技术领域
本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还涉及一种3，5-二氟代酪氨酸(简写为F2Y)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的方法。本发明还涉及用这套翻译系统和这种方法产生的含有3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质，例如，插入3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体，以及插入3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质的应用。
背景技术
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素(ubiquitin)介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10％的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到 非常重要的作用。
19F-NMR技术由于其化学位移范围大、不易出现峰重叠及灵敏度高等优点，自上个世纪50年代出现以来，在分析光学异构体、生命科学等研究中有其特殊意义。在体内核磁共振技术中，19F-NMR与其他方法相比，在不损伤样品的条件下，就可进行实时定量监测。近30年，引入氟代指示剂进行体内19F-NMR的研究，含氟生物活性物质以及含氟材料的研究受到很大的重视，19F-NMR技术及其应用发展起来。从近10年的情况来看，含氟生物活性物质的研究以及在医药、农药和具有优异性能的含氟材料的研究应用受到很大的重视，这是近期19F-NMR研究发展的一个主要特点。
根据先前的报道，含有3，5-二氟代酪氨酸的肽段作为蛋白酪氨酸激酶的底物，其表现出了与相应的含有酪氨酸的肽段作为底物类似的效率，并且不会显著影响蛋白酪氨酸磷酸酶的催化活性。因此本研究旨在通过遗传密码扩展，用非天然氨基酸3，5-二氟代酪氨酸替代酪氨酸，使其作为氟代指示剂，从而可以通过19F-NMR技术来检测及量化酪氨酸磷酸化水平。同时，本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其发明名称为“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”；WO 2002/085923，其发明名称为“IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”；WO 2004/094593，其发明名称为“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定点 特异性插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，Angewandte Chemie Int.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.Opinion in Chemical Biology9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。
发明内容
1、技术问题
本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示氨基酸和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3，5-二氟代酪氨酸(简写为F2Y)优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入F2Y。这是本发明人首次发现的，同时，本发明人还解析了它的高分辨率晶体结构，相应地，在本发明中将其命名为正交3，5-二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)。
在上述发现的基础上，本发明提供一种利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质及其应用。
因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入蛋白质的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统，并且提供利用该翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的方法。
本发明还提供利用本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统产生的含有至少一个3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入目的蛋白中，所述目 的蛋白包括，但不限于，原核蛋白酪氨酸激酶Etk。通过本发明的方法得到的包含3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体蛋白可以作为氟代指示剂，从而通过19F-NMR技术来检测及量化酪氨酸磷酸化水平。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法也可以用于在蛋白酪氨酸激酶之外的多种蛋白中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸，并不局限于该蛋白。2、技术方案
本发明人经过筛选，获得一种正交氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性，在本发明中将其命名为正交3，5-二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)。同时，本发明人还解析了它的高分辨率晶体结构。并且，本发明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研发了3，5-二氟代酪氨酸翻译系统。
本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列之外，术语“本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3，5-二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”还包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且还包括将SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
并且，编码本发明的正交3，5-二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。优选地，所述编码核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
具体来说，本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)识别选择密码子(selectorcodon)如琥珀终止密码子(TAG)从而将非天然氨基酸3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入到多肽链中的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统。所述3，5-二氟代酪氨酸翻译系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交 -tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶不会识别O-tRNA。类似地，本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地识别内源性tRNA。利用所述翻译系统能够产生在翻译过程中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的大量蛋白质。
在一些方面中，本发明提供3，5-二氟代酪氨酸翻译系统。所述翻译系统包含：
(a)非天然氨基酸，即3，5-二氟代酪氨酸，
(b)本发明的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和
(c)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3，5-二氟代酪氨酸)，优先氨酰化所述O-tRNA。
优选地，本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀密码子。更优选地，本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
所述系统中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即为本发明人首次发现的氨酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列和SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
在本发明的优选方面中，本发明提供一种3，5-二氟代酪氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)3，5-二氟代酪氨酸；
(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5-二氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
优选地，所述3，5-二氟代酪氨酸翻译系统还包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组分衍生自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA(O-tRNA)为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，优选地，O-tRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶可以包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。在优选的实施方案中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。
在一些方面中，本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
在一些方面中，本发明提供包含编码本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要正交氨酰基-tRNA合成酶和正交tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿主细胞可以是真细菌细胞，优选大肠杆菌。
本发明还提供产生在至少一个所选位置定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质的方法。所述方法利用上述3，5-二氟代酪氨酸翻译系统。所述方法通常包括下述步骤：
(a)提供含有以下组分的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统的步骤：
(i)非天然氨基酸，即3，5-二氟代酪氨酸；
(ii)本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；
(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用3，5-二氟代酪氨酸优先氨酰化所述O-tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3，5-二氟代酪氨酸，在所述目标蛋白质的翻译过程中，3，5-二氟代酪氨酸氨酰化的正交RNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及3，5-二氟代酪氨酸，从而介导3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含有3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质。
本领域技术人员应该理解，适当的重组载体的构建和宿主细胞的筛选可以通过常规分子克隆技术和筛选技术实现。
本领域技术人员应该理解，在步骤(b)中，将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中可以通过多种方式进行，例如，将所述正交tRNA序列、编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列分别可操作性地连接到适当的载体中，再以任意次序或三者共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到一个适当的载体中(两种序列之间有或无适当的接头连接)，将编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可以将所述正交tRNA序列和编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作性地连接到一个适当的载体中(两种序列之间有或无适当的接头连接)，将编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中。或者，也可以将正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码目标蛋白质的核酸序列以任意适当的顺序可操作性地连接在一起，然后克隆到一个载体上，最后转化到适当的宿主细胞中。上述克隆方案都是可行的，本领域技术人员可以根据实验的需要容易地进行适当的选择。
另外，本领域技术人员还应该理解，为了避免宿主细胞对外源重组载体的“踢除”效应，往往选择用带有不同抗生素标记的载体来构建需要共 同转化到同一宿主细胞中的核酸序列片段。对于适当的载体的选择、重组载体的构建、宿主细胞的转化或转染等等，都是本领域的常规技术，例如，可以参见美国冷泉港实验室出版的分子克隆手册。
在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸(即3，5-二氟代酪氨酸)优先氨酰化所述O-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突变体(即，本发明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酰基-tRNA合成酶分子库进行所述O-RS的正选择和负选择(参见下述实施例2)。在一些实施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供O-tRNA的序列，O-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA，例如，所述O-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者O-tRNA包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。
还可在宿主细胞内实施产生含有3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统(即，包含编码本发明的O-RS的核苷酸序列、O-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目标蛋白质的核酸)，而在适宜的培养条件下(例如，在培养基中添加3，5-二氟代酪氨酸等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)。
本发明还提供生产含有3，5-二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突变体的方法，其利用上述产生在至少一个所选位置定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的突变蛋白质的方法，其中所用的编码原核蛋白酪氨酸激酶突变体的核酸序列在选定的位置包含所述正交tRNA特异性识别的选择密码子，在酪氨酸激酶的翻译期间，3，5-二氟代酪氨酸定点插入到所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在选定位置含有3，5-二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突变体。
优选地，本发明还提供生产含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体的方法，所述方法利用上述3，5-二氟代酪氨酸翻译系统进行， 所述方法通常包括下述步骤：
(a)提供含有以下组分的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统的步骤：
(i)3，5-二氟代酪氨酸；
(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；
(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3，5-二氟代酪氨酸优先氨酰化所述O-tRNA；和
(iv)编码所述原核蛋白酪氨酸激酶的核酸，例如，但不限于，SEQ ID NO：7，其中所述核酸含有所述O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3，5-二氟代酪氨酸，在所述目标蛋白质(即原核蛋白酪氨酸激酶)的翻译过程中，3，5-二氟代酪氨酸氨酰化的正交RNA识别编码酪氨酸激酶的mRNA上的选择密码子以及3，5-二氟代酪氨酸，从而介导3，5-二氟代酪氨酸定点插入所述目标蛋白质的特定位置(即，所述选择密码子对应的氨基酸位置)。
本发明还提供利用本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统产生的作为氟代指示剂的含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体，在野生型原核蛋白酪氨酸激酶的574位引入3，5-二氟代酪氨酸，所述酪氨酸激酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。所述激酶突变体与野生型酪氨酸激酶一样在适宜条件下可以进行活性中心酪氨酸的自磷酸化，从而激活自身的蛋白激酶活性。
本发明还提供一种新颖的鉴定目标蛋白的酪氨酸磷酸化位点的方法，所述方法包括利用本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统将所述目标蛋白中推定进行磷酸化的酪氨酸取代为3，5-二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5-二氟代酪氨酸的目标蛋白突变体，利用该目标蛋白突变体作为氟代指示剂，通过19F-NMR技术来检测3，5-二氟代酪氨酸的磷酸化，从而鉴定所述酪氨酸位点是否是酪氨酸磷酸化位点。
例如，已知原核蛋白酪氨酸激酶具有较低程度的自身磷酸化能力，目 前尚没有合适的技术能够检测并且量化其自身磷酸化水平。但是，利用本发明的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统将原核蛋白酪氨酸激酶活性中心574位酪氨酸残基替换为3，5-二氟代酪氨酸，得到含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体，再通过19F-NMR技术来检测并且量化该原核蛋白酪氨酸激酶突变体的自身酪氨酸磷酸化水平。该原核蛋白酪氨酸激酶突变体的酪氨酸磷酸化水平在一定程度上可以代表野生型原核蛋白酪氨酸激酶的自身磷酸化水平。此外，这个检测结果也证明原核蛋白酪氨酸激酶活性中心574位酪氨酸是其自身酪氨酸磷酸化位点。
因此，本发明提供下述：
1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
2.一种3，5-二氟代酪氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)3，5-二氟代酪氨酸；
(ii)第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5-二氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
3.如第2项所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述选择密码子是琥珀密码子，并且所述翻译系统还包含编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其包含编码第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列。
5.如第4项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
6.一种产生在至少一个所选位置定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸的 突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供第2项所述的3，5-二氟代酪氨酸翻译系统，该系统包含：
(i)3，5-二氟代酪氨酸；
(ii)第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5-二氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3，5-二氟代酪氨酸，在所述目标蛋白质的翻译期间，3，5-二氟代酪氨酸氨酰化的正交tRNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及3，5-二氟代酪氨酸，从而介导3，5-二氟代酪氨酸定点特异性插入所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含3，5-二氟代酪氨酸的所述目标蛋白质。
7.如第6项所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
8.生产含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体的方法，其利用第6项所述的方法，其中所用的编码原核蛋白酪氨酸激酶突变体的核酸序列在选定的位置包含所述正交tRNA特异性识别的选择密码子，在激酶的翻译期间，3，5-二氟代酪氨酸定点插入到所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在选定位置含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体。
9.由第8项所述的方法获得的含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8。
10.一种鉴定目标蛋白的酪氨酸磷酸化位点的方法，所述方法包括利用第6项的方法将所述目标蛋白中推定进行磷酸化的酪氨酸取代为3，5-二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5-二氟代酪氨酸的目标蛋白突变体，利用该目标蛋白突变体作为氟代指示剂，通过19F-NMR技术来检测3，5-二氟代酪 氨酸的磷酸化，从而鉴定所述酪氨酸位点是否是酪氨酸磷酸化位点。
11.编码第1项的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
13.如第11项所述的核苷酸序列，其为SEQ ID NO：3。
3、有益效果
本研究通过筛选得到了一种正交氨酰基-tRNA合成酶，并且，在此基础上研发了3，5-二氟代酪氨酸翻译系统。通过该系统可以在目标蛋白——例如，原核蛋白酪氨酸激酶Etk中定点特异性插入3，5-二氟代酪氨酸，产生574位含有3，5-二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突变体，将其作为氟代指示剂，从而可以通过19F-NMR技术来检测及量化酪氨酸磷酸化水平。
我们这种探测酪氨酸磷酸化水平的新方法与传统方法相比有许多的优势。首先，可以直接检测及量化目标蛋白质某一特定位点的酪氨酸磷酸化水平。其次，样品可以随时冻存，接着再进行19FNMR光谱分析，这样，可以最大限度地缩短样品的制备时间，以便更精确地定量蛋白质样品的磷酸化水平。第三，由于19F的高灵敏度，相对于环境的化学位移各向异性以及19F-19F直接耦合的缺乏，单位点整合19F结合NMR分析可以更有效地用来阐明蛋白的动态特性。最后，NMR研究可能有助于揭示真核和原核蛋白酪氨酸激酶活性状态和非活性状态的运动特性，以及这些状态之间的动态交换。这些独特的优势使我们能够获得直接证据来证明并且量化原核蛋白酪氨酸激酶Etk活性中心磷酸化水平，而这在以前是无法实现的。并且，这种监测酪氨酸激酶激活及活性的方法灵敏度高，选择性强，可以为酪氨酸激酶/底物蛋白相互作用的新型抑制剂筛选提供有效的途径。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1是本发明的正交3，5-二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)的晶体结构图；
图2：图2A是体外氨酰化作用的酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图2B是F2Y-绿色荧光蛋白的SDS-PAGE电泳图，图2C和图2D是F2Y-绿 色荧光蛋白的质谱图；
图3是3，5-二氟代酪氨酸(F2Y)(下图)和o-磷酸-3，5-二氟代酪氨酸(pF2Y)(上图)的19F-NMR谱图；
图4：图4A是野生型原核蛋白酪氨酸激酶(Etk，泳道1)和Etk-574-F2Y(泳道2)的SDS-PAGE电泳图，图4B是Etk-574-F2Y和酪氨酸磷酸酶PTP1B的Western检测图(上图是pTyr抗体，下图是His抗体)，图4C是Etk-574-F2Y磷酸化的19F-NMR谱图，图4D是Etk-574-F2Y脱磷酸化的19F-NMR谱图；
图5是正交tRNA、野生型酪氨酰tRNA合成酶、本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶、绿色荧光蛋白突变体、原核蛋白酪氨酸激酶突变体和蛋白酪氨酸磷酸酶的序列。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。
实施例1：o-磷酸-3，5-二氟代酪氨酸(pF2Y)的化学合成
取100mM三氯氧磷、100mM3，5-二氟代酪氨酸(购自上海吉尔生化公司)和500mM氢氧化钠，溶解至5mL，然后室温搅拌1h。收集水相，通过HPLC分离纯化得到白色粉末，产率10％。(YMC AA12S052503WT column，12ml/min flow rate，from10％to90％CH3CN，0.1％TFA(w/v)in water，over the course of 30 min).MS：m/z：298[M+H]+；1H-NMR(600MHz，D2O)：7.03(d，2H)4.01(dd，1H)3.21(m，2H)。
以上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自北京化工厂，均为分析纯以上级别。
实施例2：进化F2Y特异性氨酰基-tRNA合成酶
为了在基因中位点特异性插入F2Y，需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA(MjtRNACUAY)/酪氨酰tRNA合成酶(MjYRS，野生型，其氨基酸序列为SEQID NO：2)对。MjYRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒(购自美国scripps研究所PeterG.Schultz实验室)中，位于该质粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的启动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jw1库，该突变库的构建方法为：在MjYRS基因上挑选6个位点(Y32，Leu65，Phe108，Gln109，Asp158，和Leu162)引入NNK突变(N＝A+T+C+G；K＝T+G)，另外6个位点(Ile63，Ala67，His70，Y114，Ile159，Vall64)或随机突变为Gly或保持不变(参见Xie，J.；Liu，W.S.；Schultz，P.G.Angew.Chem.，Int.Ed.2007，46，9239-9242；Wang，JY.；Zhang W.；Song WJ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010，132，14812-14818)。
通过正负筛选来进化特异性识别F2Y的氨酰基-tRNA合成酶。正筛选质粒包含MjtRNACUAY，TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因，启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的T7RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含MjtRNACUAY，在阿拉伯糖操纵子下的琥珀突变芽孢杆菌RNA酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选：包含有正筛选质粒的E.coli DH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-lib-jw1库，SOC培养基(2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖)在37℃培养1小时。之后换用极限培养基(GMML极限培养基的配方：M9盐/甘油：764gNa2HPO4.7H2O或者30g Na2HPO4，15g KH2PO4，2.5g NaCl，5g NH4Cl，50ml甘油，高压灭菌，pH7.0；1M MgSO4：高压灭菌；50mM CaCl2：高压灭菌；25mM FeCl2：过滤灭菌；0.3M亮氨酸：溶解于0.3M NaOH中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基：200ml M9盐/甘油，2ml MgSO4，2ml CaCl2，2ml FeCl2，1ml亮氨酸)洗两次，铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml3％琼脂粉，1mM F2Y，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素)，37℃培养60小时。收取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选的pBK-lib-jw1转 化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)的LB固体培养基(每升培养基含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl)。37℃培养8-12小时。共重复3轮。
最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有1mM F2Y、氯霉素60，80，120，160μg/mL的GMML固体培养基上，及不包含F2Y、但包含氯霉素0，20，40，60μg/mL的GMML固体培养基。挑选在在1mM F2Y160μg/mL氯霉素的培养基上生长，而在0mM F2Y，浓度大于20μg/mL氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。最终挑出1个克隆，插入3，5-二氟代酪氨酸效率最高，测序表明，克隆所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体(F2YRS)的氨基酸序列为SEQID NO：4所示，其中突变位点为Tyr32Arg，Leu65Tyr，His70Gly，Phe108Asn，Gln109Cys，Asp158Asn和Leu162Ser。
本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列之外，术语“正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3，5-二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”还包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且还包括将SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
同时，本发明人还解析了F2YRS的晶体结构(图1)，为F2YRS特异性整合F2Y提供了结构基础。
实施例3：体外氨基酰化作用分析
为了验证F2YRS在目标蛋白中整合F2Y的高效性和保真度，我们进行了体外氨基酰化作用分析。取50mM氯化钠，20mM氯化镁，4mM二硫苏糖醇，2mM ATP，10μM Tyr tRNA，3μMF2YRS和2mM酪氨酸或者F2Y，溶解于20mM，pH8.0的Tris缓冲液中，37℃孵育1h。反应液进行24h酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图2A所示，F2YRS 只能整合F2Y，而无法整合酪氨酸。
实施例4：表达F2Y-绿色荧光蛋白及质谱鉴定
将正交tRNA(SEQ ID NO：1)和筛选出来的编码F2YRS的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上，编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(151TAG)(SEQ ID NO：5)构建到pET载体(购自美国scripps研究所PeterG.Schultz实验室)上，然后共转化到DH10B细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37℃培养到OD600约等于1.2时，向LB培养基中加入1mM IPTG，0.02％阿拉伯糖(购自sigma公司)及0.5mM F2Y培养细胞，对照不加入F2Y。8小时之后，收菌，Ni-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图2B)。
我们发现，只有在存在F2Y的培养基中才能纯化出全长的绿色荧光蛋白，这说明筛选出来的F2YRS可以特异性的识别F2Y。在LB培养基中F2Y-绿色荧光蛋白的产率为60mg/L，而野生型绿色荧光蛋白的产率为100mg/L。为了检测F2Y仅仅插入到绿色荧光蛋白的151位琥珀突变位点，我们对151-F2Y-绿色蛋白进行了ESI-TOF质谱检测，检测结果分子量为27746Da(图2C，D)，与计算的分子量27746Da吻合。
实施例5：表达F2Y-原核蛋白酪氨酸激酶突变体及酪氨酸磷酸化检测
我们选取原核蛋白酪氨酸激酶Etk的C末端胞浆区片段(451位-726位，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)，用基因工程方法构建了Etk突变体，其中574位突变为TAG终止密码子，然后用实施例4中的相同方法在Etk突变体的574位定点特异性插入F2Y，表达产生突变蛋白Etk-574-F2Y(氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)，产率为12.5mg/L，而野生型Etk的产率为20mg/L(图4A)。
为了验证Etk活性中心的574位酪氨酸能否进行自磷酸化，我们取突变蛋白Etk-574-F2Y，于pH8.5的缓冲液(含有：20mM Tris，20mM NaCl，2mM ATP和5mM MgCl2)中25℃孵育30min。作为对照，我们往突变蛋白Etk-574-F2Y中加入0.125mg/mL蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B(通过常规分子生物学方法克隆表达而得到，或者也可以商购获得，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)进行脱磷酸化，然后于pH8.5的缓冲液(含有：20mMTris，20mM NaCl和1mMEDTA)中25℃孵育30min。孵育结束后，分别取少量混合液进行Western验证，剩余样品立刻冻干后进行19F-NMR分析。同时，我们取F2Y和实施例1中新合成的pF2Y进行19F-NMR分析，作为验证F2Y是否磷酸化的对照。结果如图3和图4C，D所示，F2Y的19F化学位移为-133.1ppm，而pF2Y为-126.7ppm(图3)。图4C和D显示，仅含有Etk-574-F2Y的混合液分别在-122.3ppm和-134.5ppm处都出现了信号峰，而加入PTP1B的混合液，仅在-134.5ppm处出现信号峰，说明Etk-574-F2Y的574位二氟代酪氨酸在缓冲液中发生了自磷酸化，这一结论与western的检测结果完全一致(图4B)。同时，通过信号强度对比分析发现，仅有3.8％的二氟代酪氨酸发生了磷酸化，这与先前报道中所称的原核蛋白酪氨酸激酶活性中心的磷酸化水平很低也是一致的。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。