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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201780008893.6 (22)申请日 2017.01.30 (30)优先权数据 1601558.8 2016.01.28 GB (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2018.07.27 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/GB2017/050232 2017.01.30 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2017/130007 EN 2017.08.03 (71)申请人 绿色生物制品有限公司 地址 英国米尔顿凯恩斯 (72)发明人 艾琳芬尼根 (74)专利代理。
2、机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 关旭颖 (51)Int.Cl. C12P 13/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/02(2006.01) (54)发明名称 用于采用罗旺醋杆菌产生3-羟基丙酰胺的 方法 (57)摘要 本发明描述了用于产生聚合的3-羟基丙酰 胺(3HP酰胺)的方法， 所述方法包括： 在含有磷酸 根和铵的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌， 其 中所述细菌的培养产生聚合3HP酰胺。 然后可以 将聚合3HP酰胺水解为3HP酰胺或转化为其他目 标化合物。 权利要求书1页 说明书9页 附图6页 CN 108699575 A 。
3、2018.10.23 CN 108699575 A 1.一种用于产生聚合的3-羟基丙酰胺的方法， 所述方法包括： 在含有磷酸根和铵的生长培养基中培养罗旺醋杆菌(Acetobacter lovaniensis)细 菌， 其中所述细菌的培养产生聚合3HP酰胺。 2.权利要求1所述的方法， 其中所述生长培养基含有大于0.1克/升的铵。 3.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基含有大于0.5克/升的铵。 4.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基含有0.5至1克/升的铵。 5.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基含有大于1克/升的磷酸根。 6.任一前述权利要求所述的方。
4、法， 其中所述生长培养基含有大于1.5克/升的磷酸根。 7.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基含有1至3克/升的磷酸根。 8.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基含有1至3克/升的磷酸根和0.5 至1克/升的铵。 9.任一前述权利要求所述的方法， 其中在所述生长培养基中氮与磷的重量比为约2:1 至约1:2。 10.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基不含外源性碳源。 11.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述生长培养基具有5至7的pH。 12.任一前述权利要求所述的方法， 其中在10至40的温度培养所述细菌。 13.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述。
5、细菌为具有登录号NCIMB 41808的菌株 FJ1。 14.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述方法还包括从所述生长培养基分离所述 聚合3HP酰胺的步骤。 15.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述方法还包括将所述聚合3HP酰胺水解以形 成单体3HP酰胺的步骤。 16.权利要求15所述的方法， 其中所述方法还包括分离所述单体3HP酰胺的步骤。 17.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述方法还包括将聚合或单体3HP酰胺转化为 其他化合物。 18.任一前述权利要求所述的方法， 其中所述方法还包括将聚合或单体3HP酰胺转化为 3HP酸、 3HP酯、 3-羟基丙胺、 3-羟基丙腈、 丙烯酰胺、。
6、 丙烯胺、 丙烯酸、 烯丙胺、 丙烯腈、 聚胺聚 合物、 聚腈聚合物或其他杂聚物如丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)。 19.任一前述权利要求所述的方法， 所述方法包括： 在含有1至3克/升的水平的磷酸根和0.5至1克/升的水平的铵的生长培养基中培养具 有登录号NCIMB 41808的罗旺醋杆菌菌株FJ1， 其中所述细菌的培养产生聚合3HP酰胺。 20.一种用于产生3HP酰胺的方法， 所述方法包括： 在含有磷酸根和铵的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌， 其中所述细菌的培养产生聚 合3HP酰胺； 和 将所述聚合3HP酰胺水解以产生3HP酰胺。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108699575 A 2。
7、 用于采用罗旺醋杆菌产生3-羟基丙酰胺的方法 发明领域 0001 本发明涉及用于通过在特定生长条件下培养醋杆菌属(Acetobacter)微生物产生 聚合的3-羟基丙酰胺(3HP酰胺)的方法。 聚合3HP酰胺可以转化为3HP酰胺。 生物体经由大气 二氧化碳和氮的同化产生该平台分子。 可以以商业量容易地产生3HP酰胺。 如果需要， 3HP酰 胺可以转化为一系列其他商业上有用的产物如丙烯酰胺和丙烯腈。 0002 发明背景 0003 已经证明多种微生物产生3-羟基丙酸(3HP)(Andreeken,B.和Steinbuchel,A., Applied and Environmental Microb。
8、iology(2010),76,4919-4925)。 3HP以及其他相关羟 基化羧酸和聚链烷酸酯/盐的合成通常在生长限制培养条件下发生(Brigham C.J.等人， S3Microbiol and Biochemical Technology(2011)。 羟基羧酸及其聚合形式(并且特别是 3HP)的生产具有商业意义。 3HP(CAS No.503-66-2)可以在脱水后转化为丙烯酸(CAS No.79-10-7)， 并且因此是有用的平台分子。 0004 使用微生物合成商业上有用的酰胺的先前报道通常涉及采用腈水解酶/腈水合酶 体系通过诸如红球菌属(Rhodococcus)或假单胞菌属(Ps。
9、eudomonas)的细菌水解腈。 这样的 细菌体系用于在工业过程(三菱(Mitsubishi)过程)中由丙烯腈合成丙烯酰胺的良好效果。 然而， 先前并未报道通过微生物从头合成丙烯酰胺、 丙烯腈或前体分子3HP酰胺。 0005 已经报道了两种合成丙烯腈的绿色路线， 即由甘油合成(V.Calvino-Casilda等 人,Green Chemistry(2009) ,11,939-941)和由谷氨酸合成(J.Le Notre等人,Green Chemistry(2011),13,807-809)。 由甘油合成需要化学胺化， 并且当其表示绿色化学时， 其 不是分子或前体的从头合成。 来自生物燃料操。
10、作的甘油的可用性可能是有限的， 并且体现 出在关于 “用于燃料的食物” 的争论中的问题。 同样， 由通过糖过程的副产物如酒糟(来自甜 菜)的发酵产生的谷氨酸合成可能表现出比石油化学当量更大的碳足迹并且是没有优势 的。 0006 WO 2013/011292和WO 2015/118341描述了能够产生长链脂族羧酸和3-羟基丙酸 的酯的微生物。 这些文献涉及被称为罗旺醋杆菌(Acetobacter lovaniensis)FJ1的特定菌 株， 其具有登录号NCIMB 41808(按照布达佩斯条约的规定在2011年1月12日保藏在NCIMB Ltd.(Ferguson Building,Craibs。
11、tone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA)。 发明内容 0007 已经出人意料地发现， 在WO 2013/011292和WO 2015/118341中描述的罗旺醋杆菌 菌株可以产生聚合3HP酰胺。 先前不知道该微生物可以产生该产物。 这表示3HP酰胺(为聚合 3HP酰胺的形式)的从头合成。 另外， 该微生物可以以商业上可行的收率产生3HP酰胺(为聚 合3HP酰胺的形式)。 其然后可以转化为丙烯酰胺和丙烯腈。 0008 本发明涉及用于使用在WO 2013/011292中描述的微生物产生聚合3HP酰胺的方 法。 WO 2013/011292的公开内容以其整体并。
12、入本文。 已经证明该微生物在使用含有磷酸根 和铵的培养基生长时具有产生聚合3HP酰胺的能力。 说明书 1/9 页 3 CN 108699575 A 3 0009 在第一方面， 本发明提供一种用于产生聚合3HP酰胺的方法， 所述方法包括： 在含 有磷酸根和铵的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌， 其中所述细菌的培养产生聚合3HP酰 胺。 0010 上述方法中的聚合3HP酰胺的合成相对于需要首先纯化3HP， 然后胺化以生成丙烯 酰胺或丙烯腈的现有技术具有优势。 另外， 可以由极低成本的原料产生聚合3HP酰胺。 此外， 至含氮原料的路线是直接的， 并且向丙烯酰胺或丙烯腈的转化涉及众所周知的化学过程。 0。
13、011 生物体罗旺醋杆菌FJ1合成聚合3HP酰胺的能力将表现为独特的， 并且该生物体已 经发展了聚合策略以消除3HP酰胺本身的毒性作用。 从经济和安全两个角度来说， 代替当前 可用的作为高毒性且致癌的化学品的单体丙烯腈， 相对安全的聚合物前体的产生是有利 的。 0012 在含有磷酸根的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌。 磷酸根应处于使得能够产生 聚合3HP酰胺的适当水平。 在一些实施方案中， 在含有大于1克/升的磷酸根的生长培养基中 培养罗旺醋杆菌细菌。 1克/升是磷酸根离子(PO43-)在生长培养基中的量而不是含磷酸根化 合物在生长培养基中的量。 例如， 磷酸二氢钾(KH2PO4)具有136的。
14、相对分子量。 其磷酸根部分 具有95的相对分子量。 因此， 如果将136克KH2PO4加入100升水中， 则水中将有1.36克/升 KH2PO4， 但是水中将有0.95克/升磷酸根。 0013 在一些实施方案中， 生长培养基优选含有大于1.1克/升的水平的磷酸根。 在其他 实施方案中， 生长培养基含有大于1.2克/升的磷酸根。 在另外的实施方案中， 生长培养基含 有大于1.3克/升的磷酸根。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有大于1.4克/升的磷酸根。 在一些实施方案中， 生长培养基含有大于1.5克/升的磷酸根。 在其他实施方案中， 生长培养 基含有大于1.6克/升的磷酸根。 在另外的实施方。
15、案中， 生长培养基含有大于1.7克/升的磷 酸根。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有大于1.8克/升的磷酸根。 在一些实施方案中， 生长培养基含有大于1.9克/升的磷酸根。 在其他实施方案中， 生长培养基含有大于2克/升 的磷酸根。 0014 在一些实施方案中， 生长培养基含有小于50克/升的水平的磷酸根。 在其他实施方 案中， 生长培养基含有小于40克/升的磷酸根。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有小于 30克/升的磷酸根。 在多种实施方案中， 生长培养基含有小于20克/升的磷酸根。 在特别的实 施方案中， 生长培养基含有小于15克/升的磷酸根。 在一些实施方案中， 生长培养基含有小。
16、 于10克/升的磷酸根。 在其他实施方案中， 生长培养基含有小于9克/升的磷酸根。 在另外的 实施方案中， 生长培养基含有小于8克/升的磷酸根。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有 小于7克/升的磷酸根。 在一些实施方案中， 生长培养基含有小于6克/升的磷酸根。 在其他实 施方案中， 生长培养基含有小于5克/升的磷酸根。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有小 于4克/升的磷酸根。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有小于3克/升的磷酸根。 0015 在一些实施方案中， 生长培养基含有1至50克/升的水平的磷酸根。 在其他实施方 案中， 生长培养基含有1至40克/升的磷酸根。 在另外的实施方。
17、案中， 生长培养基含有1至30 克/升的磷酸根。 在多种实施方案中， 生长培养基含有1至20克/升的磷酸根。 在特别的实施 方案中， 生长培养基含有1至15克/升的磷酸根。 在一些实施方案中， 生长培养基含有1至10 克/升的磷酸根。 在其他实施方案中， 生长培养基含有1至9克/升的磷酸根。 在另外的实施方 案中， 生长培养基含有1至8克/升的磷酸根。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有1至7克/ 说明书 2/9 页 4 CN 108699575 A 4 升的磷酸根。 在一些实施方案中， 生长培养基含有1至6克/升的磷酸根。 在其他实施方案中， 生长培养基含有1至5克/升的磷酸根。 在另外的。
18、实施方案中， 生长培养基含有1至4克/升的 磷酸根。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有1至3克/升的磷酸根。 在优选实施方案中， 生 长培养基含有约2克/升的磷酸根。 0016 生长培养基中的含磷酸根化合物可以是任何合适的可溶并且使细菌生长和产生 聚合3HP酰胺的化合物。 合适的化合物包括磷酸铵(包括磷酸二氢铵和磷酸氢二铵)、 磷酸钠 (包括磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠和磷酸三钠)、 磷酸钾(包括磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾和磷酸 三钾)、 磷酸钙(包括磷酸二氢钙、 磷酸氢钙和磷酸三钙)、 磷酸镁(包括磷酸二氢镁、 磷酸氢 镁和磷酸三镁)以及磷酸。 磷酸根化合物可以选自磷酸铵(包括磷酸二氢铵和磷酸。
19、氢二铵)、 磷酸钠(包括磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠和磷酸三钠)、 磷酸钾(包括磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾 和磷酸三钾)以及磷酸。 在一些实施方案中， 磷酸根化合物为磷酸铵， 例如磷酸氢二铵。 0017 在含有铵的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌。 已经发现， 仅铵用于引发聚合3HP 酰胺的产生。 硝酸盐、 亚硝酸盐和氮的复合物来源如氨基酸不起作用。 铵应处于使得能够产 生聚合3HP酰胺的适当水平。 在一些实施方案中， 在含有大于0.1克/升的铵的生长培养基中 培养罗旺醋杆菌细菌。 0.1克/升是铵离子(NH4+)在生长培养基中的量而不是含铵化合物在 生长培养基中的量。 例如， 磷酸氢二铵(NH4)2。
20、HPO4-也称为二碱式磷酸铵)具有132的相对分 子量。 其铵部分具有36的相对分子量(2份相对分子量为18的铵)。 因此， 如果将132克(NH4) 2HPO4加入100升水中， 则水中将有1.32克/升(NH4)2HPO4， 但是水中将有0.36克/升铵。 0018 在一些实施方案中， 生长培养基优选含有大于0.15克/升的水平的铵。 在其他实施 方案中， 生长培养基含有大于0.2克/升的铵。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有大于 0.25克/升的铵。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有大于0.3克/升的铵。 在一些实施方 案中， 生长培养基含有大于0.35克/升的铵。 在其他实施方。
21、案中， 生长培养基含有大于0.4 克/升的铵。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有大于0.45克/升的铵。 在特别的实施方案 中， 生长培养基含有大于0.5克/升的铵。 在多种实施方案中， 生长培养基含有大于0.55克/ 升的铵。 在其他实施方案中， 生长培养基含有大于0.6克/升的铵。 在一个优选实施方案中， 生长培养基含有大于0.65克/升的铵。 在另一个优选实施方案中， 生长培养基含有大于0.7 克/升的铵。 0019 在一些实施方案中， 生长培养基含有小于5克/升的水平的铵。 在其他实施方案中， 生长培养基含有小于4克/升的铵。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有小于3克/升的铵。。
22、 在多种实施方案中， 生长培养基含有小于2克/升的铵。 在特别的实施方案中， 生长培养基含 有小于1.8克/升的铵。 在一些实施方案中， 生长培养基含有小于1.6克/升的铵。 在其他实施 方案中， 生长培养基含有小于1.4克/升的铵。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有小于 1.2克/升的铵。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有小于1克/升的铵。 在一些实施方案 中， 生长培养基含有小于0.9克/升的铵。 在其他实施方案中， 生长培养基含有小于0.8克/升 的铵。 0020 在一些实施方案中， 生长培养基含有0.1至5克/升的水平的铵。 在其他实施方案 中， 生长培养基含有0.1至4克/升。
23、的铵。 在另外的实施方案中， 生长培养基含有0.1至3克/升 的铵。 在多种实施方案中， 生长培养基含有0.1至2克/升的铵。 在特别的实施方案中， 生长培 养基含有0.1至1.8克/升的铵。 在一些实施方案中， 生长培养基含有0.2至1.6克/升的铵。 在 说明书 3/9 页 5 CN 108699575 A 5 其他实施方案中， 生长培养基含有0.3至1.4克/升的铵。 在另外的实施方案中， 生长培养基 含有0.4至1.2克/升的铵。 在特别的实施方案中， 生长培养基含有0.5至1克/升的铵。 在一些 实施方案中， 生长培养基含有0.6至0.9克/升的铵。 在其他实施方案中， 生长培养基含。
24、有0.7 至0.8克/升的铵。 0021 生长培养基中的含铵化合物可以是任何合适的可溶并且使细菌生长和产生聚合 3HP酰胺的化合物。 合适的化合物包括磷酸铵(包括磷酸二氢铵和磷酸氢二铵)、 氯化铵、 硫 酸铵和氢氧化铵。 优选地， 含铵化合物不是硫酸铁(II)铵。 在一些实施方案中， 磷酸根化合 物为磷酸铵， 例如磷酸氢二铵。 0022 尽管细菌可以从大气中固定氮， 但是低水平的氮(为铵的形式)诱导3HP酰胺的合 成。 在生长培养基中氮与磷的重量比优选为约3:1至约1:3。 其为氮原子和磷原子的重量之 间的比率(而不是原子数之间的比率)。 例如， 如果将二碱式磷酸铵(NH4)2HPO4)作为氮。
25、(为 铵的形式)和磷(为磷酸根的形式)的唯一来源加入生长培养基， 则氮原子与磷原子的重量 比将是约1:1(NH4)2HPO4)具有132的分子量， 因此氮原子与磷原子的重量比为28/132比31/ 132， 其等于1:1.1)。 在多种实施方案中， 在生长培养基中氮与磷的重量比优选为约2.5:1至 约1:2.5。 在一些实施方案中， 在生长培养基中氮与磷的重量比优选为约2:1至约1:2。 在其 他实施方案中， 在生长培养基中氮与磷的重量比优选为约1.5:1至约1:1.5。 在特别的实施 方案中， 在生长培养基中氮与磷的重量比优选为约1:1。 0023 当在含有铵和磷酸根的培养基中培养时， 合成。
26、3HP酰胺， 并且然后经由类似于肽键 的键将其组装为短的聚合物链。 典型地， 聚合3HP酰胺由2至约15个3HP酰胺的重复单元组 成。 0024 生长培养基可以是任何合适的使罗旺醋杆菌细菌生长和繁殖并且产生聚合3HP酰 胺的生长培养基。 生长培养基可以含有多种成分/养分以使细菌生长和繁殖。 生长培养基可 以含有以下添加剂中的一种或多种： 钾盐、 镁盐、 锰盐、 铁盐、 铜盐、 钴盐、 钠盐、 锌盐、 钙盐、 钼盐、 氯化物、 硫酸盐、 钼酸盐和碳酸盐。 这些添加剂通常以0.01至2克/升存在于生长培养 基中。 0025 在一些实施方案中， 生长培养基可以具有以下指定量的以下添加剂中的一种或多 。
27、种： 0026 成分g/1000ml 二碱式磷酸铵1-10g 氯化钙0.1-1g 氯化镁0.1-1 氯化锰0.01-0.1 氯化铁0.01-0.1 硫酸铜0.01-0.1 氯化钴0.01-0.1 钼酸钠0.01-0.1 氯化锌0.1-1.0 0027 在一个特别的实施方案中， 生长培养基具有以下组成： 说明书 4/9 页 6 CN 108699575 A 6 0028 成分g/1000ml 二碱式磷酸铵2.8 氯化钙1 氯化镁1 氯化锰0.05 氯化铁0.05 硫酸铜0.05 氯化钴0.05 钼酸钠0.05 氯化锌0.5 0029 细菌可以固定二氧化碳。 因此， 除了从大气溶解在生长培养基中的。
28、二氧化碳以外， 生长培养基不需要外源性碳源。 然而， 在一些实施方案中， 在培养细菌之前或在培养期间， 可以将二氧化碳鼓入生长培养基以增加溶解于生长培养基中的二氧化碳的量。 细菌可以使 用二氧化碳作为唯一碳源。 在一些实施方案中， 除了二氧化碳以外不存在碳源。 0030 生长培养基可以具有约5至约7的pH。 优选地， 生长培养基具有约5.5的pH， 其对于 合成聚合3HP酰胺是最佳的。 0031 培养基优选为水性的以使得养分/添加剂溶解于水中。 0032 在0至60的温度培养细菌。 优选地， 在10至40的温度培养细菌。 合成聚合3HP酰 胺的最佳温度为约30。 0033 可以在固定床上培养细。
29、菌， 所述固定床由布置在反应罐中的刚性支架构成， 以使 得层间隔开从而使空气流动至生物体。 可以借助于循环泵和喷杆使生长培养基穿过该床。 一旦细菌聚居于该床， 就可以分批或连续地收集产物。 0034 通过培养罗旺醋杆菌细菌来产生聚合3HP酰胺。 细菌可以是任何合适的能够产生 聚合3HP酰胺的罗旺醋杆菌细菌。 其包括菌株FJ1(具有登录号NCIMB 41808)和与FJ1相关或 衍生自FJ1的类似菌株。 术语 “衍生自” 意指可以使FJ1改性或变异以产生另外的细菌。 例如， 可以从FJ1插入或去除基因。 衍生自FJ1的细菌应在功能上等同于FJ1， 并且应能够产生聚合 3HP酰胺。 另外， 衍生的。
30、细菌应能够在与FJ1相同的条件下生长。 优选地， 细菌是具有登录号 NCIMB 41808的菌株FJ1。 可以通过本领域技术人员熟知的方法， 例如通过使用16S rDNA分 析， 将细菌鉴定为罗旺醋杆菌细菌。 0035 细菌随着其生长而产生聚合3HP酰胺， 因此在细菌培养期间， 聚合3HP酰胺将存在 于生长培养基中。 如果需要， 然后可以提取聚合3HP酰胺。 0036 方法还可以包括从生长培养基分离聚合3HP酰胺的步骤。 这可以以任何合适的方 式进行， 并且多种方法对本领域技术人员将是明显的。 例如， 可以使用蒸馏(包括标准蒸馏、 分馏、 真空蒸馏、 利用夹带剂的蒸馏、 溶剂萃取然后利用蒸馏回。
31、收和连续蒸馏)或薄膜萃取 分离聚合3HP酰胺。 其他分离方法包括膜灌注、 电化学分离、 或使用超临界二氧化碳。 另外， 分离可以通过沉淀(例如， 利用钙)来进行。 0037 方法还可以包括将聚合3HP酰胺水解以形成单体3HP酰胺的步骤。 这可以以任何合 适的方式进行， 并且多种方法对本领域技术人员将是明显的。 说明书 5/9 页 7 CN 108699575 A 7 0038 另外， 一旦聚合3HP酰胺已经水解为单体3HP酰胺， 方法还可以包括分离3HP酰胺。 0039 此外， 方法还可以包括将聚合或单体3HP酰胺转化为3HP酸、 3HP酯、 3-羟基丙胺、 3- 羟基丙腈、 丙烯酰胺、 丙烯。
32、胺、 丙烯酸、 烯丙胺、 丙烯腈、 聚胺聚合物、 聚腈聚合物或其他杂聚 物如丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)。 0040 3HP酰胺单体可以通过用碱处理以去除氨而转化为3HP酸， 和通过还原转化为3-羟 基丙胺和3-羟基丙腈。 这些分子的脱水分别生成丙烯酰胺、 丙烯酸、 烯丙胺和丙烯腈。 备选 地， 作为通过羰基氧连接的3HP酰胺的重复结构的短链聚合3HP酰胺可以顺序地还原以得到 聚胺或聚腈聚合物， 其然后可以水解以释放单体单元。 0041 在一个特别的实施方案中， 提供一种用于产生聚合3HP酰胺的方法， 所述方法包 括： 0042 在含有1至3克/升的水平的磷酸根和0.5至1克/升的水平的铵的生。
33、长培养基中培 养具有登录号NCIMB 41808的罗旺醋杆菌菌株FJ1， 其中细菌的培养产生聚合3HP酰胺。 0043 提供一种用于产生3HP酰胺的方法， 所述方法包括： 0044 在含有磷酸根和铵的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌， 其中所述细菌的培养产 生聚合3HP酰胺； 和 0045 将所述聚合3HP酰胺水解以产生3HP酰胺。 具体实施方式 0046 现在将参照以下附图仅通过举例详细地描述本发明： 0047 图1是细菌培养基的液相色谱-质谱图(使用电喷雾-1)。 其示出具有质量375.7的 相同片段的一系列化合物(4至19)， 所述相同片段表示3-羟基丙酰胺的五聚物(pentomer)。 。
34、0048 图2是3-羟基丙酰胺单体的红外光谱图。 0049 图3是3-羟基丙酰胺单体的1H NMR谱图。 0050 图4示出3-羟基丙酰胺单体的13C NMR谱图。 0051 图5示出3-羟基丙酰胺单体的气相色谱-质谱图。 0052 综述 0053 在降低水平的磷酸根和低水平的添加氮的存在下， 罗旺醋杆菌FJ1产生作为短链 聚合材料的3HP酰胺。 0054 不希望束缚于具体理论， 据认为低水平的添加氮可以诱导酶体系， 所述酶体系导 致在经由羟基丙酸循环的合成后3HP的胺化(Tabita,F.J.PNAS(2009)106,21015-21016； Strauss,G.和Fuchs.G.,Eur。
35、.J.Biochem(1993),215,633-643)。 添加氮不是3HP酰胺形式的 氮的总输出在终产物中为最少10倍高的原因， 并且表明氮固定不被添加的氮源抑制。 该效 果对于含铵盐是特异性的， 并且已经证明硝酸盐和亚硝酸盐是无效的。 通过该生物体经由 固氮酶型复合物的氮的固定导致产生氢(Tamagnini P .等人 ,Microbiology and Molecular Biology Reviews(2002),66,11-20)， 所述氢被生物体的氢化酶体系利用并且 平衡生物体的氧化还原体系。 尽管已经记载了在其他生物体中的碳和氮同化(Levican G. 等人,BMC Geno。
36、mics(2008)581 1186； Dubbs J.M.和Tabita F.R.Fems Microbiol Rev (2004)28,353-356； McKinlay J.B.和Harwood C.S.,PNAS(2010),1073,1-7)， 但是先前仅 已经记录了在厌氧光合细菌如非硫细菌中使用二氧化碳固定作为氧化还原循环机制， 其中 说明书 6/9 页 8 CN 108699575 A 8 二氧化碳经由Calvin Benson Basham循环还原。 醋杆菌属可能能够利用该效果。 尽管不具 有起作用的Calvin Benson Basham循环， 它们确实保留了其遗传成分， 或。
37、者3HP循环用于相 同的效果。 关于此， 用于3HP的依赖质子动力的外流系统可以如在醋酸杆菌(Acetobacter aceti)中所看到的运行(Matsushita K.等人,Bacteriol.(2005),187,4346-4352)。 0055 尚未记载在任何能够合成3HP的细菌中的3HP酰胺的合成。 尽管缺少直接证据， 但 是其可能与同时固定氮以及碳的能力相关。 3HP酰胺将表现为组装成短长度的聚合材料， 并 且这使得能够在转化为丙烯酰胺、 丙烯腈或丙烯酸之前以安全的形式收集产物。 可以通过 蒸发去除水、 在大气压蒸馏以浓缩釜馏物中的产物、 在40和50mBa真空蒸馏、 利用钙或锌 。
38、盐沉淀、 用合适的溶剂萃取或吸附色谱来收集产物。 0056 用于产生3HP酰胺CAS号2651-43-6的方法 0057 在最少盐培养基上生长罗旺醋杆菌FJ1， 其中包含具体地作为铵盐的氮源， 并且其 中氮与磷的重量比为约1:1。 培养基的组成在以下表格中示出： 0058 表1： 用于生长罗旺醋杆菌FJ1的最少盐培养基的组成 0059 成分g/1000ml 二碱式磷酸铵2.8 氯化镁1.0 氯化钙1.0 氯化锰0.05 氯化铁0.05 硫酸铜0.05 氯化钴0.05 钼酸钠0.05 氯化锌0.50 0060 将培养基溶解于水并且过滤。 所使用的水可以是蒸馏水或自来水。 微生物可以在 非无菌条件。
39、下生长。 0061 微生物在固定滴流反应器中生长， 所述固定滴流反应器由惰性材料如聚氨酯泡沫 或木屑的固定但多孔的床构成。 在反应容器中， 惰性床支撑在托盘或其他合适的容器上。 反 应容器包括用于支撑床的罐， 用于收集产物的槽， 和用于经由喷杆使培养基从槽循环回到 反应器顶部的位于槽底部的循环泵。 使用离心空气泵迫使空气进入到床的底部中。 0062 将微生物接种到在摇瓶或其他合适容器中的2升量的培养基中并且生长到A600为 0.75至1.00。 然后将两升的培养基在新鲜培养基中稀释至10升的体积， 并且再次培养到 A600为0.75至1.00。 通过重复分割培养物将培养基的体积增加至所需体积。。
40、 然后将该培养 基在顶部应用于床并且使其向下滴流。 使培养基循环直到槽中的A600降低至低于0.1， 表明 细菌已经固定至床。 然后利用最少盐培养基的10倍浓缩物将床进一步循环七天的时间以使 床被聚居。 在生长期结束时， 将最少盐培养基减少至表1中所示的浓度， 以维持生长并且使 生物体进行生物转化。 监测槽中的材料的A600以确保生物体保持固定于床。 使用与培养基 的循环相连的换热器将床的温度保持在30。 0063 从槽中用过的培养基中收集产物。 可以分批或连续地移出用过的培养基。 可以通 说明书 7/9 页 9 CN 108699575 A 9 过利用钙或锌盐沉淀、 通过在大气压或在真空下蒸。
41、馏浓缩、 膜灌注、 溶剂萃取、 吸附或使用 超临界二氧化碳来收集聚3HP酰胺。 0064 在各种预纯化方法(其包括浓缩或利用钙或锌盐沉淀)后测量回收率。 在该步骤 后， 将材料酸化至pH 2.0， 并且加入合适的催化剂以实现将聚3HP酰胺水解为单体3HP酰胺。 典型地， 利用浓硫酸或浓盐酸将样品酸化至pH 2.0。 加入过氧化氢至2.0的终浓度， 并且 在合适的容器中将样品在回流下在100加热30分钟至一小时。 这实现将聚合材料水解为 单体单元， 然后可以使用高压液相色谱测量所述单体单元。 典型地， 可以使用25cm ODS-H, 4.6mm柱利用90乙醇和10水的流动相等度洗脱3HP酰胺。 。
42、采用0.3ml/min的流速和40 的柱温。 鉴定和定量可以相对于标准物完成， 所述标准物可以从Sigma Aldrich获得。 0065 可以使用利用电喷雾+1或电喷雾-1的LC-质谱鉴定聚合材料。 在培养基、 浓缩培养 基和由水解钙沉淀制备的材料中， 聚合物都呈现为一系列多达12个重复体的短链。 在细菌 培养基的电喷雾-1分析的所示实例(图1)中， 一系列化合物显示质量375.7的相同片段， 其 表示3HP酰胺的五聚物。 聚合物呈现为3HP酰胺的重复体以及可能是制备期间聚合物脱水的 结果的丙烯酰胺两者。 钙沉淀的聚合物和聚合物浓缩物的NMR指示含有丙烯酸状分子但是 缺少CO在约12ppm处。
43、的典型特征的材料。 聚合材料可以水解回单体单元并且通过HPLC分 析； 3HP酰胺标准物和样品材料在柱上共同运行。 当将由浓缩培养基或钙沉淀的水解产生的 材料与氢氧化钠一起加热时， 释放氨并且产生3-羟基丙酸。 0066 可以通过多种技术鉴定酰胺。 红外(图2)示出在1660cm-1处的低频CO以及在 3500cm-1和3100cm-1处的N-H伸缩(NH2的两个和NH的一个)的典型存在。 1H NMR得到NH的5- 8ppm和H-C-C-O的2-2.4的宽可交换信号(图3)。 13C NMR典型地得到CO的160-180ppm的信 号(由于O而去屏蔽)以及没有附接的H的C的最小强度信号特征(。
44、图4)。 1H NMR谱图和13C谱 图两者都与已知标准物的谱图一致。 UV-可见光谱示出来自O孤对电子和反键CO的在约 215nm处的吸收最大值。 质谱是酰胺的典型特征(图5)。 0067 实施例 0068 实施例1： 生物体在添加的铵盐的存在下的生长 0069 当在固定床上生长时， 可以以24小时间隔从分批收回的槽中收集聚3HP酰胺。 使用 体积为1m3、 槽体积为200升、 温度为30、 起始培养基pH为5.5的试验床， 生物体达到30至 50g/l的生产水平。 使用HPLC， 在聚合3HP酰胺材料水解后， 标准物保留9.308分钟， 并且样品 保留9.294分钟。 达到4.95或49.。
45、5g/l的收率， 其等同于大约2g/l/h。 3HP标准物保留8.973 分钟， 并且与水解材料的保留时间不一致。 0070 实施例2： 由3HP酰胺合成丙烯酰胺 0071 将用过的细菌培养基收获并且通过以上详述的方法中的一种浓缩或作为钙沉淀 收集。 然后通过利用浓盐酸或浓硫酸酸化至2.0的pH来水解浓缩培养基或钙沉淀。 然后使用 合适的催化剂以将目前的聚合3HP酰胺材料水解回单体单元。 将所产生的材料进一步浓缩 和脱水。 脱水导致产生丙烯酰胺。 可以使用合适的催化剂体系将所产生的丙烯酰胺进一步 还原为胺。 例如， 1,1,3,1,四甲基硅氧烷和1,2-双(二甲基甲硅烷基)苯是用于铂催化剂的 。
46、有效还原剂(S.Hanada,E.Tsutsumi,Y.Motoyama,H.Nagashima,J.Am.Chem.Soc 2009,131, 15032-15040)。 在THF中在室温利用Tf2O活化然后利用硼氢化钠还原(S.-H.Xiang,J.Xu, H.-Q.Yuan,P.-Q.Huang Synlett.2010,1829-1832)。 说明书 8/9 页 10 CN 108699575 A 10 0072 实施例3： 由3HP酰胺合成丙烯腈 0073 可以使用N ,N-二氢-C-氧-双消除将3HP酰胺脱水为腈 (Acrylamide/ Polyacrylamide:Overvi。
47、ew of the Chemistry(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺： 化学的综述) (1988)pp 9,C.G.Daughton)。 可以使用五氧化二磷作为脱水剂， 尽管也可以使用酸卤化物 或酸酐。 0074 0075 备选地， 可以在温和的氧化性条件下利用三氯异氰尿酸将实施例2中产生的伯胺 进一步转化为丙烯腈(F.-E.Chen,Y.-Y.Kuang,H.-F.Dai,L.Lu,M.Huo,Synthesis 2003, 2629-2631)。 备选地， 可以在非氧化条件下使用钌配合物催化剂将伯胺直接转化为腈(K.- N.T.Tseng ,A.M.Rizzi,N.K.Szymczak,J .Am。
48、.Chem Soc.2013,135,16352-16355； O.D.Pavel,P.Goodrich,L.Cristian,S.M.Coman,V.I.Parvulescu和C.Hardacre, Catal.Sci.Technol.2015,5,2696-2704)。 0076 实施例4： 由3HP酰胺合成丙烯胺 0077 可以使用金属氢化物如LiAlH4或BH3将酰胺形式还原为胺。 腈是在未取代酰胺的还 原中的中间体。 在二甘醇甲醚中， 可以将伯胺定量还原并且在腈时停止。 可以用于相同效果 的其他还原剂是Vitride(NaAlH2(OCH2CH2OCH3)2)、 硼烷四氢呋喃(BH3。
49、.THF)、 硼烷二甲基硫 (CH3)2S:BH3)。 0078 实施例5： 由3HP酰胺合成3HP酸 0079 可以通过在氢氧化钠的稀溶液的存在下加热以释放氨来将3HP酰胺转化为酸形式 3HP。 0080 实施例6： 由3HP酰胺合成丙烯酸 0081 可以通过使用在先前专利如WO 2013/192451或US 8,846,353中详述的技术中的 一种的脱水由3HP产生丙烯酸。 0082 实施例7： 由钙沉淀合成3HP酯 0083 可以通过钙沉淀或浓缩的聚合物的直接甲基化来产生3HP酯如3-羟基丙酸甲酯。 在作为催化剂的硫酸的存在下使沉淀或浓缩物与甲醇反应。 将反应混合物加热至60达60 分钟， 并且通过蒸馏收集甲基化的酯。 说明书 9/9 页 11 CN 108699575 A 11 图1 说明书附图 1/6 页 12 CN 108699575 A 12 图1(继续) 说明书附图 2/6 页 13 CN 108699575 A 13 图2 说明书附图 3/6 页 14 CN 108699575 A 14 图3 说明书附图 4/6 页 15 CN 108699575 A 15 图4 说明书附图 5/6 页 。