本申请是申请日为2013年12月17日、申请号为201380073148.1的发明名称为“植物调控元件及其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的引用
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发明领域
本发明涉及植物分子生物学、植物遗传工程以及可用于调节植物中基因表达的DNA分子的领域。
发明背景
调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传元件。这样的元件包括启动子、前导序列、增强子、内含子和3′非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程的领域中。
发明概述
本发明提供用于植物中的新颖基因调控元件和包含所述调控元件的构建体。本发明还提供包含所述调控元件的转基因植物细胞、植物、植物部分和种子。在一个实施方案中，本发明提供本文所公开的可操作地连接至可转录DNA分子的调控元件。在某些实施方案中，可转录DNA分子相对于本文所提供的调控元件序列是异源的。本文还提供制备和使用本文所公开的调控元件、包含所述调控元件的构建体以及转基因植物、植物细胞、植物部分和种子的方法，所述转基因植物、植物细胞、植物部分和种子包含可操作地连接至相对于所述调控元件为异源的可转录DNA分子的调控元件。
因此，在一个方面，本发明提供包含DNA序列的重组DNA分子，所述DNA序列选自由以下组成的组：a)与SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个具有至少约85％序列同一性的DNA序列；b)包含SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的DNA序列；和c)SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。"异源可转录DNA分子"意指可转录DNA分子相对于DNA序列是异源的。在特定实施方案中，重组DNA分子包含与SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的DNA序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少约95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。在具体实施方案中，异源可转录DNA分子包含农学目的基因，例如能够在植物中赋予除草剂抗性或抗虫性的基因。在另外其它实施方案中，本发明提供包含如本文所提供的重组DNA分子的构建体。
在另一方面，本文提供包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个具有至少约85％序列同一性的DNA序列；b)包含SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的DNA序列；和c)SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其它实施方案中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
在又一方面，本文进一步提供包含重组DNA分子的转基因植物或其部分，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个具有至少约85％序列同一性的DNA序列；b)包含SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的DNA序列；和c)SEQ ID NO:1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在特定实施方案中，转基因植物是相对于起始转基因植物，任一代的子代植物，并且包含重组DNA分子。本发明还提供包含重组DNA分子的转基因种子，其在生长时产生所述转基因植物。
在又一方面，本发明提供通过以下方式在转基因植物中表达可转录DNA分子(例如农学目的基因)的方法：获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物并且栽培所述植物。
本文还提供了通过以下方式提供转基因植物的方法：用本发明的重组DNA分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞并且使所述转化的植物细胞再生以产生转基因植物。
附图简述
图1：显示对应于来自云草(Agrostis nebulosa)的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图1显示包含在调控表达元件组(EXP)EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1)中的2005碱基对(bp)启动子P-AGRne.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:2)与P-AGRne.Ubq1-1:1:5的启动子变体的比对。例如P-AGRne.Ubq1-1:1:5的5’端的缺失产生启动子P-AGRne.Ubq1-1:1:4(SEQ ID NO:6)，所述启动子是包含在EXP-AGRne.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:5)中的999bp序列。示于图1中的另一启动子变体是P-AGRne.Ubq1-1:1:6(SEQ ID NO:8)，其为包含在EXP-AGRne.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:7)中的762bp序列。
图2：显示对应于来自芦竹(Arundo donax)的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图2显示包含在调控表达元件组EXP-ARUdo.Ubq1:1:4(SEQ ID NO:9)中的4114bp启动子P-ARUdo.Ubq1-1:1:4(SEQ ID NO:10)与P-ARUdo.Ubq1-1:1:4的启动子变体的比对。所述比对中包括2012bp启动子P-ARUdo.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:14)；1000bp启动子P-ARUdo.Ubq1-1:1:6(SEQ ID NO:17)；和755bp启动子P-ARUdo.Ubq1-1:1:8(SEQ ID NO:22)。
图3：显示对应于来自芦竹的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图3显示2033bp启动子P-ARUdo.Ubq2-1:1:4(SEQ ID NO:24)与P-ARUdo.Ubq2-1:1:4的启动子变体的比对。所述比对中包括2004bp启动子P-ARUdo.Ubq2-1:1:6(SEQ ID NO:28)；1001bp启动子P-ARUdo.Ubq2-1:1:5(SEQ ID NO:31)；和696bp启动子P-ARUdo.Ubq2-1:1:7(SEQ ID NO:33)。
图4：显示对应于来自格兰马草(Bouteloua gracilis)的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图4显示2371bp启动子P-BOUgr.Ubq1-1:1:2(SEQ ID NO:35)与P-BOUgr.Ubq1-1:1:2的5’端的启动子变体的比对。所述比对中包括1999bp启动子P-BOUgr.Ubq1-1:1:3(SEQ ID NO:39)；1022bp启动子P-BOUgr.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:42)；和760bp启动子P-BOUgr.Ubq1-1:1:6(SEQ ID NO:44)。
图5：显示对应于来自格兰马草的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图5显示2100bp启动子元件P-BOUgr.Ubq2-1:1:4(SEQ ID NO:46)与P-BOUgr.Ubq2-1:1:4的启动子变体的比对。所述比对中包括2043bp启动子P-BOUgr.Ubq2-1:1:7(SEQ ID NO:50)；2002bp启动子P-BOUgr.Ubq2-1:1:5(SEQ ID NO:53)；1024bp启动子P-BOUgr.Ubq2-1:1:6(SEQ ID NO:56)；和749bp启动子P-BOUgr.Ubq2-1:1:8(SEQ ID NO:61)。
图6：显示对应于来自中国芒(Miscanthus sinesis)的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图6显示5359bp启动子元件P-MISsi.Ubq1-1:1:2(SEQ ID NO:63)与P-MISsi.Ubq1-1:1:2的启动子变体的比对。所述比对中包括2423bp启动子P-MISsi.Ubq1-1:1:11(SEQ ID NO:67)；1447bp启动子P-MISsi.Ubq1-1:1:10(SEQ ID NO:71)；899bp启动子P-MISsi.Ubq1-1:1:13(SEQ ID NO:73)；691bp启动子P-MISsi.Ubq1-1:1:14(SEQ ID NO:75)；和506bp启动子P-MISsi.Ubq1-1:1:9(SEQ ID NO:77)。
图7：显示对应于来自裂稃草(Schizachyium scoparium)的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图7显示2831bp启动子元件P-SCHsc.Ubq1-1:1:12(SEQ ID NO:79)与P-SCHsc.Ubq1-1:1:12的启动子变体的比对。所述比对中包括2033bp启动子P-SCHsc.Ubq1-1:1:11(SEQ ID NO:83)；1046bp启动子P-SCHsc.Ubq1-1:1:10(SEQ ID NO:85)；和547bp启动子P-SCHsc.Ubq1-1:1:14(SEQ ID NO:87)。
图8：显示对应于来自黄假高粱(Sorghastrum nutans)的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图8显示2218bp启动子元件P-SORnu.Ubq1-1:1:4(SEQ ID NO:89)与P-SORnu.Ubq1-1:1:4的启动子变体的比对。所述比对中包括1964bp启动子P-SORnu.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:93)；1023bp启动子P-SORnu.Ubq1-1:1:6(SEQ ID NO:96)；和724bp启动子P-SORnu.Ubq1-1:1:7(SEQ ID NO:98)。
图9：显示本发明的表达盒构型。
序列简述
SEQ ID NO:1、5、7、9、13、16、18、19、21、23、27、30、32、34、38、41、43、45、49、52、55、58、60、62、66、70、72、74、76、78、82、84、86、88、92、95、97、99、103、106、108、110、114、116、118、120、122、126、128、132、134、138、140、144、148、150和168是包含可操作地5′连接至前导序列的启动子序列的调控表达元件组(EXP)的DNA序列，所述前导序列可操作地5′连接至内含子序列。
SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98、100、104、107、109、111、117、119、121、123、129、135、141、145、151和169是启动子序列。
SEQ ID NO:3、11、25、36、47、64、68、80、90、101、112、124、130、136、142、146、152和170是前导序列。
SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94、102、105、113、115、125、127、131、133、137、139、143、147、149、153和171是内含子序列。
发明详述
本发明提供植物中具有基因调控活性的DNA分子。这些DNA分子的核苷酸序列是以SEQ ID NO:1-98和168-171提供的。这些DNA分子例如能够影响植物组织中可操作地连接的可转录DNA分子的表达，并且因此调控转基因植物中可操作地连接的转基因的基因表达。本发明还提供修饰、产生和使用这些DNA分子的方法。本发明还提供含有本发明的重组DNA分子的组合物(包括转基因植物细胞、植物、植物部分和种子)以及制备和使用这些的方法。
提供以下定义和方法来更好地限定本发明以及在本发明的实施中指导本领域普通技术人员。除非另外指出，否则术语根据相关领域的普通技术人员的常规使用方式来理解。
DNA分子
如本文所用的，术语“DNA”或“DNA分子”是指细胞或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物。如本文所用的，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文中所用的命名按美国联邦法规(United States Code of Federal Regulations)§1.822第37款所规定的，并且在WIPO标准ST.25(1998)，附录2、表1和3的表格中有所阐述。
如本文所用的，“重组DNA分子”是包含在没有人干预的情况下不会一起天然发生的DNA分子组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可以是包含至少两个相对于彼此异源的DNA分子的DNA分子、包含源于天然存在的DNA序列的DNA序列的DNA分子、或已通过遗传转化并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
如本文所用的，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的DNA序列相同的程度。通过人工比对两个DNA序列(例如参考序列和另一DNA序列)来产生最佳序列比对，以最大化具有适当的内部核苷酸插入、缺失或空位的序列比对中核苷酸匹配的数目。如本文所用的，术语“参考序列”是指以SEQ ID NO:1-98和168-171提供的DNA序列。
如本文所用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”或“同一性％”是同一性分数乘以100。对于与参考序列最佳比对的DNA序列，“同一性分数”是最佳比对中核苷酸匹配的数目除以参考序列中的核苷酸总数，例如，整个参考序列的全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案提供包含与参考序列(本文中以SEQ ID NO:1-98和168-171提供)最佳比对时，与参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或至少约100％同一性的DNA序列的DNA分子。
调控元件
调控元件(例如启动子、前导序列、增强子、内含子和转录终止区(或3′UTR))是活细胞中基因的总体表达的有机部分。如本文所用的，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文所用的，术语“基因调控活性”是指例如通过影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接的可转录DNA分子的表达的能力。因此，在植物中起作用的调控元件(例如启动子、前导序列、增强子和内含子)可用于通过遗传工程来改变植物表型。
如本文所用的，"调控表达元件组"或“EXP”序列可以指一组可操作地连接的调控元件，例如增强子、启动子、前导序列和内含子。因此，调控表达元件组可以由例如可操作地5′连接至前导序列的启动子组成，所述前导序列进而可操作地5′连接至内含子序列。
调控元件可以通过以下来表征：其基因表达模式，例如，正和/或负效应，例如组成型表达、或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应性表达及其任何组合，以及定量或定性指标。如本文所用的，“基因表达模式”是可操作地连接的DNA分子转录成转录的RNA分子的任何模式。转录的RNA分子可以翻译而产生蛋白质分子或可以提供反义或其它调控RNA分子，例如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)等。
如本文所用的，术语“蛋白质表达”是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可以通过其时间、空间、发育或形态学性质以及通过定量或定性指标来表征。
启动子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文所用的，术语“启动子”通常是指参与RNA聚合酶II和其它蛋白质(例如反式作用转录因子)的识别和结合以起始转录的DNA分子。启动子可以来源于基因的5′非翻译区(5′UTR)。或者，启动子可以是合成产生或操作的DNA分子。启动子还可以是嵌合的。嵌合启动子是通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的。可用于实施本发明的启动子包括SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169，包括其片段或变体。在本发明的特定实施方案中，如本文所述的这些DNA分子和其任何变体或衍生物进一步被定义为包含启动子活性，即，能够在宿主细胞中(例如，在转基因植物中)充当启动子。在再一特定实施方案中，可以将片段定义为展现出其所来源的起始启动子具有的启动子活性，或片段可以包含“最小启动子”，所述“最小启动子”提供基础转录水平，并且包含TATA框或用于RNA聚合酶II复合物的识别和结合以实现转录起始的等同DNA序列。
在一个实施方案中，提供如本文所公开的启动子序列的片段。启动子片段可以包含如上所述的启动子活性，并且可以例如在构建的嵌合启动子中单独使用或与其它启动子和启动子片段组合使用。在特定实施方案中，提供包含具有如本文所公开的启动子活性的DNA分子的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个或至少约1000个连续核苷酸或更长的启动子片段。从起始启动子分子产生所述片段的方法为本领域中所熟知。
例如，可以使用本领域中所熟知的方法来产生源自作为SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169呈现的任何启动子的组合物，例如内部或5′缺失，以改进或改变表达，包括通过去除对表达具有正或负效应的元件；使对表达具有正或负效应的元件重复；和/或使对表达具有组织或细胞特异性效应的元件重复或将其去除。可使用源自作为SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169呈现的任何启动子的包含3′缺失的组合物(其中去除了TATA框元件或其等同DNA序列和下游序列)来例如制备增强子元件。可以进行进一步的缺失以去除对表达具有正或负效应、组织特异性效应、细胞特异性效应或时间特异性效应(例如但不限于昼夜节律)的任何元件。作为SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169呈现的任何启动子以及由它们衍生的片段或增强子可以用来制备嵌合调控元件组合物，其包含可操作地连接至其它增强子和启动子的作为SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169呈现的任何启动子以及由它们衍生的片段或增强子。
根据本发明，可以分析启动子或启动子片段中已知启动子元件的存在，即，DNA序列特征，例如TATA框和其它已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可以使用这样的已知启动子元件的鉴定来设计具有与原始启动子相似的表达模式的启动子变体。
如本文所用的，术语“前导序列”是指来自基因的5′非翻译区(5′UTR)并且通常定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的DNA区段的DNA分子。或者，前导序列可以是合成产生或操作的DNA元件。前导序列可以用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的5′调控元件。前导序列分子可以与异源启动子或与它们的天然启动子一起使用。因此，本发明的启动子分子可以可操作地连接至它们的天然前导序列，或可以可操作地连接至异源前导序列。可用于实施本发明的前导序列包括SEQ ID NO:3、11、25、36、47、64、68、80、90和170或其片段或变体。在特定实施方案中，这样的DNA序列可被定义为能够在宿主细胞中充当前导序列，所述宿主细胞包括例如转基因植物细胞。在一个实施方案中，可以将这样的DNA序列译解为包含前导序列活性。
作为SEQ ID NO:3、11、25、36、47、64、68、80、90和170呈现的前导序列(5′UTR)可以包含调控元件，或可以采取对可操作地连接的DNA分子的转录或翻译具有作用的二级结构。作为SEQ ID NO:3、11、25、36、47、64、68、80、90和170呈现的前导序列可以根据本发明用于制备影响可操作地连接的DNA分子的转录或翻译的嵌合调控元件。另外，作为SEQ ID NO:3、11、25、36、47、64、68、80、90和170呈现的前导序列可以用于制备影响可操作地连接的DNA分子的转录或翻译的嵌合前导序列。
如本文所用的，术语“内含子”是指可以从基因的基因组拷贝分离或鉴定的DNA分子并且通常可以被定义为在信使RNA(mRNA)翻译前加工期间剪接出的区域。或者，内含子可以是合成产生或操作的DNA元件。内含子可以含有实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可以用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可以包含内含子，并且内含子相对于可转录DNA分子可以是异源的或可以不是异源的。本领域中内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。
在植物中，在构建体中包含一些内含子相对于缺乏所述内含子的构建体导致增加的mRNA和蛋白质累积。这一效应已被称为基因表达的“内含子介导的增强”(IME)。已在玉米基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)中、在水稻基因(例如，tpi)中以及在双子叶植物基因中鉴定出已知在植物中刺激表达的内含子，所述双子叶植物基因如来自矮牵牛花属(petunia)的基因(例如，rbcS)、来自马铃薯的基因(例如，st-ls1)和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因(例如，ubq3和pat1)。已显示内含子的剪接位点内的缺失或突变降低基因表达，指示剪接可能是IME所需要的。然而，该剪接本身并非必需，因为已通过来自拟南芥的pat1基因的剪接位点内的点突变显示双子叶植物中的IME。已显示相同内含子在一种植物中的多重应用展现出缺点。在那些情况下，需要具有用于构建适当的重组DNA元件的基础控制元件的集合。
可用于实施本发明的内含子包括SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94和171。源自作为SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94和171呈现的任何内含子的组合物可以包含顺式调控元件的内部缺失或重复；和/或当可操作地连接至启动子+前导序列或嵌合启动子+前导序列和编码序列时，包含内含子/外显子剪接点的5′和3′DNA序列的改变可以用于改进表达或表达的特异性。当修饰内含子/外显子边界序列时，可能有益的是，避免紧接在剪接位点(GT)的5′端前使用核苷酸序列AT或核苷酸A，和分别避免紧接在剪接位点(AG)的3’端后使用核苷酸G或核苷酸序列TG，以消除在信使RNA加工成最终转录物期间形成不需要的起始密码子的可能。因此可以以这种方式修饰内含子的5′或3′端剪接点位点周围的DNA序列。可以如工作实施例中所述，根据经验测试内含子和如本文所述并且通过本领域中已知的方法改变的内含子变体，以确定内含子对可操作地连接的DNA分子的表达的作用。
如本文所用的，术语“3′转录终止分子”、“3′非翻译区”或“3′UTR”在本文中是指在转录期间用于产生mRNA分子的3′部分的非翻译区的DNA分子。可以通过特定的裂解和3′聚腺苷酸化(也称为聚A尾)来产生mRNA分子的3′非翻译区。3′UTR可以可操作地连接至可转录DNA分子并且位于转录DNA分子的下游，并且可以包括聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其它调控信号。聚A尾被认为在mRNA稳定性和翻译起始中起作用。本领域中3′转录终止分子的实例是胭脂碱合成酶3′区、小麦hsp17 3′区、豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基3′区、棉花E6 3′区和薏苡辛(coixin)3′UTR。
3′UTR通常具有用于特定DNA分子的重组表达的有益用途。弱3′UTR具有产生通读(read-through)的可能，这可以影响位于相邻表达盒中的DNA分子的表达。转录终止的适当控制可以防止通读到位于下游的DNA序列(例如，其它表达盒)中并且可以进一步允许RNA聚合酶的有效再循环，以改进基因表达。转录的有效终止(RNA聚合酶II从DNA释放)是转录重新起始的必要条件，并且因此直接影响总体转录物水平。在转录终止后，成熟的mRNA从合成位点和模板运输释放至细胞质中。真核mRNA作为聚(A)形式在体内累积，使得难以通过常规方法来检测转录终止位点。然而，通过生物信息学方法来预测功能性的和有效的3′UTR是困难的，因为不存在允许容易地预测有效3′UTR的保守DNA序列。
从实际观点来看，用于表达盒中的3′UTR具有以下特征通常是有益的。3′UTR应当能够高效地和有效地终止转基因的转录并且防止转录物通读到任何相邻的DNA序列(如在一个转移DNA(T-DNA)中存在多个盒的情况中，所述相邻的DNA序列可以包含另一表达盒)中或T-DNA已经插入的相邻染色体DNA中。3′UTR不应当引起由用于驱动DNA分子表达的启动子、前导序列、增强子和内含子导致的转录活性的降低。在植物生物技术中，3′UTR经常用于引发从转化的植物提取的反转录RNA的扩增反应，并且用于：(1)评价表达盒一旦整合至植物染色体中时的转录活性或表达；(2)评价植物DNA内插入的拷贝数；和(3)评价育种后得到的种子的接合性。3′UTR还用于从转化的植物提取的DNA的扩增反应中，以表征插入的盒的完整性。
如本文所用的，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用的调控元件，也称为顺式元件，其赋予可操作地连接的DNA序列的总体表达模式的一个方面，但通常单独不足以驱动转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA框或等同DNA序列。启动子或启动子片段可以天然地包含一个或多个影响可操作地连接的DNA序列的转录的增强子元件。增强子元件还可以与启动子融合以产生嵌合启动子顺式-元件，这赋予了基因表达的总体调节的一个方面。
认为许多启动子增强子元件结合DNA-结合蛋白和/或影响DNA拓扑结构，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或促进双螺旋在转录起始位点选择性打开的局部构象。增强子元件可以起到结合调控转录的转录因子的作用。一些增强子元件结合超过一个的转录因子，并且转录因子可以以不同的亲和性与超过一个的增强子结构域相互作用。可以通过多种技术来鉴定增强子元件，所述技术包括缺失分析，即从启动子的5′端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNase I足迹法(footprinting)、甲基化干扰、电泳迁移率-变动测定、通过连接介导的聚合酶链式反应(PCR)的体内基因组足迹法和其它常规测定进行的DNA结合蛋白质分析；或通过使用常规DNA序列比较方法，例如BLAST，利用已知的顺式-元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序进行的DNA序列相似性分析。可以通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过本领域中已知的其它常规方法来进一步研究增强子结构域的精细结构。增强子元件可以通过化学合成或通过从包括这些元件的调控元件分离来获得，并且它们可以用含有有用的限制酶位点的其它侧翼核苷酸来合成以促进后续操作。因此，本发明涵盖根据本文所公开的方法设计、构建和使用用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的增强子元件。
如本文所用的，术语“嵌合的”是指通过使第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的单个DNA分子，其中第一DNA分子与第二DNA分子通常都不以该构型(即彼此融合)被包含。因此，嵌合DNA分子是另外通常不在自然界中被包含的新DNA分子。如本文所用的，术语“嵌合启动子”是指通过DNA分子的这样操作产生的启动子。嵌合启动子可以组合两个或更多个DNA片段，例如，启动子与增强子元件的融合。因此，本发明涵盖根据本文所公开的方法设计、构建和使用用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的嵌合启动子。
如本文所用的，术语“变体”是指组成上与第一DNA分子相似但不相同的第二DNA分子，并且其中第二DNA分子仍然例如通过更多或更少或等同的转录或翻译活性维持第一DNA分子的总体功能性，即相同或相似的表达模式。变体可以是第一DNA分子的缩短或截短形式和/或第一DNA分子的DNA序列的改变形式，例如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代和/或插入的变体。调控元件“变体”还涵盖从细菌和植物细胞转化期间发生或由于细菌和植物细胞转化而发生的突变产生的变体。在本发明中，作为SEQ ID NO:1-98和168-171提供的DNA序列可以用于产生组成上与原始调控元件的DNA序列相似但不相同、同时仍然维持原始调控元件的总体功能性(即相同或相似表达模式)的变体。本发明的这样的变体的产生根据本公开在本领域普通技术人员的能力范围内，并且涵盖在本发明的范围内。
嵌合调控元件可被设计成包含可以通过本领域中已知的各种方法可操作地连接的各种组成元件，所述方法例如限制酶消化和连接、不依赖于连接的克隆、扩增期间PCR产物的模块组装或调控元件的直接化学合成，以及本领域中已知的其它方法。所得到的各种嵌合调控元件可以包含相同组成元件或相同组成元件的变体，但在包含一个或多个连接DNA序列的一个或多个DNA序列方面不同，所述一个或多个连接DNA序列允许组成部分可操作地连接。在本发明中，作为SEQ ID NO:1-98和168-171提供的DNA序列可以提供调控元件参考序列，其中包含所述参考序列的组成元件可以通过本领域中已知的方法接合，并且可以包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入或在细菌和植物细胞转化中天然发生的突变。
可以在稳定的和瞬时的植物测定(例如本文中的工作实施例中所述的那些)中，根据经验测试本文所述的修饰、重复或缺失对特定转基因的所需表达方面的效力，以验证结果，所述结果可以随所进行的变化和起始分子中变化的目标而改变。
构建体
如本文所用的，术语“构建体”意指源自任何来源的能够基因组整合或自主复制的任何重组DNA分子，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、或线性或环状DNA或RNA分子，包括其中至少一个DNA分子已经以功能操作的方式与另一DNA分子连接(即，可操作地连接)的DNA分子。如本文所用的，术语“载体”意指可以用于转化(即将异源DNA或RNA引入宿主细胞中)目的的任何构建体。构建体通常包括一个或多个表达盒。如本文所用的，“表达盒”是指至少包含与一个或多个调控元件(通常至少为启动子和3’UTR)可操作地连接的可转录DNA分子的DNA分子。
如本文所用的，术语“可操作地连接”是指第一DNA分子与第二DNA分子接合，其中第一DNA分子和第二DNA分子布置成使得第一DNA分子影响第二DNA分子的功能。两个DNA分子可以是或可以不是单个连续DNA分子的一部分，并且可以是或可以不是邻接的。例如，如果启动子在细胞中调节可转录DNA分子的转录，则所述启动子可操作地连接至目标可转录DNA分子。例如，当前导序列能够影响DNA序列的转录或翻译时，其可操作地连接至所述DNA序列。
在一个实施方案中，本发明的构建体可以作为双肿瘤诱导性(Ti)质粒边界构建体提供，所述构建体具有包含T-DNA的从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区，所述构建体连同根癌农杆菌细胞提供的转移分子一起允许所述T-DNA整合至植物细胞的基因组中(参见例如美国专利6,603,061)。构建体还可以含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)复制起点(例如ori322)、广宿主范围的复制起点(例如oriV或oriRi)和用于选择标记的编码区，例如编码赋予对壮观霉素(spectinomycin)或链霉素(streptomycin)抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)的Spec/Strp、或庆大霉素(gentamicin)(Gm,Gent)选择标记基因。对于植物转化来说，宿主细菌菌株经常是根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物转化领域中的技术人员已知的其它菌株可以在本发明中起作用。
本领域中已知以使可转录DNA分子转录成功能性mRNA分子的方式组装构建体并将其引入细胞中的方法，所述功能性mRNA分子翻译并表达为蛋白质。对于本发明的实施来说，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知。可用于高等植物中的核酸表达的典型载体为本领域所熟知，并且包括源自根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN转移控制载体。
可以在构建体中包括各种调控元件，包括本文所提供的那些中的任一个。任何这样的调控元件都可以与其它调控元件组合提供。可以设计或修改这样的组合以产生所需的调控特征。在一个实施方案中，发明的构建体包含至少一个可操作地连接至可转录DNA分子的调控元件，所述可转录DNA分子可操作地连接至3′UTR。
本发明的构建体可以包括本文所提供的或本领域中已知的任何启动子或前导序列。例如，本发明的启动子可以可操作地连接至异源非翻译5′前导序列(例如源自热休克蛋白基因的前导序列)。或者，本发明的前导序列可以可操作地连接至异源启动子(例如花椰菜花叶病毒35S转录启动子)。
表达盒还可以包括转运肽编码序列，所述序列编码以下肽：其可用于将可操作地连接的蛋白质亚细胞靶向于特别是叶绿体、白色体或其它质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡；或细胞外位置。许多叶绿体定位的蛋白质作为前体由核基因表达，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向于叶绿体。这样的分离的叶绿体蛋白质的实例包括但不限于与核酮糖-1,5,-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合体蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F和烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)相关的那些。叶绿体转运肽描述于例如美国专利号7,193,133中。已证实，非叶绿体蛋白质可以通过可操作地连接至编码非叶绿体蛋白质的转基因的异源CTP的表达来靶向于叶绿体。
可转录DNA分子
如本文所用的，术语“可转录DNA分子”是指能够转录成RNA分子的任何DNA分子，包括但不限于具有蛋白质编码序列的那些和产生具有可用于基因抑制的序列的RNA分子的那些。DNA分子的类型可以包括但不限于来自相同植物的DNA分子、来自另一植物的DNA分子、来自不同生物体的DNA分子或合成的DNA分子，例如含有基因的反义信息的DNA分子、或编码转基因的人工、合成或其它修饰形式的DNA分子。用于并入本发明的构建体中的示例性可转录DNA分子包含例如来自除其中并入了所述DNA分子的物种以外的物种的DNA分子或基因、或源于相同物种或存在于相同物种中但通过遗传工程方法而非传统的育种技术并入受体细胞中的基因。
“转基因”是指至少相对于其在宿主细胞基因组中的位置对于宿主细胞异源的可转录DNA分子和/或人工并入当前或任何前代细胞的宿主细胞基因组中的可转录DNA分子。
调控元件(例如本发明的启动子)可以可操作地连接至相对于所述调控元件异源的可转录DNA分子。如本文所用的，术语“异源的”是指两个或更多个DNA分子的组合通常不在自然界中发现时的这种组合。例如，两个分子可以源自不同的物种和/或两个DNA分子可以源自不同的基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果这样的组合通常不在自然界中发现，那么调控元件相对于可操作地连接的可转录DNA分子是异源的，即，所述可转录DNA分子不天然发生可操作地连接至所述调控元件。
可转录DNA分子通常可以是需要转录物表达的任何DNA分子。转录物的这种表达可以导致所得到的mRNA分子的翻译，并且因此导致蛋白质表达。或者，例如，可转录DNA分子可以被设计成最终引起特定基因和蛋白质的表达降低。在一个实施方案中，这可以通过使用以反义方向定向的可转录DNA分子来实现。本领域普通技术人员熟知这样的反义技术的使用。任何基因均可以这种方式被负向地调控，并且在一个实施方案中，可转录DNA分子可以被设计用于通过dsRNA、siRNA或miRNA分子的表达来抑制特定基因。
因此，本发明的一个实施方案是包含可操作地连接至异源可转录DNA分子的本发明调控元件的重组DNA分子，例如作为SEQ ID NO:1-98和168-171提供的那些，以便当构建体整合于转基因植物细胞的基因组中时，以所需水平下或以所需模式调节可转录DNA分子的转录。在一个实施方案中，可转录DNA分子包含基因的蛋白质编码区，并且在另一实施方案中，可转录DNA分子包含基因的反义区。
农学目的基因
可转录DNA分子可以是农学目的基因。如本文所用的，术语“农学目的基因”是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时赋予所需特征的可转录DNA分子。农学目的基因的产物可以在植物内起作用，以引起对植物形态学、生理学、生长、发育、产量、颗粒组成、营养特征、抗病性或抗虫性和/或环境或化学耐受性的作用，或可以充当以植物为食的害虫的膳食中的杀虫剂。在本发明的一个实施方案中，将本发明的调控元件并入构建体中，使得所述调控元件可操作地连接至作为农学目的基因的可转录DNA分子。在含有这样的构建体的转基因植物中，农学目的基因的表达可以赋予有益的农学性状。有益的农艺学性状可以包括例如但不限于除草剂耐受性、昆虫控制、改良的产量、抗原抗性、改良的植物生长和发育、改良的淀粉含量、改良的油含量、改良的脂肪酸含量、改良的蛋白质含量、改良的果实成熟、增强的动物和人营养、生物聚合物产生、环境应激抗性、药物肽、改良的加工质量、改良的风味、氮固定、杂种种子产生效用、改良的纤维产生和所需的生物燃料产生。
本领域中已知的农学目的基因的实例包括用于以下目的的那些：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)、增加的产量(美国专利号USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098和5,716,837)、昆虫控制(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658、5,880,275；5,763,245和5,763,241)、真菌疾病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023和5,304,730)、线虫抗性(美国专利号6,228,992)、细菌疾病抗性(美国专利号5,516,671)、植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)、淀粉产生(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改良的油产生(美国专利号6,444,876；6,426,447和6,380,462)、高油产生(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461和6,459,018)、高蛋白质产生(美国专利号6,380,466)、果实成熟(美国专利号5,512,466)、增强的动物和人营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,228,623和5,958,745、和6,946,588)、环境应激抗性(美国专利号6,072,103)、药物肽和可分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075和6,080,560)、改进的加工性状(美国专利号6,476,295)、改进的可消化性(美国专利号6,531,648)、低蜜三糖(美国专利号6,166,292)、工业酶产生(美国专利号5,543,576)、改进的风味(美国专利号6,011,199)、固氮(美国专利号5,229,114)、杂种种子产生(美国专利号5,689,041)、纤维产生(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834和5,869,720)和生物燃料产生(美国专利号5,998,700)。
或者，农学目的基因可以通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调节的RNA分子来影响上述植物特征或表型，例如，通过反义(参见例如美国专利5,107,065)、抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和定相sRNA-介导的机制来调节基因表达，例如，如公开的申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206以及美国专利申请11/974,469中所述的)或共抑制介导的机制来影响。RNA可以是经工程化以裂解所需内源性mRNA产物的催化性RNA分子(例如，核酶或核糖开关；参见例如U.S.2006/0200878)。本领域中已知以使可转录DNA分子转录成能够引起基因抑制的分子的方式构建构建体并将其引入细胞中的方法。
可转录DNA分子在植物细胞中的表达还可以用于抑制以植物细胞为食的植物害虫，例如从鞘翅目害虫分离的组合物和从线虫害虫分离的组合物。植物害虫包括但不限于节肢动物害虫、线虫害虫和真菌或微生物害虫。
选择标记
选择标记转基因还可与本发明的调控元件一起使用。如本文所用的，术语“选择标记转基因”是指可以某种方式筛选或评定其在转基因植物、组织或细胞中的表达或缺失的任何可转录DNA分子。用于本发明实施中的选择标记基因以及它们的相关选择和筛选技术为本领域中已知并且包括但不限于编码β-葡糖苷酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质和赋予除草剂耐受性的蛋白质的可转录DNA分子。
细胞转化
本发明还涉及生产转化的细胞和植物的方法，所述转化的细胞和植物包含一种或多种可操作地连接至可转录DNA分子的启动子调控元件。
术语“转化”是指将DNA分子引入受体宿主中。如本文所用的，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或子代。特别感兴趣的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚芽和花粉。
如本文所用的，术语“转化的”是指其中已引入了外源DNA分子(例如，构建体)的细胞、组织、器官或生物体。引入的DNA分子可以整合至受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的DNA分子被后续子代遗传。“转基因”或“转化的”细胞或生物体还可以包括细胞或生物体的子代以及从采用这样的转基因生物体作为杂交亲本的育种程序产生的并且由于外源DNA分子的存在而展现出改变的表型的子代。引入的DNA分子还可以短暂地引入受体细胞中，使得引入的DNA分子不被后续子代遗传。术语“转基因”是指含有一种或多种异源DNA分子的细菌、真菌或植物。
存在许多为本领域技术人员熟知的方法用于将DNA分子引入植物细胞中。所述方法通常包括如下步骤：选择合适的宿主细胞、用载体转化所述宿主细胞和获得转化的宿主细胞。在本发明的实施中通过将植物构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可以包括熟知的和证实的方法中的任一种。合适的方法包括但不限于细菌感染(例如，农杆菌属(Agrobacterium))、二元BAC载体、DNA的直接递送(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅拌和DNA涂覆粒子加速)等。
宿主细胞可以是任何细胞或生物体，例如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在特定实施方案中，宿主细胞和转化的细胞可以包括来自作物植物的细胞。
转基因植物随后可以从本发明的转基因植物细胞产生。使用常规的育种技术或自花授粉，可以从这种转基因植物产生种子。这样的种子以及从这样的种子生长得到的子代植物将含有本发明的重组DNA分子，且因此将是转基因的。
本发明的转基因植物可以经自花授粉以提供用于本发明的纯合转基因植物的种子(对于重组DNA分子来说为纯化)，或与非转基因植物或不同的转基因植物杂交以提供用于本发明的杂合转基因植物的种子(对于重组DNA分子来说为杂合)。这样纯合的转基因植物和杂合的转基因植物两者在本文中均被称作“子代植物”。子代植物是从原始转基因植物传代下来的并且含有本发明的重组DNA分子的转基因植物。可以收获使用本发明的转基因植物产生的种子并且将其用于生长本发明的转基因植物(即，子代植物)的世代，其包含本发明的构建体并且表达农学目的基因。通常用于不同作物的育种方法的描述可以在几本参考书之一中找到，参见例如Allard,Principles of Plant Breeding,John Wiley&Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960)；Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman公司，NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(编辑),Center for Agricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production and Uses，第2版，Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of Variety Development,Theory and Technique,(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷),Iowa State Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)。
可以分析转化的植物中一个或多个目标基因的存在以及通过本发明的调控元件赋予的表达水平和/或表达谱(expression profile)。本领域技术人员知道可用于分析转化的植物的许多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或northern印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评估(field evaluation)和免疫诊断测定。可以使用如制造商所述的(Applied Biosystems,Foster City,CA)试剂和方法来测量可转录DNA分子的表达，并且使用Testing Matrix来确定PCR循环次数。或者，如制造商所述的(Third Wave Technologies，Madison，WI)试剂和方法可以用于评估转基因表达。
本发明还提供本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可以是可存活的、不可存活的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并且提供包含本发明的DNA分子的转化的植物细胞。本发明的转化的或转基因植物细胞包括可再生的和/或不可再生的植物细胞。
通过参考以下实施例可以更容易地理解本发明，除非具体说明，否则所述实施例是以说明的方式提供的并且并不旨在限制本发明。本领域技术人员应当了解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的很好地实施本发明的技术。然而，本领域技术人员根据本发明的公开内容应当了解，可以对所公开的特定实施方案做出许多变化并且仍然获得相同或相似的结果而不脱离本发明的精神和范围，因此附图中所列或所示的所有内容均应解释为示例性的而不是限制意义的。
实施例
实施例1
调控元件的鉴定和克隆
从单子叶植物云草、芦竹、格兰马草、中国芒、裂稃草、黄假高粱和薏苡属(Coix)(薏苡(Coix lacryma-jobi))的基因组DNA鉴定和分离出新颖的泛素调控元件或调控表达元件组(EXP)序列。
从以上的各个物种鉴定泛素1转录物序列。使用各个泛素1转录物的5′非翻译区(5′UTR)来设计引物以扩增用于鉴定的泛素基因的相应调控元件，其包含可操作地连接的启动子、前导序列(5′UTR)和第一内含子。所述引物用于依照制造商的方案构建的GenomeWalkerTM(Clontech Laboratories公司，Mountain View,CA)文库以克隆相应基因组DNA序列的5′区。还使用上文所述的GenomeWalkerTM文库从单子叶植物小米(Setaria italica)、狗尾草(Setaria viridis)和墨西哥玉米(Zea mays subsp.Mexicana)分离泛素调控元件。另外，使用与泛素4、6和7基因同源的公共序列，从单子叶植物高粱(Sorghum bicolor)分离泛素调控元件。
使用鉴定的序列进行生物信息学分析，以鉴定扩增的DNA内的调控元件。使用这一分析的结果，在DNA序列内限定调控元件并且设计引物来扩增所述调控元件。使用标准的聚合酶链式反应(PCR)条件，用含有独特限制酶位点和从云草、芦竹、格兰马草、中国芒、裂稃草、黄假高粱和薏苡分离的基因组DNA的引物来扩增用于每个调控元件的相应DNA分子。将所得到的DNA片段连接至基础植物表达载体中并且测序。然后使用转化的植物原生质体进行调控元件翻译起始位点(TSS)和内含子/外显子剪接点的分析。简单地说，用包含可操作地连接至异源可转录DNA分子的克隆DNA片段的植物表达载体转化原生质体，并且使用用于cDNA端快速扩增的5′RACE系统，版本2.0(Invitrogen，Carlsbad，California 92008)，通过分析由此产生的信使RNA(mRNA)转录物的序列来确认调控元件TSS和内含子/外显子剪接点。
鉴定的EXP的DNA序列在本文中作为SEQ ID NO:1、5、7、9、13、16、18、19、21、23、27、30、32、34、38、41、43、45、49、52、55、58、60、62、66、70、72、74、76、78、82、84、86、88、92、95、97、99、103、106、108、110、114、116、118、120、122、126、128、132、134、138、140、144、148、150和168提供，如下表1中所列。启动子序列在本文中作为SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98、100、104、107、109、111、117、119、121、123、129、135、141、145、151和169提供。前导序列在本文中作为SEQ ID NO:3、11、25、36、47、64、68、80、90、101、112、124、130、136、142、146、152和170提供。内含子序列在本文中作为SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94、102、105、113、115、125、127、131、133、137、139、143、147、149、153和171提供。
表1.从各种草类物种分离的调控表达元件组(“EXP”)、启动子、增强子、前导序列和内含子。
如表1中所示，例如，命名为EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1)的调控EXP序列(其具有从云草分离的组分)包含可操作地5′连接至前导序列元件L-AGRne.Ubq1-1:1:1(SEQ ID NO:3)的启动子元件P-AGRne.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:2)，所述前导序列元件可操作地5′连接至内含子元件I-AGRne.Ubq1-1:1:3(SEQ ID NO:4)。其它EXP序列相似地连接，如表1中所概述的。
如表1、序列表和图1-8中所示，将来自云草、芦竹、格兰马草、中国芒、裂稃草和黄假高粱的启动子序列的变体工程化，所述变体包含例如P-AGRne.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:2)、P-ARUdo.Ubq1-1:1:4(SEQ ID NO:10)或来自其它物种的其它相应启动子的较短启动子片段，并且例如得到P-AGRne.Ubq1-1:1:4(SEQ ID NO:6)和P-ARUdo.Ubq1-1:1:5(SEQ ID NO:14)，以及其它启动子片段。
表1中还列示了使用相同引物组分离的三个等位基因变体，所述引物组被设计用于来自墨西哥玉米的基因组DNA的扩增。墨西哥玉米EXP序列的等位基因变体包含在其它DNA序列的各个区域内共有一定同一性的DNA序列，但在每个EXP序列的每个启动子、前导序列和/或内含子内的插入、缺失和核苷酸错配也可以是明显的。命名为EXP-Zm.UbqM1:1:6(SEQ ID NO:122)和EXP-Zm.UbqM1:1:10(SEQ ID NO:126)的EXP序列表示墨西哥玉米Ubq1基因调控表达元件组的第一等位基因(等位基因-1)，两个EXP序列之间仅有的差异出现在3′内含子剪接点的序列5′-AG-3′之后的每个相应内含子的最后3′核苷酸中。命名为EXP-Zm.UbqM1:1:7(SEQ ID NO:128)和EXP-Zm.UbqM1:1:12(SEQ ID NO:132)的EXP序列表示墨西哥玉米Ubq1基因调控表达元件组的第二等位基因(等位基因-2)，两个EXP序列之间仅有的差异出现在3′内含子剪接点的序列5′-AG-3′之后的每个相应内含子的最后3′核苷酸中。EXP序列EXP-Zm.UbqM1:1:8(SEQ ID NO:134)和EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:138)表示墨西哥玉米Ubq1基因调控表达元件组的第三等位基因(等位基因-3)，两个EXP序列之间仅有的差异出现在3′内含子剪接点的序列5′-AG-3′之后的每个相应内含子的最后3′核苷酸中。
实施例2
使用GUS表达盒扩增子分析玉米原生质体中驱动GUS的调控元件
在下文所呈现的一系列实验中，用源自含有驱动β-葡糖苷酸酶转基因(GUS)表达的EXP序列的植物表达载体的DNA扩增子转化玉米叶原生质体，并且与其中通过已知组成型启动子驱动GUS表达的叶原生质体进行比较。
在第一组实验中，如上文用从包含GUS表达盒的植物表达载体的扩增产生的扩增子转化源自叶组织的玉米原生质体细胞，以将通过以下中的一个驱动的转基因(GUS)的表达与已知组成型启动子驱动的表达进行比较：EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1)、EXP-AGRne.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:5)、EXP-AGRne.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:7)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:16)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:20)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:8(SEQ ID NO:26)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:9(SEQ ID NO:29)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:10(SEQ ID NO:31)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:37)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:40)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:42)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:14(SEQ ID NO:51)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:16(SEQ ID NO:57)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:17(SEQ ID NO:59)、EXP-MISsi.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:69)、EXP-MISsi.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:71)、EXP-MISsi.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:73)、EXP-MISsi.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:75)、EXP-SCHsc.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:77)、EXP-SCHsc.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:83)、EXP-SCHsc.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:85)、EXP-SORnu.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:91)、EXP-SORnu.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:94)、EXP-SORnu.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:96)、EXP-SETit.Ubq1:1:5(SEQ ID NO:102)、EXP-SETit.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:105)、EXP-SETit.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:107)、EXP-Sv.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:109)、EXP-Sv.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:115)、EXP-Sv.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:117)、EXP-Zm.UbqM1:1:6(SEQ ID NO:121)、EXP-Zm.UbqM1:1:7(SEQ ID NO:127)、EXP-Zm.UbqM1:1:8(SEQ ID NO:133)、Exp-Sb.Ubq4:1:2(SEQ ID NO:139)和Exp-Sb.Ubq6:1:2(SEQ ID NO:143)。使用本领域已知的方法，将包含产生表达盒扩增子的扩增模板的每个EXP序列克隆至下表2中标题“扩增子模板”下所示的植物表达载体中。所得到的植物表达载体包含表达盒，所述表达盒包含可操作地5′连接至含有可加工的内含子(“GUS-2”,SEQ ID NO:154)或连续GUS编码序列(“GUS-1”,SEQ ID NO:153)的GUS编码序列的EXP序列，所述GUS编码序列可操作地5′连接至3′UTR T-AGRtu.nos-1:1:13(SEQ ID NO:157)或T-Ta.Hsp17-1:1:1(SEQ ID NO:158)。使用下表2中呈现的质粒构建体模板，使用本领域技术人员已知的方法来产生扩增子。简单地说，设计5′寡核苷酸引物以使其与启动子序列退火，并且将在3′UTR的3′端退火的3′寡核苷酸引物用于每个表达盒的扩增。通过使用设计成在包含每个扩增子模板的启动子序列内的不同位置退火的不同寡核苷酸引物，将连续的5′缺失引入包含表达盒的启动子序列中，以产生不同的EXP序列。
表2.用于玉米叶原生质体转化的GUS植物表达扩增子和相应的质粒构建体扩增子模板、EXP序列、GUS编码序列和3′UTR。
表2中列为扩增子模板的质粒构建体用作用于包含表2中所列EXP序列的转基因表达盒的扩增的模板。如先前所述的，用组成型EXP序列EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:162)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1(SEQ ID NO:161)来构建用于产生用于比较的GUS转基因扩增子的对照质粒。使用并不设计用于转基因表达的空载体作为阴性对照来评价背景GUS和荧光素酶表达。
还使用本领域已知方法构建了两个用于共转化和数据的标准化的质粒。每个质粒含有通过组成型EXP序列驱动的特定荧光素酶编码序列。植物载体pMON19437包含具有可操作地5′连接至内含子(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1,SEQ ID NO:163)的组成型启动子的表达盒，所述内含子可操作地5′连接至萤火虫(北美萤火虫(Photinus pyralis))荧光素酶编码序列(荧光素酶:1:3,SEQ ID NO:156)，所述荧光素酶编码序列可操作地5′连接至来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)。植物载体pMON63934包含具有组成型EXP序列(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1,SEQ ID NO:164)的表达盒，所述组成型EXP序列可操作地5′连接至海肾(Renilla reniformis)荧光素酶编码序列(CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1,SEQ ID NO:157)，所述荧光素酶编码序列可操作地5′连接至来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)。
使用本领域所熟知的基于PEG的转化方法来转化玉米叶原生质体。用pMON19437质粒DNA、pMON63934质粒DNA和表2中所呈现的扩增子转化原生质体细胞，并且将其在完全黑暗中孵育过夜。通过将如上文转化的细胞的溶解制剂的等分试样置于两个不同的小孔托盘中来进行GUS与荧光素酶两者的测量。一个托盘用于GUS测量，并且第二个托盘用于使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega公司，Madison,WI；参见例如Promega Notes Magazine，第57期，1996，第02页)进行双荧光素酶测定。对每个EXP序列进行一次或两次转化并且从来自每个转化实验的数个样品确定每个EXP序列的平均表达值。每次EXP序列构建体转化使用4个重复,或可选地，每两次转化实验中的一次，每个EXP序列扩增子使用3个重复，进行样品测量。平均GUS和荧光素酶表达水平提供于表3中。在此表中，萤火虫荧光素酶值(例如，来自pMON19437的表达)提供于标记为“FLuc”的一栏中并且海肾荧光素酶值提供于标记为“RLuc”的一栏中。
表3.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
为了比较每个EXP序列的相对活性，将GUS值表示为GUS与荧光素酶活性的比率，并且相对于对EXP-Os.Act1:1:1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1观察到的表达水平进行标准化。下表4显示玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。下表5显示玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1驱动的表达标准化的GUS/FLuc表达比率。
表4.玉米原生质体中相对于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1(SEQ ID NO:161)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
表5.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:162)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如在表9和10中可以看出，所有EXP序列均能够驱动玉米细胞中的GUS转基因表达。相对于EXP-Os.Act1:1:9，所有EXP序列的平均GUS表达均较高。EXP序列EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1),EXP-AGRne.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:5),EXP-AGRne.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:7),EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:18)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:21)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:8(SEQ ID NO:27)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:9(SEQ ID NO:30)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:10(SEQ ID NO:32)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:38)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:41)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:14(SEQ ID NO:52)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:16(SEQ ID NO:58)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:17(SEQ ID NO:60)、EXP-MISsi.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:72)、EXP-SCHsc.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:84)、EXP-SCHsc.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:86)、EXP-SORnu.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:95)、EXP-SORnu.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:97)、EXP-SETit.Ubq1:1:5(SEQ ID NO:103)、EXP-SETit.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:106)、EXP-SETit.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:108)、EXP-Sv.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:110)、EXP-Sv.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:116)、EXP-Sv.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:118)、EXP-Zm.UbqM1:1:6(SEQ ID NO:122)、EXP-Zm.UbqM1:1:8(SEQ ID NO:134)、EXP-Sb.Ubq4:1:2(SEQ ID NO:140)和EXP-Sb.Ubq6:1:2(SEQ ID NO:144)展示高于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1的GUS表达水平。
在第二组实验中，将包含EXP序列EXP-Zm.UbqM1:1:7(SEQ ID NO:128)的GUS表达盒扩增子与对照扩增子PCR0145942(EXP-Os.Act1:1:9,SEQ ID NO:162)和PCR0145944(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1,SEQ ID NO:161)进行关于GUS表达的比较。通过EXP序列EXP-Zm.UbqM1:1:7驱动的GUS表达高于两个对照。下表6显示对于每个扩增子确定的平均GUS和荧光素酶值。下表7显示玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1驱动的表达标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
表6.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性.
EXP序列 SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc EXP-Os.Act1:1:9 162 1512.25 11333.75 190461.00 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 161 41176.50 13885.75 330837.25 EXP-Zm.UbqM1:1:7 128 79581.50 15262.50 330755.75
表7.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:161)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1(SEQ ID NO:160)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
EXP序列 SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc EXP-Os.Act1:1:9 162 1512.25 11333.75 190461.00 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 161 41176.50 13885.75 330837.25 EXP-Zm.UbqM1:1:7 128 79581.50 15262.50 330755.75
可以在甘蔗叶原生质体中相似地研究调控元件驱动来自扩增子的GUS表达的的效力。例如，可以用源自含有EXP序列(驱动GUS转基因的表达)的植物表达载体的DNA扩增子转化甘蔗原生质体，并且与其中通过已知组成型启动子驱动GUS的表达的叶原生质体进行比较。
实施例3
使用GUS表达盒扩增子分析小麦原生质体中驱动GUS的调控元件
用源自含有EXP序列(驱动GUS转基因的表达)的植物表达载体的DNA扩增子转化小麦叶原生质体，并与其中通过已知组成型启动子驱动GUS的表达的叶原生质体进行比较。
使用本领域已知的方法，用从包含植物GUS表达盒的植物表达载体的扩增产生的扩增子转化源自叶组织的小麦原生质体细胞，以使用如先前的实施例(实施例2)中所述的方法，利用与针对以上实施例2中的玉米的测定所用相同的GUS表达盒扩增子，将通过表3中列出的EXP序列驱动的转基因(GUS)表达与已知组成型启动子驱动的表达进行比较。用于小麦原生质体转化的对照GUS表达盒扩增子和荧光素酶质粒也与先前的实施例中呈现的以及以上实施例2中的表3提供的那些相同。同样，如上所述，将阴性对照用于GUS和荧光素酶背景的确定。如以上实施例2中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化小麦叶原生质体。表8列出了在转化的小麦叶原生质体细胞中看到的平均GUS和LUC活性，并且表9和10显示了小麦原生质体中相对于EXP对照标准化的GUS/Fluc和GUS/RLuc表达比率。
表8.转化的小麦叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表9.小麦原生质体中相对于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1(SEQ ID NO:161)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
表10.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:162)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如在以上表9和10中可以看出，所有EXP序列均能够驱动小麦细胞中的GUS转基因表达。所有EXP序列均以高于小麦细胞中EXP-Os.Act1:1:9的水平驱动GUS表达。EXP序列EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:18)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:21)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:10(SEQ ID NO:32)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:14(SEQ ID NO:52)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:16(SEQ ID NO:58)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:17(SEQ ID NO:60)、EXP-MISsi.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:72)、EXP-SORnu.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:95)、EXP-SETit.Ubq1:1:5(SEQ ID NO:103)、EXP-SETit.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:106)、EXP-SETit.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:108)、EXP-Sv.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:110)、EXP-Sv.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:116)、EXP-Sv.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:118)、EXP-Zm.UbqM1:1:6(SEQ ID NO:122)和EXP-Zm.UbqM1:1:8(SEQ ID NO:134)展示等于或大于通过小麦细胞中的EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1驱动的GUS表达的GUS表达水平。
在第二组实验中，将包含EXP-ARUdo.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:21)的扩增子GUS表达盒与对照EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:162)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1(SEQ ID NO:161)进行比较。下表11显示对于每个扩增子确定的平均GUS和荧光素酶值。下表12显示小麦原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。
表11.转化的小麦叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表12.小麦叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:161)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1(SEQ ID NO:160)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如在上表12中可以看出，通过EXP-ARUdo.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:21)驱动的GUS表达高于组成型对照EXP-Os.Act1:1:9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1两者。
实施例4
玉米和小麦原生质体中驱动GUS调控元件的分析
用含有驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因表达的EXP序列的植物表达载体转化玉米和小麦叶原生质体并且将其与其中通过已知组成型启动子驱动GUS表达的叶原生质体中的GUS表达进行比较。
将通过EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)驱动的转基因表达与来自已知组成型启动子的表达进行比较。将上述EXP序列克隆至如下表13中所示的植物表达载体中，以产生其中EXP序列可操作地5′连接至GUS报告基因的载体，所述GUS报告基因含有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(GenBank登录号：X04753)的可加工内含子(称作GUS-2,SEQ ID NO:160)或连续GUS编码序列(GUS-1,SEQ ID NO:159)，所述GUS报告基因可操作地5′连接至源自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:161)或小麦Hsp17基因(T-Ta.Hsp17-1:1:1,SEQ ID NO:162)的3′UTR。
表13.用于转化玉米叶原生质体的GUS植物表达质粒构建体和相应的EXP序列、GUS编码序列和3′UTR。“SEQ ID NO:”是指给定的EXP序列。
还使用本领域已知方法构建了两个用于共转化和数据的标准化的质粒。每个质粒含有通过组成型EXP序列驱动的特定荧光素酶编码序列。植物载体pMON19437包含具有可操作地5′连接至内含子(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1,SEQ ID NO:163)的组成型启动子的表达盒，所述内含子可操作地5′连接至萤火虫(北美萤火虫)荧光素酶编码序列(荧光素酶:1:3,SEQ ID NO:156)，所述荧光素酶编码序列可操作地5′连接至来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)。植物载体pMON63934包含具有组成型EXP序列(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1,SEQ ID NO:164)的表达盒，所述组成型EXP序列可操作地5′连接至海肾荧光素酶编码序列(CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1,SEQ ID NO:157)，所述荧光素酶编码序列可操作地5′连接至来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)。
使用本领域所熟知的基于PEG的转化方法来转化玉米叶原生质体。用pMON19437质粒DNA、pMON63934质粒DNA和表13中所呈现的质粒转化原生质体细胞，并且将其在完全黑暗中孵育过夜。以与以上实施例2中所述的相似的方法进行GUS和荧光素酶两者的测量。对每个EXP序列进行一次或两次转化并且从来自每个转化实验的数个样品确定每个EXP序列的平均表达值。每次EXP序列构建体转化使用4个重复,或可选地，每两次转化实验中的一次，每个EXP序列构建体使用3个重复，进行样品测量。平均GUS和荧光素酶表达水平提供于表14中。在此表中，萤火虫荧光素酶值(例如，来自pMON19437的表达)提供于标记为“FLuc”的一栏中并且海肾荧光素酶值提供于标记为“RLuc”的一栏中。
表14.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
下表15显示玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1驱动的表达标准化的GUS/FLuc和GUS/RLuc表达比率。
表15.小麦叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1:1:9(SEQ ID NO:161)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1(SEQ ID NO:160)标准化的GUS/FLuc和GUS/RLuc表达比率。
如在上表15中可以看出，EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)能够驱动GUS的表达，但水平低于两种组成型对照的水平。
上表13中所列出的质粒还以与上述玉米叶原生质体相似的方式用于转化小麦叶原生质体细胞。平均GUS和荧光素酶值示于下表16中。下表17显示玉米原生质体中相对于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1驱动的表达标准化的GUS/FLuc和GUS/RLuc表达比率。
表16.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
EXP序列 SEQ ID NO: GUS FLuc RLuc EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 161 134145 1076.67 6858.67 EXP-Cl.Ubq10 168 104669 888.67 4516
表17.小麦叶原生质体中相对于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1(SEQ ID NO:160)标准化的GUS/FLuc和GUS/RLuc表达比率。
如在上表17中可以看出，在小麦原生质体细胞中，EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)以与EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1(SEQ ID NO:160)相似的水平表达GUS。
实施例5
转基因玉米中驱动GUS的调控元件的分析。
用含有驱动GUS转基因表达的EXP序列的植物表达载体转化玉米植物，并且分析所得到的植物的GUS蛋白质表达。使用本领域已知的方法将泛素EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。
所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区；用以测定EXP序列的第一表达盒，所述EXP序列可操作地连接至上述具有可加工的内含子GUS-2的GUS编码序列，所述GUS编码序列可操作地5′连接至来自水稻脂质转移蛋白质基因的3′UTR(T-Os.LTP-1:1:1,SEQ ID NO:159)；第二转基因选择盒(通过水稻肌动蛋白1启动子驱动)，用于选择赋予除草剂甘草膦(glyphosate)抗性的转化的植物细胞；和来自根癌农杆菌的左边界区。将所得到的质粒用于转化玉米植物。表18列出了质粒名称、EXP序列和SEQ ID NO，其也描述于表1中。
表18.二元植物转化质粒和相关的EXP序列。
使用农杆菌介导的转化来转化植物，例如如美国专利申请公开2009/0138985中所述的。
将组织化学GUS分析用于转化植物的定性表达分析。用GUS染色溶液X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1mg/ml)将完整组织切片孵育适当的时长，冲洗，并且目视检查蓝染色。过使用所选的植物器官和组织进行直接目视检查或在显微镜下检查来定性地确定GUS活性。检查R0植物的根和叶以及花药、抽穗丝和发育中的种子和授粉后21天(21DAP)的胚芽中的表达。
对于定量分析来说，从转化的玉米植物的所选组织提取总蛋白。将一微克的总蛋白用于荧光底物4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-D-葡糖苷酸(MUG)，总反应体积为50μl。反应产物4–甲基伞形酮(4-MU)在高pH下的荧光最大，其中羟基被离子化。添加碱性碳酸钠溶液同时终止试验并调节pH以用于定量荧光产物。使用具有Micromax读数器的Fluoromax-3(Horiba；Kyoto,Japan)，将狭缝宽度设定在激发2nm和发射3nm，在365nm的激发、445nm的发射下测量荧光。
对每次转化所观察到的平均R0GUS表达呈现于下表19和20中。
表19.根和叶组织中的平均R0GUS表达。
表20.玉米生殖器官(花药、抽穗丝)和发育中的种子(胚芽和胚乳)中的平均R0GUS表达。
在R0玉米植物中，叶和根中的GUS表达水平在泛素EXP序列之间不同。尽管所有的EXP序列均展示在稳定转化的植物中驱动GUS转基因表达的能力，但每个EXP序列展示相对于其它EXP序列的独特表达模式。例如，EXP序列EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1)、EXP-AGRne.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:5)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:18)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:8(SEQ ID NO:27)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:9(SEQ ID NO:30)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:38)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:41)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:14(SEQ ID NO:52)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:15(SEQ ID NO:55)、EXP-MISsi.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:76)、EXP-SORnu.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:92)、EXP-SORnu.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:95)、EXP-SETit.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:99)、EXP-Sv.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:114)、EXP-Zm.UbqM1:1:12(SEQ ID NO:132)和EXP-Sb.Ubq7:1:2(SEQ ID NO:150)相对于EXP-Sv.Ubq1:1:12(SEQ ID NO:120)、EXP-Zm.UbqM1:1:10(SEQ ID NO:126)、EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:138)、EXP-Sb.Ubq4:1:2(SEQ ID NO:140)和EXP-Sb.Ubq6:1:3(SEQ ID NO:148)在发育的V3和V7阶段的根中展示较低GUS表达水平。对于EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:18)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:41)、EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:138)和EXP-Sb.Ubq6:1:3(SEQ ID NO:148)，在根发育的后期阶段(VT)观察到了较高的GUS表达水平。通过EXP-Zm.UbqM1:1:10(SEQ ID NO:140)驱动的根表达展示在V3没有表达，但在V7较高，然后到VT阶段下降。通过EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:150)驱动的根表达在从阶段V3和V7至VT的整个发育过程中维持相似水平。通过EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)驱动的GUS表达从V4至V7阶段相对稳定，但在VT阶段下降至V4和V7的约一半。
GUS表达水平在叶组织中也显示出显著差异。EXP序列EXP-Zm.UbqM1:1:10(SEQ ID NO:126)、EXP-Zm.UbqM1:1:12(SEQ ID NO:132)和EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:138)展示在发育的所有三个阶段(V3、V7和VT)内观察到的最高GUS表达水平。EXP序列EXP-Sb.Ubq4:1:2(SEQ ID NO:140)显示从发育的V3至VT阶段的表达下降。EXP序列EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)和EXP-Sb.Ubq7:1:2(SEQ ID NO:150)展示在发育的V3和VT阶段的较高GUS表达水平与V7阶段的生长中期的较低表达水平。EXP序列EXP-ARUdo.Ubq2:1:9(SEQ ID NO:30)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:41)和EXP-MISsi.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:76)维持在所有三个阶段内的GUS表达，而EXP-ARUdo.Ubq2:1:8(SEQ ID NO:27)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:38)和EXP-BOUgr.Ubq2:1:15(SEQ ID NO:55)显示在VT阶段的表达的轻微降低。通过EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)驱动的表达在V4和VT阶段相似，但在V7阶段下降至V4和VT的水平的约一半。
同样，关于生殖组织(花药和抽穗丝)，观察到每个EXP序列独特的不同表达模式。例如，对于EXP序列EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:18)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:14(SEQ ID NO:52)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:15(SEQ ID NO:55)、EXP-SORnu.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:95)、EXP-Zm.UbqM1:1:10(SEQ ID NO:126)、EXP-Zm.UbqM1:1:12(SEQ ID NO:132)、EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:138)和EXP-Sb.Ubq7:1:2(SEQ ID NO:150)，在花药和抽穗丝中观察到高表达水平。相对于每个EXP序列，通过EXP序列EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1)、EXP-SORnu.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:92)、EXP-Sv.Ubq1:1:11(SEQ ID NO:114)、EXP-Sv.Ubq1:1:12(SEQ ID NO:120)、EXP-Sb.Ubq4:1:2(SEQ ID NO:140)、EXP-Sb.Ubq6:1:3(SEQ ID NO:148)和EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)驱动的表达在花药中较高，但在抽穗丝中较低，而通过EXP-BOUgr.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:38)驱动的在抽穗丝中的表达高于在花药中的表达。
发育中的种子(21DAP胚芽和胚乳)中的表达在EXP序列之间是不同的。EXP序列EXP-Zm.UbqM1:1:10(SEQ ID NO:126)、EXP-Zm.UbqM1:1:12(SEQ ID NO:132)和EXP-Zm.UbqM1:1:11(SEQ ID NO:138)驱动发育中的种子胚芽和胚乳组织中的高GUS表达。当通过EXP序列EXP-ARUdo.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:13)、EXP-ARUdo.Ubq1:1:9(SEQ ID NO:18)、EXP-ARUdo.Ubq2:1:8(SEQ ID NO:27)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:14(SEQ ID NO:52)、EXP-BOUgr.Ubq2:1:15(SEQ ID NO:55)、EXP-SORnu.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:92)、EXP-SORnu.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:95)、EXP-Sv.Ubq1:1:12(SEQ ID NO:120)、EXP-Sb.Ubq4:1:2(SEQ ID NO:140)和EXP-Cl.Ubq10(SEQ ID NO:168)驱动GUS时，胚乳中的表达水平是胚芽中的约2倍或更高。当通过EXP-Sb.Ubq7:1:2(SEQ ID NO:150)驱动时，GUS在胚芽中的表达是在胚乳中的3倍。当通过EXP序列EXP-AGRne.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:1)、EXP-AGRne.Ubq1:1:8(SEQ ID NO:5)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:6(SEQ ID NO:38)、EXP-BOUgr.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:41)、EXP-MISsi.Ubq1:1:7(SEQ ID NO:76)、EXP-SETit.Ubq1:1:10(SEQ ID NO:99)和EXP-Sb.Ubq6:1:3(SEQ ID NO:148)驱动时，GUS表达水平在胚芽和胚乳中是相对等同的。
每个EXP序列均展示在稳定转化的玉米植物中驱动转基因表达的能力。然而，每个EXP序列对于每个组织具有独特的表达模式，并且提供了根据实现所需结果所需要的组织表达策略来选择将最好地提供特定转基因的表达的EXP序列的机会。本实施例证实，从同源基因分离的EXP序列不一定在转化的植物中等同地表现，并且所述表达只可以通过对每个EXP序列的特性的经验研究来确定，并且不可以基于启动子所来源的基因同源性来预测。
实施例6
源自调控元件的增强子。
增强子源自本文所提供的启动子元件，例如作为SEQ ID NO:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169呈现的那些。增强子元件可以包含一个或多个顺式调控元件，所述顺式调控元件在可操作地5′或3′连接至启动子元件时，或可操作地5′或3′连接至与启动子可操作地连接的其它增强子元件时，可以增强或调节转基因的表达，或提供转基因在特定细胞类型或植物器官中或在发育或昼夜节律的特定时间点的表达。通过从如上所述允许从本文所提供的启动子启动转录的启动子(包括其片段)去除TATA框或功能相似元件和任何下游DNA序列来制得增强子，其中去除TATA框或功能相似元件和TATA框下游的DNA序列。
增强子元件可以源自本文提供的启动子元件并且使用本领域已知的方法克隆以可操作地5′或3′连接至启动子元件，或可操作地5′或3′连接至可操作地连接至启动子的其它增强子元件。或者，使用本领域已知的方法克隆增强子元件以可操作地连接至增强子元件的一个或多个拷贝，所述一个或多个拷贝可操作地5′或3′连接至启动子元件，或可操作地5′或3′连接至与启动子可操作地连接的其它增强子元件。增强子元件还可以被克隆以可操作地5′或3′连接至源自不同属生物体的启动子元件，或可操作地5′或3′连接至源自其它属生物体或相同属生物体的其它增强子元件(其可操作地连接至源自相同或不同属生物体的启动子)，从而产生嵌合的调控元件。与先前实施例中所述的构建体相似，使用本领域已知的方法来构建GUS表达植物转化载体，其中所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区；用以测试调控或嵌合调控元件的第一表达盒，其包含调控或嵌合调控元件，所述调控或嵌合调控元件可操作地连接至源自玉米(Z.mays)HSP70热休克蛋白的内含子(I-Zm.DnaK-1:1:1SEQ ID NO:165)或本文所呈现的任何内含子或任何其它内含子，所述内含子可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2,SEQ ID NO:155)或无内含子(GUS-1,SEQ ID NO:154)的GUS编码序列，所述GUS编码序列可操作地连接至来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶的3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)或来自水稻脂质转移蛋白基因的3′UTR(T-Os.LTP-1:1:1,SEQ ID NO:160)；第二转基因选择盒，用于选择赋予除草剂草甘膦(通过水稻肌动蛋白1启动子驱动)或可选地抗生素卡那霉素(kanamycin)(通过水稻激动蛋白1启动子驱动)抗性的转化的植物细胞；和来自根癌农杆菌的左边界区。通过上述方法或通过本领域已知的其它农杆菌介导的方法或颗粒轰击方法，将所得到的质粒用于转化玉米植物或其它属的植物。或者，使用本领域已知的方法来转化源自玉米或其它属植物的原生质体细胞以进行瞬时测定。
在稳定的或瞬时的植物测定中，评估通过包含一个或多个增强子的调控元件驱动的GUS表达，以确定增强子元件对转基因表达的作用。基于经验实验和使用每个调控元件组合物观察到的所得基因表达调控，进行对一个或多个增强子元件的修饰或一个或多个增强子元件的复制。改变所得到的调控或嵌合调控元件中一个或多个增强子的相对位置可以影响调控或嵌合调控元件的转录活性或特异性，并且根据经验进行确定以鉴定用于玉米植物或其它属植物内所需转基因表达谱的最佳增强子。
实施例7
使用植物源的原生质体来分析GUS活性的内含子增强。
基于实验以及与无内含子表达载体对照的比较来选择内含子，以根据经验选择用于最佳转基因表达的内含子和载体转移DNA(T-DNA)元件布置内的构型。例如，在除草剂抗性基因(例如赋予草甘膦耐受性的CP4)的表达中，期望在生殖组织以及营养组织内具有转基因表达以防止施用除草剂时的产量损失。这种情况下的内含子将基于其可操作地连接至组成型启动子时增强赋予除草剂抗性的转基因的表达的能力来选择，特别是在转基因植物的生殖细胞和组织内，并且由此在喷施除草剂时为转基因植物提供营养性和生殖性耐受性。在多数泛素基因中，5′UTR包含在其内嵌有内含子序列的前导序列。因此使用包含启动子、前导序列和内含子的完整5′UTR来测定源自这样的基因的调控元件。为了获得不同的表达谱或为了调节转基因表达的水平，可以去除所述表达元件中的内含子或用异源内含子替代所述内含子。
使用基因组DNA重叠群鉴定本文作为SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94和171呈现的内含子，与表达的序列标签簇或cDNA重叠群进行比较，以鉴定基因组DNA内的外显子和内含子序列。另外，还使用5′UTR或前导序列来限定在基因序列编码被一个或多个内含子中断的前导序列时的条件下一个或多个内含子的内含子/外显子剪接点。使用本领域已知的方法将内含子克隆至植物转化载体中，以可操作地3′连接至调控元件和前导片段以及可操作地5′连接至第二前导片段或编码序列，例如，如图9中呈现的表达盒中所描绘的。
因此，例如，第一个可能的表达盒(图9中的表达盒构型1)包含启动子或嵌合启动子元件[A]，[A]可操作地5′连接至前导元件[B]，[B]可操作地5′连接至测试内含子元件[C]，[C]可操作地连接至编码区[D]，[D]可操作地连接至3′UTR元件[E]。或者，第二个可能的表达盒(图9中的表达盒构型2)包含启动子或嵌合启动子元件[F]，[F]可操作地5′连接至第一前导元件或第一前导元件片段[G]，[G]可操作地5′连接至测试内含子元件[H]，[H]可操作地5′连接至第二前导元件或第一前导元件第二片段[I]，[I]可操作地连接至编码区[J]，[J]可操作地连接至3′UTR元件[K]。此外，第三个可能的表达盒(图9中的表达盒构型3)包含启动子或嵌合启动子元件[L]，[L]可操作地5′连接至前导元件[M]，[M]可操作地5′连接至编码序列元件的第一片段[N]，[N]可操作地5′连接至内含子元件[O]，[O]可操作地5′连接至编码序列元件的第二片段[P]，[P]可操作地连接至3′UTR元件[Q])。表达盒构型3被设计成允许内含子以产生完整的开放阅读框而在编码序列的第一和第二片段之间没有移码的方式来剪接。
如以上讨论的，可能优选的是避免紧接在剪接位点(GT)的5’端之前使用核苷酸序列AT或核苷酸A，以及避免分别紧接在剪接位点(AG)的3’端之后使用核苷酸G或核苷酸序列TG，以消除信使RNA加工成最终转录物期间形成不需要的起始密码子的可能。因此可以修饰内含子的5′或3′端剪接点位点周围的DNA序列。
通过在瞬时测定或稳定的植物测定中增强表达的能力来测定内含子的增强作用。对于内含子增强的瞬时测定来说，使用本领域已知的方法来构建基础植物载体。将内含子克隆至基础植物载体中，所述基础植物载体包含表达盒，所述表达盒包含组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒启动子P-CaMV.35S-enh-1:1:9(SEQ ID NO:166)，所述启动子可操作地5′连接至前导序列元件L-CaMV.35S-1:1:15(SEQ ID NO:167)，所述前导序列元件可操作地5′连接至测试内含子元件(例如SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94和171中的一个)，所述测试内含子元件可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2,SEQ ID NO:155)或无内含子(GUS-1,SEQ ID NO:154)的GUS编码序列，所述GUS编码序列可操作地连接至来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)。用基础植物载体和如以上实施例2中先前所述的荧光素酶对照载体转化源自玉米或其它属植物组织的原生质体细胞，并且测定活性。为了比较内含子增强表达的相对能力，将GUS值表示为GUS与荧光酶活性的比率，并且与如下构建体所赋予的那些水平进行比较：包含可操作地连接至已知内含子标准物(例如源自玉米HSP70热休克蛋白的内含子I-Zm.DnaK-1:1:1(SEQ ID NO:165))的组成型启动子的构建体以及包含所述组成型启动子但没有可操作地连接至所述启动子的内含子的构建体。
对于作为SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94和171呈现的内含子的稳定植物测定来说，与先前实施例中所述的构建体相似地构建GUS表达植物转化载体，其中所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区；用以测试内含子的第一表达盒，其包含组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒启动子P-CaMV.35S-enh-1:1:9(SEQ ID NO:166)，所述启动子可操作地5′连接至前导序列元件L-CaMV.35S-1:1:15(SEQ ID NO:167)，所述前导序列元件可操作地5′连接至本文所提供的测试内含子元件，所述测试内含子元件可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2,SEQ ID NO:155)或没有内含子(GUS-1,SEQ ID NO:154)的GUS编码序列，所述GUS编码序列可操作地连接至来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶3′UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13,SEQ ID NO:158)；第二转基因选择盒，用于选择赋予草甘膦(通过水稻肌动蛋白1启动子驱动)或可选地抗生素卡那霉素(通过水稻激动蛋白1启动子驱动)抗性的转化的植物细胞；和来自根癌农杆菌的左边界区。通过上述方法或通过本领域已知的农杆菌介导的方法，将所得到的质粒用于转化玉米植物或其它属的植物。选择单拷贝或低拷贝数的转化体用于与单拷贝或低拷贝数的转化植物进行比较，以确定测试内含子是否提供了内含子介导的增强作用，所述单拷贝或低拷贝数的转化植物已用与测试载体相同但不含测试内含子的植物转化载体转化。
可以多种方式修饰作为SEQ ID NO:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94和171呈现的任何内含子，所述方式例如使内含子序列内的如下片段缺失，所述片段可以降低可以增强表达的内含子片段的表达或复制。另外，可以使内含子内可以影响特定细胞类型或组织和器官的表达特异性的DNA序列复制或改变或缺失以影响转基因的表达和表达模式。另外，本文所提供的内含子可以经修饰以去除任何可能的如下起始密码子(ATG)，所述起始密码子可能引起从不恰当剪接的内含子表达无意的转录物而成为不同的、较长的或截短的蛋白质。一旦根据经验测试了内含子，或已基于实验对其进行了改变，则将内含子用于增强转基因在稳定转化的植物中的表达，所述稳定转化的植物可以是任何属的单子叶植物或双子叶植物，只要内含子提供转基因的增强。内含子还可以用于增强其它生物体(例如藻类、真菌或动物细胞)中的表达，只要内含子提供与其可操作地连接的转基因的表达的增强或减弱或特异性。
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尽管已经说明和描述了本发明的原理，但本领域技术人员应当明白，可以在布置和细节方面修改本发明而不脱离这些原理。我们要求在权利要求的精神和范围内的所有修改。本文所引用的所有出版物和公开的专利申请均在此以引用方式并入,其并入程度如同具体地且个别地指示将每一个别出版物或专利申请以引用方式并入一般。