gly4Ser(SEQ ID NO：4)；
(ii)Gly4Ser3(SEQ ID NO：5)；
(iii)(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：6)；
(iv)Leu Ile Lys Met Lys Pro(SEQ ID NO：7)；和
(v)Gln Pro Gln Gly LeuAla Lys(SEQ ID NO：8)。
VN与其它肽生长因子的融合
除了将胞外基质蛋白VN与生长因子IGF-I融合之外，我们还建 议将VN与其它肽生长因子融合。具体地，我们建议开发下述嵌合蛋 白(图16)。
A)VN：PDGFα(1...210)(NCBI登录号P04085)
B)VN：VEGF(1...102)(NCBI登录号2VPFE)
我们建议相应的细胞表面受体与整联蛋白相互作用，并且特别是 VN受体与αvβ3整联蛋白相互作用。具体地，已经表明在用PDGF 刺激后，PDGF受体与αvβ3整联蛋白免疫共沉淀(Schneller et al.， EMBO J 16：5600-7)。
也已经证实2型VEGF受体在用其生长因子刺激后与VN受体免 疫共沉淀。
关于这些生长因子的受体与αvβ3整联蛋白相互作用的发现提示 这一相互作用在调节/增强这些细胞表面受体的胞内信号传导途径方 面有重要作用。因此，由上述嵌合蛋白启动的这些受体的共激活和结 合可以诱导与治疗应用相关的广泛的生物学应答。
本说明书的目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限 制于任一个实施方案或具体的特征集合。因此，本领域技术人员应理 解，根据本发明公开的内容，可以对举例的特定实施方案进行各种不 偏离本发明范围的修饰和改变。
本文提及的所有计算机程序、算法及公式、专利和学术论文在此 均并入参考。