一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用.pdf

本发明涉及一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用，试剂盒由以下试剂组成：4％蔗糖水、10mmol/L NaOH溶液、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液、DMSO、试剂I、试剂II、Hha I内切酶、10×M Buffer。其应用：样本的制备和贮存；抽提基因组DNA；ApoE4基因的PCR扩增；ApoE4基因型的鉴定。与现有技术相比，本试剂盒提供的试剂可以无创获取个体的基因组DNA；高效扩增ApoE4基因，快速准确判定ApoE4的基因型，并可同时进行大量个体的基因型判定；判定时间短、准确性高，适用于分子流行病学和预防医学大规模筛查工作。

1.一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由以下试剂组成：4wt％蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、1mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH 7.5)溶液、分析纯二甲基亚砜(DMSO)、试剂I、试剂II、限制性核酸(Hha I)内切酶、10×M Buffer。 2.根据权利要求1所述的一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由表1所述配比的试剂组成，表1所述的试剂I的组成如表2所示，表2所述的试剂II的组成如表3所示，表3所述的10×M Buffer的组成如表4所示，表4 3.一种如权利要求1所述的特异检测ApoE4基因型的试剂盒的应用，其特征在于，试剂盒的应用的步骤如下：(1)样本的制备和贮存：10mL 4％蔗糖水漱口10s后3000r/min离心5min收集含有颊粘膜上皮细胞的沉淀，获取的标本若在短时间检测可贮存于-20℃，若在长时间检测可贮存于-80℃或液氮中备用；(2)进行ApoE4基因的PCR扩增；(3)ApoE4PCR产物经Hha I酶切后，酶切产物进行15％PAGE电泳；(4)参照Richard方法即可以简化判定ApoE4基因型。 4.根据权利要求3所述的一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒的应用，其特征在于，所述的ApoE4基因在利用PCR扩增，采用5wt％的二甲基亚砜对PCR反应程序进行优化，扩增的退火温度为70℃。

技术领域

本发明属于分子生物学的领域，具体是一种快速、特异性检测ApoE4基因型 的试剂盒及其应用。

背景技术

人类的载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)由19q11.2所编码，其基因常见 有3种表型，即ε2、ε3和ε4等位基因所编码的3种载脂蛋白E2、E3和E4，构 成6种不同的基因型。包括3种纯合子(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和3种杂合子(ε2/ε3、 ε3/ε4、ε2/ε4)。等位基因的改变造成ApoE4对LDL受体亲和力更大，即ApoE4＞ ApoE3＞ApoE2，从而影响脂蛋白代谢及血脂水平，ApoE4/4基因型已作为心脑血 管病发病的独立危险因素。由于ApoE基因与胰岛素抵抗(IR)、肥胖等相关，因此检 测ApoE基因型对医学分子流行病的研究有重要意义。

目前，医学分子流行病检测ApoE4基因型的方法主要是PCR-RFLP，首先从 外周血抽提基因组DNA，选用ApoE外显子4侧翼序列设计引物进行ApoE4的扩 增，Hha I进行酶切，然后对酶切产物进行垂直非变性PAGE进行分离，以确定其 基因型。但是此种方法采样要求高，检测繁琐，不利于流行病学普查的使用，且创 伤性的抽血获得基因组DNA并非被每个个体所接受，尤其是正常对照组的个体。 ApoE外显子4序列GC含量很高，不易扩增，对基因型的检测结果有很大影响， 有必要对扩增条件进行优化。因此，建立一种简单易行、无创伤的抽提基因组DNA， 高效特异性扩增ApoE 4基因片段，快速检测ApoE4基因型的方法对ApoE4基因 型相关的分子流行病学和预防医学的研究有重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种判定时间 短，准确性高的特异性检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由以下试剂组 成：4wt％蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、1mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris) -HCl(pH 7.5)溶液、二甲基亚砜(DMSO)、试剂I、试剂II、限制性核酸(Hha I) 内切酶、10×M Buffer。

所述的试剂盒由表1所述配比的试剂组成，

表1

  序号   试剂名称   浓度/纯度/说明   体积(μL)   1   蔗糖水   4wt％   10000   2   NaOH溶液   10mmol/L   2000   3   Tris-HCl(pH 7.5)溶液   1mol/L   500   4   DMSO   分析纯   12.5   5   试剂I   详见表2   192.5   6   试剂II   详见表3   20   7   Hha I内切酶(TaKaRa公司)   4～12U/μL   10   8   10×M Buffer   详见表4   10

所述的试剂I的组成如表2所示，

表2

  序号   组成成分   总体积(μL)   1   2.0Taq预混合液(TaKaRa公司)   125   2   灭菌水   67.5   合计   192.5

所述的试剂II的组成如表3所示，

表3

所述的10×M Buffer的组成如表4所示，

表4

  序号   组成成分   浓度(mM)   1   Tris-HCl，pH7.5   100   2   MgCl2   100   3   双硫腙   10   4   NaCl   500

一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒的应用，其特征在于，试剂盒的应用的 步骤如下：

(1)样本的制备和贮存：10mL 4％蔗糖水漱口10s后3000r/min离心5min收 集含有颊粘膜上皮细胞的沉淀，获取的标本若在短时间检测可贮存于-20℃，若在 长时间检测可贮存于-80℃或液氮中备用；

(2)进行ApoE4基因的PCR扩增；

(3)ApoE4PCR产物经Hha I酶切后，酶切产物进行15％PAGE电泳；

(4)参照Richard方法即可以简化判定ApoE4基因型。

所述的ApoE4基因在利用PCR扩增，采用5wt％的二甲基亚砜对PCR反应程 序进行优化，扩增的退火温度为70℃。

与现有技术相比，本发明采用无创方法通过简单的碱裂解法方便快捷地获得 口腔黏膜基因组DNA，利用5％DMSO优化PCR程序对ApoE4基因序列进行高效 扩增，迅速获得ApoE4的基因型，判定时间短，准确性高，为ApoE4基因型相关 疾病的分子流行病学和预防医学的研究提供了高效方法。

附图说明

图1为使用本方法获得的9例ApoE4基因型电泳图。

其中：泳道1为DNA分子量标准，本实例中使用的是20bp DNA Ladder Maker； 泳道2、3、4、5、8的ApoE4基因型为ε3/ε3型，共5例不同个体；泳道6的ApoE4 基因型为ε4/ε4型，共1例；泳道7的ApoE4基因型为ε2/ε2型，共1例；泳道9 的ApoE4基因型为ε3/ε4型，共1例；泳道10的ApoE4基因型为ε2/ε3型，共1 例。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

一、试剂盒包含的试剂及说明

本发明所述的试剂盒包含试剂8种，分别为4％蔗糖水、10mmol/L NaOH溶、 1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液、DMSO、试剂I、试剂II、Hha I内切酶、Buffer。 其中，4％的蔗糖水用于颊粘膜上皮细胞的收集，10mmol/L NaOH溶、1mol/L Tris -HCl(pH 7.5)溶液为基因组DNA的提取试剂，试剂I为TaKaRa公司PCR操作试 剂，DMSO为PCR程序的优化试剂，试剂II为基因ApoE4的PCR引物，Hha I内 切酶、Buffer用于基因ApoE4PCR扩增产物的酶切实验。

具体如表1′所示，其中试剂I、试剂II和Buffer的具体组份见表2’-4’。

表1′：本发明试剂盒所包含的试剂

  序号   试剂名称   浓度/纯度/说明   体积(μL)   1   4％蔗糖水   自制   10000   2   NaOH溶液   10mmol/L   2000   3   Tris-HCl(pH 7.5)溶液   1mol/L   500   4   DMSO   分析纯   12.5   5   试剂I   详见表2   205   6   试剂II   详见表3   20   7   Hha I内切酶(TaKaRa公司)   4～12U/μL   10   8   Buffer   详见表4   10

注：本表所列试剂量为10个样本检测

表2′：试剂I的组份

  序号   组成成分   总体积(μL)   1   2.0Taq预混合液(TaKaRa公司)   125

  2   灭菌水   67.5   合计   192.5

表3′：试剂II的组份

上述基因引物可以通过本领域技术人员通过现有基因合成以合成。

表4′：Buffer的组份

  序号   组成成分   浓度(mM)   1   Tris-HCl，pH7.5   100   2   MgCl2   100   3   Dithiothreitol   10   4   NaCl   500

一、操作步骤

本步骤包括样本的制备和贮存、抽提基因组DNA、ApoE4基因的PCR扩增、 ApoE4基因型的鉴定。

(一)样本的制备和贮存

样本来源于个体的蔗糖漱口水，即10mL 4％蔗糖水漱口10s后3000r/min离心 5min收集含有颊粘膜上皮细胞的沉淀。获取的标本若在短时间检测可贮存于-20℃， 若在三日后检测可贮存于-80℃或液氮中备用。

(二)抽提基因组DNA

本方法适用于一个样本的处理，多个样本可同时平行操作。

1.将收集的还有颊粘膜上皮细胞的沉淀移入1.5mL的EP管中。

2.向沉淀中加入200μL 10mmol/L NaOH溶液，震荡15s后100℃碱裂解5min。 室温下3000r/min离心5min。

3.将上清转移入一个干净的1.5mL的EP管中，加入50μL 1mol/L Tris-HCl (pH7.5)中和，-20℃冻存备用。

(三)ApoE4基因的PCR扩增

取上述获得的上清2.5μL用于ApoE4基因的PCR扩增，PCR体系按照表5所 示组份进行配置。

表5：PCR反应体系组份

  试剂名称   体积(μL)   试剂I   19.25   试剂II   2   DMSO   1.25   基因组DNA   2.5   合计   25

按表5配制PCR反应体系后，轻轻混匀，按照表6所示条件同时进行PCR反 应，反应结束后进行HhaI内切酶酶切反应。

表6：ApoE4基因的PCR反应条件

(四)ApoE4基因PCR产物的酶切反应

取上述PCR产物8μL，按照表7所示组份配置酶切反应体系。

表7：酶切反应体系

  试剂名称   体积(μL)   PCR产物   8   Hha I内切酶(TaKaRa)   1   Buffer   1

反应体系配好后轻轻混匀，37℃反应1h，产物进行15％的非变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳。

(五)15％PAGE电泳

1、试剂配制和准备

常规配置15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液等，具体如下：

(1)配置5×TBE溶液：在0.6L蒸馏水中溶解54g Tris碱，加入27.5ml冰乙 酸和20m L 0.5moL/L EDTA溶液(p H8.0)，再加蒸馏水定容至1L，室温保存。

(2)电泳缓冲液(TBE)的配制。取上述5×TBE，加蒸馏水稀释为1×TBE 作为电泳缓冲液。

(3)15％非变性聚丙烯酰胺凝胶配制。按照表8所示比例配制。

表8：制备15％聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积比例

将配制好的凝胶液充分混匀，倒入已组装好的Bio-Rad垂直凝胶电泳仪中，插 入适当大小的梳子，在室温下放置30min左右后进行电泳备用。

(4)加样缓冲液(Loading Buffer)的配制：常规配置6×Loading Buffer。

2、步骤

(1)按比例配制10mL的15％的聚丙烯酰胺凝胶混合液，倒入垂直凝胶电泳 仪的玻璃槽中，插入适当大小的梳子，待凝胶聚合完全后，用1×TBE浸湿的纸巾 包绕梳子和凝胶，保鲜膜密封整块凝胶，4℃保存，直至使用(可保存1-2天，也 可购买商品化的凝胶)。

(2)准备电泳时，将凝胶放入凝胶垂直电泳仪中，组装完毕，配制电泳缓冲 液，并用电泳缓冲液冲洗加样孔。

(3)20bp DNA Ladder Maker 4μL加入孔中作为参照。酶切产物与适量6× Loading Buffer混合，加入上样孔中进行电泳操作。

(4)将电极与电源相连，打开电源，进行电泳。电泳至标准参照燃料迁移至 所需位置，停止电泳。

(5)将凝胶分离，溴化乙锭染色，紫外灯观察拍照，ApoE基因型判定参照 Richard等方法加以简化。

二、方法评定

分别用本实验所述采样方法收集9例个体的颊粘膜上皮细胞，同时平行收集同 一个体的外周血样品200μL，引用同样的方法抽屉基因组DNA，PCR扩增ApoE4 基因，Hha I酶切，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析个体ApoE4的基因型。结 果显示两种样本来源的判定结果完全一致，总辨别符合率为100％，交互辨别负荷 率为100％，灵敏度为100％，特异度为100％，结果如图1。