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1、(10)申请公布号 CN 102732489 A (43)申请公布日 2012.10.17 CN 102732489 A *CN102732489A* (21)申请号 201210243809.8 (22)申请日 2012.07.16 C12N 9/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品科学与技术国家 重点实验室 (72)发明人 江波 缪铭 白爱娟 张涛 许婷 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种促进柠。
2、檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶 的调控方法 (57) 摘要 一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶 的调控方法， 属于食品生物技术领域。本发明提 供一种诱导柠檬明串珠菌发酵分泌交替蔗糖酶 的方法， 以柠檬明串珠菌 (Leuconostoccitreum) SK24.002 为出发菌株， 经斜面培养和种子培养 后， 接种在发酵培养基中， 经采用温度、 pH 与碳源 协同控制策略， 实现提高交替蔗糖酶产量的目标， 发酵液和菌体中的最终总酶活力达到 510-960U/ L。 本发明的优点是能有效提高交替蔗糖酶产量及 生产强度， 并减少发酵液中杂蛋白的含量， 提高了 下游提取时的效率， 生产费用降低， 。
3、能耗减少， 有 利于工业化规模生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法， 其特征在于步骤为 ： （1） 菌体高密度生长阶段 ： 以柠檬明串珠菌 (Leuconostoc citreum)SK24.002 为出发 菌株， 控制发酵液中葡萄糖浓度水平， 初始葡萄糖浓度为 10g/L， 发酵 4h 后开始流加葡萄 糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度控制在 15-20g/L， 发酵温度控制在 22-25， 发酵 pH 。
4、控制在 6.0， 发酵 17-24h 后停止流加葡萄糖溶液， 补料生长阶段结束 ； （2） 糖酶高效表达阶段 ： 补料生长阶段结束之后调节发酵温度控制在 28-30， pH 控制 在 5.4， 每隔 6-10h 补加质量浓度 60% 的蔗糖溶液， 控制发酵液中的蔗糖浓度为 5-10g/L， 两 阶段共计 48h 后结束发酵 ； 发酵培养基组成以 g/L 计 ： 葡萄糖 10， 酵母粉 5-10， 胰蛋白胨 5-10， K2HPO4 5-10， MgSO47H2O 0.2-0.5， MnSO4H2O 0.01-0.015， CaCl2 0.02-0.025， 吐温 80 1-5mL/L， pH 。
5、6.8-7.0。 2. 根据权利要求 1 所述方法， 其特征在于交替蔗糖酶在发酵液和菌体中的最终总酶活 力达到 510-960 U/L。 权 利 要 求 书 CN 102732489 A 2 1/2 页 3 一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法 技术领域 0001 本发明涉及一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法， 属于食品生 物技术领域。 背景技术 0002 交替蔗糖酶 （alternansucrase） 是一类催化葡糖基特异性转移的新型糖酶， 属于 水解酶 GH70 家族， 它催化蔗糖发生聚合反应产生功能性葡聚糖， 该类碳水化合物不仅具有 免疫抗癌作用， 预防高血压、。
6、 动脉硬化， 有助于减肥， 还可以用作代血浆、 凝胶过滤剂、 优质 凝胶等。 0003 目前， 国内外对交替蔗糖酶的研究工作停留在野生菌的筛选及酶学性质的研究阶 段， 而对柠檬明串珠菌优化发酵提高交替蔗糖酶产量的制造过程仍处于起步阶段。 因此， 在 前期研究基础上， 本发明人利用分离筛选的一株柠檬明串珠菌 SK24.002 菌株进行发酵产 酶， 同时通过控制温度、 pH 和碳源来调节菌体生长与糖酶的分泌表达， 最终提高交替蔗糖酶 产量。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法。 利用本发明可以提高交替蔗糖酶的产量及生产强度， 有利于工业化规模生。
7、产。 0005 本发明所使用的柠檬明串珠菌是本发明人先前从传统发酵泡菜中分离得到， 其分 类名为柠檬明串珠菌 （Leuconostoc citreum） SK 24.002， 已保藏于中国典型培养物保藏中 心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011398。保藏日期 2011 年 11 月 18 日。该菌株已于 2011 年 12 月 28 日申请中国专利， 申请号 2011104464069， 公开号 CN102492644A， 公开日 2012 年 6 月 13 日。 0006 本发明的技术方案 ： 一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法， 步 骤为 ： （1） 菌体高密。
8、度生长阶段 ： 以柠檬明串珠菌 (Leuconostoc citreum)SK24.002 为出发 菌株， 控制发酵液中葡萄糖浓度水平， 初始葡萄糖浓度为 10g/L， 发酵 4h 后开始流加葡萄 糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度控制在 15-20g/L， 发酵温度控制在 22-25， 发酵 pH 控制在 6.0， 发酵 17-24h 后停止流加葡萄糖溶液， 补料生长阶段结束。 0007 （2） 糖酶高效表达阶段 ： 补料生长阶段结束之后调节发酵温度控制在 28-30， pH 控制在 5.4， 每隔 6-10h 补加质量浓度 60% 的蔗糖溶液， 控制发酵液中的蔗糖浓度为 5-10g/ L， 两阶段。
9、共计 48h 后结束发酵。 0008 发酵培养基组成以 g/L 计 ： 葡萄糖 10， 酵母粉 5-10， 胰蛋白胨 5-10， K2HPO4 5-10， MgSO47H2O 0.2-0.5， MnSO4H2O 0.01-0.015， CaCl2 0.02-0.025， 吐温 80 1-5mL/L， pH 6.8-7.0。 0009 交替蔗糖酶在发酵液和菌体中的最终总酶活力达到 510-960 U/L。 说 明 书 CN 102732489 A 3 2/2 页 4 0010 本发明中交替蔗糖酶的活力是以生物催化反应过程中产生果糖的量定义的， 酶活 力 1U 为每 min 产生 1mol 果糖的。
10、量。将酶反应液稀释到合适倍数后过 0.22 m 的纤维 素膜， 然后进行高效液相 （HPLC） 分析， 计算果糖含量 （g/L） 。 色谱条件 ： Sugarpak1钙型阳离 子交换柱 ； Shodex 示差折光率检测器 ； 柱温 ： 85 ； 流动相 ： 超纯水 （经 0.22 m 膜过滤） ； 洗脱流速 ： 0.4 mL/min ； 上样体积 ： 10 L ； 10 mg/mL 的果糖溶液为标准溶液。 0011 本发明的有益效果 ： 利用本发明能大幅度提高交替蔗糖酶的产量， 总酶活力达到 510-960 U/L， 达到国内领先水平。本方法操作简单， 能耗低， 设备简单， 大大降低了生产成 。
11、本， 适于工业化生产。 本发明产品可以用于食品、 化工、 医药以及材料等多个领域， 市场前景 广阔， 经济效益高。 具体实施方式 0012 现结合具体实例进一步阐述本发明， 但本发明保护的内容并不局限于实例。 0013 实施例 1 以柠檬明串珠菌 SK24.002 为研究菌株， 控制发酵液中葡萄糖浓度水平， 初始葡萄糖浓 度为 10g/L， 发酵 4h 后开始流加葡萄糖溶液使其浓度控制在 20g/L， 发酵温度控制在 22， 发酵pH控制在6.0， 发酵24h后停止流加葡萄糖溶液 ； 同时调节温度控制在28， pH控制在 5.4， 每隔10h补加60%的蔗糖溶液， 控制发酵液中的蔗糖浓度为5g。
12、/L， 两阶段共计48h后结 束发酵。 发酵培养基组成以g/L计 ： 葡萄糖10， 酵母粉5， 胰蛋白胨5， K2HPO4 10， MgSO4 7H2O 0.2， MnSO4H2O 0.01， CaCl2 0.025， 吐温 80 1mL/L， pH 7.0。交替蔗糖酶在发酵液和菌体 中的最终总酶活力达到 740 U/L。 0014 实施例 2 以柠檬明串珠菌 SK24.002 为研究菌株， 控制发酵液中葡萄糖浓度水平， 初始葡萄糖浓 度为 10g/L， 发酵 4h 后开始流加葡萄糖溶液使其浓度控制在 15g/L， 发酵温度控制在 25， 发酵pH控制在6.0， 发酵17h后停止流加葡萄糖溶液 ； 同时调节温度控制在30， pH控制在 5.4， 每隔6h补加60%的蔗糖溶液， 控制发酵液中的蔗糖浓度为10g/L， 两阶段共计48h后结 束发酵。 发酵培养基组成以g/L计 ： 葡萄糖10， 酵母粉10， 胰蛋白胨10， K2HPO4 5， MgSO4 7H2O 0.5， MnSO4H2O 0.015， CaCl2 0.02， 吐温 80 5mL/L， pH 6.8。交替蔗糖酶在发酵液和菌体 中的最终总酶活力达到 801 U/L。 说 明 书 CN 102732489 A 4 。