一种寡核苷酸标签及其应用.pdf

《一种寡核苷酸标签及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种寡核苷酸标签及其应用.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102732512 A (43)申请公布日 2012.10.17 CN 102732512 A *CN102732512A* (21)申请号 201210099877.1 (22)申请日 2012.04.06 201110087516.0 2011.04.08 CN C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 博奥生物有限公司 地址 102206 北京市昌平区生命科学园路 18 号 申请人 清华大学 (72)发明人 张岩 孙义民 杨萍 张亮 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权。

2、代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种寡核苷酸标签及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种寡核苷酸标签。本发明的 寡核苷酸， 其核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1所示。 实 验证明， 本发明得到的寡核苷酸标签与人基因组 的相似性明显低于对照， 因此本发明标签在基因 芯片中的探针臂、 多种高通量检测技术的接头、 多 种多重检测技术的 “条码” (barcode) 等领域具有 广阔的应用前景。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。

3、 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种寡核苷酸， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 2. 权利要求 1 所述的寡核苷酸在以 RNA 为模板进行 PCR 扩增中的应用。 3. 权利要求 1 所述的寡核苷酸在检测寡核苷酸多态性中的应用。 4. 权利要求 1 所述的寡核苷酸在作为基因芯片中的探针臂中的应用。 5. 权利要求 1 所述的寡核苷酸在作为高通量检测技术的接头中的应用。 6. 权利要求 1 所述的寡核苷酸在作为多重检测技术的条码中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102732512 A 2 1/4 页 3 一种寡核苷。

4、酸标签及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种寡核苷酸标签及其应用。 背景技术 0002 与已知生物基因组序列无相似性 ( 同源性 ) 的寡核苷酸标签 (oligonucleotide tag) 在现代分子生物学应用中扮演越来越重要的作用。例如， 在 RNA 模板特异性 PCR 扩增 (RS-PCR) 中， 就是在反转录中使用了一种 5 端带有一段寡核苷酸标签的反转录引物， 在完 成反转录反应后， 以这段寡核苷酸标签为引物进行PCR扩增， 就可以只扩增RNA的反转录产 物， 而不会扩增污染的基因组 DNA， 实现 RNA 模板的特异性 PCR 扩增， 避免了假阳性的出现。 其中， 所使用的。

5、寡核苷酸标签必须与该生物基因组没有显著的序列相似性。 0003 在 单 核 苷 酸 多 态 性 分 型 (SNP genotyping) 研 究 中，也 经 常 使 用 一 种 “tag-antitag” 系统。即， 在核酸扩增中将每种可能的 SNP 类型和一种特定的寡核苷酸标 签相连接， 这种带有寡核苷酸标签的 SNP 序列将会和 DNA 微阵列或微球上的 tag 互补序列 (antitag) 相结合， 从而判别出是否存在某种类型的 SNP。 0004 与生物基因组无显著相似性的寡核苷酸标签还被广泛应用于基因芯片中的探针 臂和多种高通量检测技术的接头、 多种多重检测技术的 “条码” (bar。

6、code) 等等， 这些现代高 通量检测技术的检测效果高度依赖于所用寡核苷酸标签的质量， 其中衡量寡核苷酸标签质 量的最重要的指标就是该标签与生物基因组的相似性是否足够低， 如果相似性不够低， 就 会出现交叉杂交、 非特异性扩增等问题， 严重干扰这些检测技术的准确性。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供一种与人基因组相似性低的寡核苷酸。 0006 本发明所提供的寡核苷酸， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 0007 上述寡核苷酸在以 RNA 为模板进行 PCR 扩增中的应用也属于本发明的保护范围。 0008 上述寡核苷酸在检测寡核苷酸多态性中的应用也属于本发明的保护范。

7、围。 0009 上述寡核苷酸在作为基因芯片中的探针臂中的应用也属于本发明的保护范围。 0010 上述寡核苷酸在作为高通量检测技术的接头中的应用也属于本发明的保护范围。 0011 上述寡核苷酸在作为多重检测技术的条码中的应用也属于本发明的保护范围。 0012 实验证明， 本发明得到的寡核苷酸标签与人基因组的相似性明显低于对照， 因此 本发明标签在基因芯片中的探针臂、 多种高通量检测技术的接头、 多种多重检测技术的 “条 码” (barcode) 等领域具有广阔的应用前景。 附图说明 0013 图 1 为 PCR 扩增结果。 0014 图 2 为杂交结果 说 明 书 CN 102732512 A 。

8、3 2/4 页 4 具体实施方式 0015 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0016 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0017 实施例 1、 寡核苷酸的制备及验证 0018 通过生物信息学方法得到了一种与人基因组和微生物基因组无显著相似性的寡 核苷酸标签， 并进行了实验验证， 证明了本发明的寡核苷酸标签与人基因组的相似性比目 前广泛使用的寡核苷酸标签更低， 是高质量的寡核苷酸标签序列。 0019 一、 制备 0020 人工合成本发明的寡核苷酸标签tag2， 对照寡核苷酸标签tag2003， 以及GADPH引 物的序列具体如下。

9、 ： 0021 表 1 0022 0023 二、 验证 I 0024 klenow 酶 (Takara 公司 )， hotstar taq(Qiagen 公司 )， DNA 纯化试剂盒 (MN 公 司 )， dNTP mix(10mM)(Takara 公司 )、 dNTP mix(2.5mM)(Takara 公司 )。 0025 以目前被广泛采用的一个寡核苷酸标签 (tag2003) 为对照。 0026 在 5端加标签序列的 9N 随机引物 ( 记作 tag-9N)。随机引物的序列就是 NNNNNNNNN。 0027 1、 方法 0028 步骤 1 ： 以人基因组 DNA 为模板， 合成 5 。

10、端带有 tag 序列的 DNA 0029 人基因组 DNA 为人白细胞的基因组 DNA。 0030 取 1 微克人基因组 DNA， 加入 1 微升浓度为 100mM 的 tag-9N， 灭菌去离子水补齐 至 19 微升。95变性 3 分钟后冰浴 3 分钟。加入以下组分 ： 10klenow buffer2.5 微升， DNTPmix(2.5mM)2.5 微升， klenow 酶 1 微升 ； 混匀后进行反应 ： 37 90 分钟， 70 10 分钟。 0031 所得产物以DNA纯化试剂盒进行过柱纯化， 以去除溶液中残留的tag-9N和盐分等 杂质。 0032 步骤 2 ： 以 tag 为引物，。

11、 进行 PCR 扩增并电泳检测 0033 以上述反应中得到5 端带tag的DNA为模板， 以对应的tag为引物进行PCR反应。 0034 PCR 体系如下 ： 0035 说 明 书 CN 102732512 A 4 3/4 页 5 0036 反应程序 ： 94变性 30 秒 ； 退火 30 秒 ( 退火温度为 tagTM 值 -5 ) ； 72延伸 60 秒。 0037 每个 tag 分别做 20、 25、 30、 35、 40 个循环的 PCR 反应， 产物用琼脂糖凝胶电泳检 测。 0038 2、 结果与分析 0039 实验结果如图 1 所示。该图显示了以 tag 为引物， 分别进行了 20。

12、、 25、 30、 35、 40 个 循环的扩增后， 扩增产物的情况。图中 M 为 DL2000 marker。 0040 从上图可以看出， 本发明所涉及的 tag 在 40 个循环内都没有形成扩增产物， 而目 前被广泛采用的 tag2003 在 35 个循环就开始出现扩增产物。这表明， 本发明所涉及的 tag 与人基因组的相似性要显著低于目前被广泛采用的 tag2003。并且， 本发明所涉及的 tag2 的扩增产物中没有引物二聚体， 表明 tag2 是一种非常优秀的 tag 序列， 它既与人基因组的 相似性非常低， 又非常适合用作 PCR 反应的产物， 可以适用于所有基于寡核苷酸标签的技 术。

13、应用。 0041 三、 验证 II 0042 ( 一 ) 原料 0043 1、 人工合成的 5 端标记有荧光素 TAMRA 的待测寡核苷酸标签， 其中包括本发明新 设计的 tag2， 已知相似性高的标签为人 GADPH 基因引物 ； 已知相似性低的标签为目前被广 泛使用的 tag2003。 0044 2、 点有人基因组 DNA 的基因芯片 ( 博奥生物有限公司定制 )。 0045 3、 杂交缓冲液 ( 购自博奥生物有限公司 ) 0046 ( 二 ) 方法 0047 取人工合成的 5 端标记有荧光素 TAMRA 的待测寡核苷酸标签 1nmol， 加水稀释到 7.5微升， 再加入7.5微升的杂交缓。

14、冲液， 95热变性3分钟(在PCR仪中)， 冰浴骤冷1min， 加入到基因芯片中杂交。 0048 ( 三 ) 结果及分析 0049 基因芯片杂交结果如图 2 所示。从图 2 可看出， GADPH 引物、 tag2003 这两种寡核 苷酸杂交后有信号， GADPH 引物杂交后有显著信号， tag2003 杂交后有微弱信号。本发明新 设计的寡核苷酸 tag2 杂交后无信号。表明本发明新设计的寡核苷酸 tag2 和人基因组没有 相似性， 并且优于目前被广泛采用的寡核苷酸标签 tag2003， 核酸杂交实验结果和基于 PCR 的检测结果相符。 0050 四、 序列比对 0051 利用NCBI的mega。

15、blast程序(http:/blast.nebi.nlm.nih.gov/)， 将表1中的各 说 明 书 CN 102732512 A 5 4/4 页 6 个 Tag 序列与 NCBI 中的人基因组数据库进行比对， 以统计各个 Tag 序列与人基因组的相似 性， 其匹配结果如下 ： 0052 表 2、 与人基因组 blast 结果 0053 0054 上述比对结果是基于数学运算的相似性判断结果， 只能作为参考， 真正的序列相 似情况及其在生物学中的应用潜力还需要如上述实验这样进行实验验证。 说 明 书 CN 102732512 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102732512 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102732512 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102732512 A 9 。