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一种转基因逃逸导致的环境风险的检测评价方法.pdf

  • 上传人:g****
  • 文档编号:9130811
  • 上传时间:2021-02-09
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  • 摘要
    申请专利号:

    CN201010504128.3

    申请日:

    20101012

    公开号:

    CN102031303B

    公开日:

    20130102

    当前法律状态:

    有效性:

    有效

    法律详情:

    IPC分类号:

    C12Q1/68,A01H1/02

    主分类号:

    C12Q1/68,A01H1/02

    申请人:

    复旦大学

    发明人:

    卢宝荣,蔡星星,夏辉,汪魏,杨箫

    地址:

    200433 上海市杨浦区邯郸路220号

    优先权:

    CN201010504128A

    专利代理机构:

    上海正旦专利代理有限公司

    代理人:

    陆飞;盛志范

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    内容摘要

    本发明属于环境生物安全检测分析技术领域,具体为一种转基因逃逸导致的环境风险的检测评价方法。本发明利用抗虫转基因水稻和非转基因水稻及其野生近缘种群体为分析材料,经过组合,进行人工杂交,获得含有转基因和不含转基因的杂种F1群体以及含转基因杂种F1代的自交分离F2代群体。将F1群体以及F2分离群体在有虫压和无虫压的环境下进行田间种植,并对各群体的适合度相关性状进行测量。通过比较分析转基因群体的适合度利益和适合度成本,计算逃逸的转基因对野生近缘种带来的环境风险(%)。本发明在受控条件下检测转基因的环境风险,检测结果准确,效率高,对于转基因水稻商品化生产的环境安全保证具有良好的应用前景。

    权利要求书

    1. 一种转基因水稻的外源基因逃逸到杂草稻和野生稻群体导致环境风险的检测评价方法,其特征在于具体步骤为:(1)构建含有转基因和不含转基因野生近缘物种实验群体,包括杂草稻和野生稻;(2)设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验;(3)建立转基因逃逸导致环境风险的检测和评价标准;其中:所述构建含有转基因和不含转基因野生近缘物种实验群体,是按照一定的组合方式,利用人工杂交获得目标转基因水稻和野生近缘物种的杂种F代和自交分离F代实验群体来实现,具体步骤为:选择目标转基因水稻及其非转基因亲本品种,分别与野生近缘物种的个体进行杂交,获得含转基因的转基因水稻-野生种的杂种F群体(A)和不含转基因的亲本品种-野生种的杂种F群体(B);通过对含转基因的杂种F进行套袋自交,分别获得含有转基因和不含转基因的F代分离群体;利用目标转基因设计的引物,对F代分离群体进行PCR扩增,鉴定含有转基因的F群体(C)和不含转基因的F群体(D);根据上述方法所获得的含有转基因的杂种F群体(A)、不含转基因的杂种F群体(B),含有转基因的自交F分离群体(C)和不含转基因的自交F分离群体(D),进行受控实验条件下适合度分析实验;所述设计用于转基因水稻的外源基因逃逸到杂草稻和野生稻群体导致环境风险检测的田间种植实验,是将获得的A、B、C、D实验群体分别按20cm×20cm或40cm×40cm的种植株距和行距,将含转基因和不含转基因的A和B群体或C和D群体在一个小区内进行单一种植和相间混合种植;即分为3种种植模式:转基因植株的单一种植模式,非转基因植株的单一种植模式,转基因植株和非转基因植株的相间混合种植模式; 根据转基因的类型或功能,将受控的实验环境分别设计为有选择压的环境和无选择压的环境,将上述实验群体分别种植于有选择压的环境和无选择压的环境,并于实验群体植株生活史的各生长阶段,分别进行适合度相关性状的测量;所述建立转基因水稻的外源基因逃逸到杂草稻和野生稻群体导致环境风险的检测和评价标准,即建立复合适合度指数,来评价环境风险的程度,用%表示:各形态性状的适合度为:(含转基因植株的测量值-不含转基因植株的测量值)/ 不含转基因植株的测量值 ×100% ;复合适合度指数为:株高、单株分蘖数、单株穗数、单株种子产量、千粒重、种子萌发率和成苗率7个形态性状的适合度的平均数;通过复合适合度指数的值(%)来评价转基因逃逸导致环境风险(%),具体作法为:根据受控实验中各处理含有转基因的实验群体和不含转基因实验群体所测量的数据的比较分析,来检测转基因对野生近缘物种带来的适合度利益或适合度成本,并以此为依据确定转基因逃逸导致的环境风险;如转基因对实验群体带来的适合度变化程度越高则转基因逃逸的环境风险越高,反之则风险低或无风险;适合度利益或适合度成本的计算公式为: =(转基因植株测量值 - 非转基因植株测量值)/非转基因植株测量值 …(1)当值为正值,表示存在适合度利益,当值为负值,表示存在适合度成本,当值为0或接近于0,表示没有适合度变化;复合适合度指数为各性状适合度的平均值,计算公式为: = ∑ /N   …………………………………………………………………(2)其中i-j为不同的适合度形状,N 为测量性状的数目;即复合适合度的绝对值就是环境风险的评价值,复合适合度的绝对值越接近于0,环境风险越低,反之风险越高。 2. 根据权利要求1所述的转基因水稻的外源基因逃逸到杂草稻和野生稻群体导致环境风险的检测评价方法,其特征在于所述按照一定的组合方式,利用人工杂交获得目标转基因水稻和野生近缘物种的杂种F代和自交分离F代实验群体来实现,具体步骤为:(1)确定杂交组合:a. 转基因水稻 × 野生稻;b. 非转基因水稻亲本 × 野生稻;c. 转基因水稻 × 杂草稻;d. 非转基因水稻 × 杂草稻;(2)通过人工杂交,分别获得含转基因包括杂交组合a和c,以及不含转基因包括杂交组合b和d的杂种F群体; (3)对组合a和c的杂种F群体进行套袋自交和转基因的检测,鉴定F分离群体的个体是否包含转基因;(4)分别获得含转基因的F分离群体(+)和不含转基因的F分离群体(-)。 3. 根据权利要求1所述的转基因水稻的外源基因逃逸到杂草稻和野生稻群体导致环境风险的检测评价方法,其特征在于所述适合度相关性状选择如下:1)株高,cm:从植株的地面到最长茎叶或穗的高度;2单株分蘖数,个:每一单个植株的所有分蘖总合;3)单株穗数,个:每一单个植株所有的穗数总合;4)单株种子产量,粒:每一单个植株的所有饱满果实数总合;5)千粒重,g:1000粒种子的重量;6)种子萌发率,%:萌发种子数/用于萌发实验的种子数 ×100%;7)成苗率,%:幼苗数/用于萌发实验的种子数×100%。

    说明书

    技术领域

    本发明属于环境生物安全检测分析技术领域,具体涉及一种转基因逃逸导致的环境风险的检测评价方法。

    背景技术

    转基因技术的迅速发展,极大地推动了转基因植物的培育和种植,转基因植物的商品化应用,为农作物产量的提高、减少农药的施用、改善农业生态环境以及粮食安全问题带来了新的机遇。我国已锁定转基因生物技术为未来发展的重大目标,将有更多的转基因植物品种培育出来。然而,转基因植物商品化种植面临的一个巨大瓶颈就是环境生物安全的检测和评价,特别是转基因的逃逸及其可能带来的环境风险,即转基因通过基因漂移逃逸到野生近缘物种之后,可能引起严重的杂草问题和野生近缘种群体的局部濒危和灭绝等一系列后果。这种环境风险的存在严重地制约了转基因农作物商品化种植的决策。因此,在商品化种植之前必须对转基因逃逸所带来的潜在环境风险进行检测,以确保转基因植物的安全和可持续利用。

    转基因植物释放到环境之后,其外源基因通过基因漂移将会逃逸到转基因植物的野生近缘物种,对于转基因逃逸是否具有潜在的环境风险,其风险的程度均必需进行检测和评价。但是,到目前为止,只有对基因漂移频率检测比较有效的检测方法,而对于基因漂移逃逸后是否会带来环境风险以及风险的程度尚缺乏有效的检测方法。

    发明内容

    本发明的目的是提供一种检测评价逃逸的转基因是否导致环境风险的方法。

    转基因逃逸是否会带来环境风险,这在很大程度上取决于该基因是否引起野生近缘物种适合度(指在一定条件环境下,生物体能够生存并传递其基因给后代的能力)较大程度的改变,当适合度有较大程度的增加(适合度利益)或降低(适合度成本)均可能导致不同的环境风险。本发明利用转基因在人工受控的不同实验条件下对植物的野生近缘物种群体带来适合度“利益”和“成本”变化的关键性状进行分析,对转基因逃逸是否导致环境风险以及风险的程度进行检测,以达到转基因植物安全种植的目的。

    本发明提出的转基因逃逸导致的环境风险的检测评价方法,具体步骤包括:(1)构建含有转基因和不含转基因野生近缘物种实验群体;(2)设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验;(3)建立转基因逃逸导致环境风险的检测和评价标准。其中:

    所述的构建含有转基因和不含转基因野生近缘物种实验群体,是按照一定的组合方式,利用人工杂交获得目标转基因植物和野生近缘物种的杂种F1代和自交分离F2代实验群体来实现。具体的方法为:

    选择目标转基因植物及其非转基因亲本品种分别与野生近缘物种的个体进行杂交,获得含转基因的转基因植物-野生种的杂种F1群体(A)和不含转基因的亲本品种-野生种的杂种F1群体(B);通过对含转基因的杂种F1进行套袋自交,分别获得含有转基因和不含转基因的F2代分离群体;利用目标转基因设计的引物,对F2代分离群体进行PCR扩增,鉴定含有转基因的F2群体(C)和不含转基因的F2群体(D)。

    根据上述方法所获得的含有转基因的杂种F1群体(A)、不含转基因的杂种F1群体(B),含有转基因的自交F2分离群体(C)和不含转基因的自交F2分离群体(D),进行受控实验条件下适合度分析实验。

    所述设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验,是将获得的A、B、C、D实验群体分别按20cm×20cm或40cm×40cm的种植株距和行距,将含转基因和不含转基因的A和B群体或C和D群体在一个小区内进行单一种植和混合种植。即转基因植株的单一种植模式,非转基因植株的单一种植模式,转基因植株和非转基因植株的相间混合种植模式,见图1—图3所示。

    根据转基因的类型或功能,将受控的实验环境分别设计为有选择压的环境和无选择压的环境(例如:针对抗虫转基因植物将环境设置为有靶标害虫和无靶标害虫虫压的环境),将上述实验群体分别种植于有选择压的环境和无选择压的环境,并于实验群体植株生活史的各生长阶段,分别进行适合度相关性状的测量。 

    用于检测生态适合度所需进行测量的形态和农艺性状,主要有株高(cm)、单株分蘖数(个)、单株穗数(个)、单株种子产量(粒)、千粒重(g)、种子萌发率(%)、成苗率,等等,具体应根据所检测植物的实际情况选定。

    所述建立转基因逃逸导致环境风险的检测和评价标准,即建立复合适合度指数,来评价环境风险(%)的程度:

    各形态性状的适合度为:含转基因植株的测量值/不含转基因植株的测量值×100%。

    复合适合度为:各形态性状的适合度的平均数。 

    通过复合适合度的值(%)来评价转基因逃逸导致环境风险(%)。

    具体选择如下适合度相关性状进行测量和分析:

    根据受控实验中各处理含有转基因的实验群体和不含转基因实验群体所测量的数据的比较分析(A : B和C : D),来检测转基因对野生近缘物种带来的适合度利益(WB)或适合度成本(WC),并以此为依据确定转基因逃逸导致的环境风险。如转基因对实验群体带来的适合度变化程度越高则转基因逃逸的环境风险越高,反之则风险低或无风险。

    适合度利益(WB)或适合度成本(WC)的计算公式为:

     W  =(转基因植株测量值 - 非转基因植株测量值)/非转基因植株测量值 …(1)

    W的值变化在 -1~1之间,当W值为正值,表示存在适合度利益,当W值为负值,表示存在适合度成本,当W值为0或接近于0,表示没有适合度变化。

    复合适合度指数为各性状适合度的平均值,计算公式为:

    W comp = ∑Wi-j /N   …………………………………………………………………(2)

    其中i-j为不同的适合度形状,N 为测量性状的数目。

    本发明为一种利用适合度分析检测转基因逃逸到农作物野生近缘种带来环境风险的方法。本发明具体利用抗虫转基因水稻和非转基因水稻及其野生近缘种(野生稻/杂草稻)群体为分析材料,用转基因水稻和非转基因亲本分别与野生稻和杂草稻进行人工杂交,获得含有转基因和不含转基因的杂种F1群体以及含转基因杂种F1代的自交分离F2代群体。将含转基因和不含转基因的杂种F1群体以及F2分离群体在有虫压和无虫压的环境下进行田间种植,并对各群体的适合度相关性状:株高、单株分蘖数、单株穗数、单株结实数和千粒重进行测量。通过比较分析在有虫压环境下转基因群体的适合度利益(WB)和无虫压环境下转基因群体的适合度成本(WC),计算逃逸的转基因对野生近缘种带来的环境风险(%)。本发明在受控条件下检测转基因的环境风险,检测结果准确、效率高,对于转基因水稻商品化生产的环境安全保证具有良好的应用前景。 

    附图说明

    图1为转基因植株(×)的单一种植模式。

    图2为非转基因植株(○)的单一种植模式。

    图3为转基因植株和非转基因植株的相间混合种植模式。

    具体实施方式

    实施例1:

    利用本发明的方法检测抗虫转基因水稻Bt基因逃逸到杂草稻群体的环境风险。实验材料如表1所示。

    构建环境生物安全检测的含转基因和不含转基因野生近缘种杂种实验群体的步骤如下:

    (1)确定杂交组合:

    A. 转基因水稻 × 野生稻,

    B. 非转基因水稻亲本 ×野生稻,

    C. 转基因水稻 ×杂草稻,

    D. 非转基因水稻 ×杂草稻;

    (2)通过人工杂交,分别获得含转基因(杂交组合A和C)以及不含转基因(杂交组合B和D)的杂种F1群体;

    (3)对组合A和C的杂种F1群体进行套袋自交和转基因的检测,鉴定F2分离群体的个体是否包含转基因;

    (4)分别获得含转基因的F2分离群体(+)和不含转基因的F2分离群体(-)。

    利用人工杂交方法,以转基因栽培稻品系MF1和非转基因栽培稻亲本明恢86为父本(♂)分别与杂草稻母本W1或W2(♀)进行杂交,获得含有Bt抗虫转基因的F1代杂种(MF1/W1和MF1/W2)和不含Bt抗虫转基因的F1杂种(M86/W1和M86/W2)。同时,对含有转基因的F1杂种进行套袋自交,获得自交F2代分离群体,利用根据抗虫转基因(Bt)DNA序列设计的特异性引物对,对F2分离群体进行PCR鉴定,凡是含有转基因的植株鉴定为Bt(+),不含转基因的植株鉴定为Bt(-)。

    在田间实验时,设置2个含Bt基因的F1代、2个不含Bt基因的F1代,2个F2代Bt(+)群体和2个F2代Bt(-)群体的单种模式,4个F1代和F2代Bt(+)和Bt(-)群体均匀混合竞争种植模式。因此本实验共包括12种处理,对每种处理设置4次重复(48个小区)。每个小区种植8行×8列植株,株间距20cm。小区完全随机(区组)的方案进行田间布局和种植。将此实验在两个不同的虫压环境中进行:1)通过常规喷洒化学农药的极低虫压环境,和2)不施用任何化学农药的自然虫压环境。在实验材料不同的生育期,分别对拔节期的单株分蘖数、成熟期的株高、植株成熟后的单株穗数、单种种子数、千粒重和种子萌发率等适合度性状进行测量,即选择如下性状:

    (1) 株高(cm):从植株的地面到最长茎叶(穗)的高度;

    (2) 单株分蘖数(个):每一单个植株的所有分蘖总合;

    (3) 单株穗数(个):每一单个植株所有的穗数总合;

    (4) 单株种子产量(粒):每一单个植株的所有饱满果实数总合;

    (5) 千粒重(g):1000粒种子的重量;

    (6) 种子萌发率(%):萌发种子数/用于萌发实验的种子数 ×100%;

    (7) 成苗率(%):幼苗数/用于萌发实验的种子数×100%。

    结果如表2所示。从对各个适合度性状的单独分析来看,在低虫压环境中,含转基因的材料与不含转基因的材料在各性状上都基本一致,仅有少数性状有显著差异,说明抗虫转基因在没有虫压的情况下,对杂草稻群体的适合度几乎没有影响。而在高虫压环境中,含转基因材料的适合度性状值要较非转基因材料高,尤其是在单株种子产量性状上呈现出显著差异,由此可以说明抗虫转基因在高虫压条件下会对杂草稻带来适合度的优势。

    而采用复合适合度指数法,先将含转基因材料适合度各性状的值转化成相对于非转基因材料增加或减少的比例(W值),通过计算复合适合度指数考察抗虫转基因对适合度的影响(表3)。转抗虫基因水稻的外源Bt基因逃逸到杂草稻以后,含转基因F1和F2群体在低虫压的环境中,除了在单株穗数上比其不含转基因的F1和F2群体要高以外,其它适合度性状均没有统一的趋势,含转基因的F1代和F2代在单种和混种条件下的复合适合度指数也仅比后者的复合适合度高5.5%、1.8%、5.0%和4.8%,这表明含有转基因的杂种F1和F2群体在低虫压的环境中与其不含转基因的群体的适合度基本一致(<5%)。而在自然高虫压的环境中,含转基因的F1和F2群体在重要的单株种子产量性状上较其非转基因群体远高以外,其它适合度性状也都有一定程度的提高,因此含转基因的F1代和F2代在高虫压的单种和混种条件下的复合适合度指数也比后者的复合适合度高10.8%、7.7%、22.0%和12.0%,这表明含有转基因的杂种F1和F2群体的适合度在高虫压的环境中远高于其不含转基因的群体(>10%)。也表明含有转基因的分离群体比其不含转基因的群体具有更高的生存和竞争优势。进一步推断,转抗虫Bt基因逃逸到杂草稻群体,会在有虫害的情况下导致杂草稻的更旺盛生长,带来一定的环境风险。

    实施例2:

    利用本发明方法检测抗除草剂转基因水稻Aroa基因逃逸到普通野生稻的环境风险。实验材料如表4所示。

    利用人工杂交的方法,以抗除草剂转基因水稻MA和非转基因水稻M86为父本(♂)分别与普通野生稻W2(作为母本♀)进行杂交,获得包含有抗除草剂转基因的F1(W2-MA)和不含抗除草剂转基因的F1(W2-M86)杂种群体。

    在进行田间实验时,设置含抗除草剂的F1群体(W2-MA)单种、不含抗除草剂的F1群体(W2-M86)单种及W2-MA和W2-M86均匀混合竞争种植的处理,种植于不喷洒除草剂和喷洒除草剂的环境中。实验包括6种处理,每一处理包括4次重复(共24个小区),每个小区种植8行×8列植株,株间距40cm。小区完全随机(区组)的方案进行田间布局和种植。在实验材料不同的生育期,分别对拔节期的单株分蘖数、成熟期的株高、植株成熟后的单株穗数、单种种子数、千粒重和种子萌发率等适合度性状进行测量,结果如表4所示。

    从对各个适合度性状的单独分析来看,在喷洒除草剂的环境中,由于非转基因水稻受到除草剂影响,大多数不能正常生长和发育,在生殖性状很低;而转基因材料则基本不受影响,两者田间表现差异巨大。而在没有喷洒除草剂的环境中,抗除草剂基因依旧表现出一定的适合度优势,这主要体现在单株分蘖数、单株穗数和单株种子数上(表5)。

    而采用复合适合度法对含转基因的F1代群体和不含转基因的F1代群体进行综合评估时,发现含在使用除草剂的情况下,转基因的F1代群体的适合度在单种和混种模式下要相较于不含转基因群体的适合度分别高172.9%和255.3%(表6),这表明抗除草剂Aroa基因在逃逸后如果遇到除草剂选择压,将会提供巨大的适合度优势。而在不使用除草剂情况下,转基因材料的复合度指数相对于非转基因材料为8.8%和12.0%,表明Aroa基因在逃逸到没有除草剂使用的环境中后,也为野生稻群体提高期适合度,导致相应的生态结果。

    表1、实施例1中所包含的实验材料。

    序号 材料名称 来源 特性 1 转基因水稻品系(MF1) 中国福建 栽培稻 2 非转基因亲本明恢86(M86) 中国福建 栽培稻 3 杂草稻群体W1 中国海南 杂草稻

    表2无虫压和有虫压环境中,各实验材料的适合度性状及含转基因材料与非转基因间的比较结果。其中粗体带“*”表示与非转基因材料相比统计显著(p<0.05),粗体带“                                                ” 表示与非转基因杂交组合相比统计净显著(p<0.1)。

      。

    表3、根据表2结果,计算各实验处理下含转基因材料的各适合度性状相较于不含转基因材料的W值及其复合适合度指数。

    表4、实施例2中所包含的实验材料

    序号 材料名称 来源 特性 1 抗除草剂转基因水稻品系(MA)(含Aroa基因) 中国福建 栽培稻 2 非转基因亲本明恢86(M86) 中国福建 栽培稻 3 野生稻群体(W2) 中国广东 野生稻

    表5、 使用和不使用除草剂环境中含转基因和不含转基因野生稻群体各适合度性状值及含转基因材料与非转基因间的比较结果。其中粗体带“*”表示与非转基因材料相比统计显著(p<0.05)。

     。

    表6、根据表5结果,计算各实验处理下含转基因材料的各适合度性状相较于不含转基因材料的W值及其复合适合度指数。

     。

    关 键  词:
    一种 转基因 逃逸 导致 环境 风险 检测 评价 方法
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