一种重组多功能纤维素酶的生产方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102093959 A (43)申请公布日 2011.06.15 CN 102093959 A *CN102093959A* (21)申请号 201010585035.8 (22)申请日 2010.12.13 C12N 1/15(2006.01) C12N 9/42(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 郭丽琼 王晓丹 林俊芳 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54) 发明名称 一种重组多功能纤维素酶的生产方法 (57) 摘要 本发明属。

2、于微生物发酵工程领域， 涉及重组 多功能纤维素酶的制备方法， 其特征是将多功能 纤维素酶基因遗传转化银耳芽孢获得银耳芽孢 工程菌株， 作为生产菌株， 采用甘蔗渣粉为最佳培 养基， 在优化的培养条件下摇瓶发酵制备重组多 功能纤维素酶。甘蔗渣培养基配方为甘蔗渣粉 17-23g/L， 酵母膏 3.1-4.9g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷酸二氢钾0.46g/L， 硫酸镁1g/L， pH值5.0-5.5。 最佳培养条件为 ： 培养温度 25、 培养时间 4d、 摇 床转速 180r/min。最佳产酶量为 ： Xylanase 酶活 1.09105U/L， CMCase 酶活 3.7104U/L。本。

3、发明 的方法能有效地使银耳芽孢工程菌株利用廉价的 农业废弃物甘蔗渣生产重组多功能纤维素酶。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 9 页 CN 102093965 A1/1 页 2 1. 一种重组多功能纤维素酶的制备方法， 其特征是 ： 多功能纤维素酶基因转化银耳芽 孢获得银耳芽孢工程菌株， 作为生产菌株， 以甘蔗渣粉为主要原料作为培养基， 摇瓶发酵生 产重组多功能纤维素酶。 2.如权利要求1所述的制备方法， 其特征是所述培养基的配方为 ： 甘蔗渣粉17-23g/L， 酵母膏 3.1-4.9 g/L， 磷酸。

4、氢二钾 1g/L， 磷酸二氢钾 0.46g/L， 硫酸镁 1g/L， pH 值 5.0-5.5。 3. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其特征是最所述摇瓶发酵的条件是发酵温度 23-25、 发酵时间 3-4d、 转速 165-190r/min。 4. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其特征是最所述摇瓶发酵的条件是培养温度 25、 培养时间 4d、 转速 180r/min。 5.如权利要求1所述的制备方法， 其特征是所述的菌株菌种龄为6072h， 接种量1-5%。 6. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 将 ycLes3 菌株接种于 PDSA 固体培养基上。

5、， 25培养 4 5d， 挑取单菌落接种于 100mL PDSB 液体培养基中， 25， 180r/min 振荡培养 72h ； （2） 配制甘蔗渣培养基 ： 甘蔗渣粉 17-23g/L， 酵母膏 3.1-4.9 g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷 酸二氢钾 0.46g/L， 硫酸镁 1g/L， 调节 pH 值 5.0-5.5 ； （3） 在超净工作台中进行接种， 接种量 1-5%， 接种后置于 25下摇床培养， 摇床转速 165-190r/min 。 7.（4） 培养 4d 后终止培养， 离心收集发酵液。 8. 如权利要求 6 所述的制备方法， 其特征在于步骤 （1） 所述的 PDSA 固。

6、体培养基配方为 以下重量份数的物质构成 ： 马铃薯 200 份、 葡萄糖 20 份、 磷酸氢二钾 3 份、 硫酸镁 1.5 份、 葡 萄糖 20 份、 琼脂 20 份， 水补充至总重量 1000 份。 9. 如权利要求 6 所述的制备方法， 其特征在于步骤 （1） 所述的 PDSA 液体培养基配方为 以下重量份数的物质构成 ： 马铃薯 200 份、 葡萄糖 20 份、 磷酸氢二钾 3 份、 硫酸镁 1.5 份、 葡 萄糖 20 份， 水补充至总重量 1000 份。 权 利 要 求 书 CN 102093959 A CN 102093965 A1/4 页 3 一种重组多功能纤维素酶的生产方法 技。

7、术领域 0001 本发明属于微生物发酵工程领域， 具体涉及一种利用银耳芽孢工程菌株生产多功 能纤维素酶的方法。 利用甘蔗渣高效生产重组多功能纤维素酶的方法。 背景技术 0002 纤维素、 半纤维素是自然界最丰富的可再生资源之一， 是植物细胞壁的主要组 成物质。地球每年由光合作用产生数亿吨的植物干物质 （多糖类物质） ， 其主要成分就是 纤维素和半纤维素。纤维素和半纤维素的酶学降解又是目前公认的最有效、 最清洁的 转化方法。其生物降解需要纤维素酶的作用。而纤维素酶是一种复合酶系， 主要包括内 切 -1,4-D- 葡聚糖酶 （E.C. 3.2.1.4） 、 外切 -1,4-D- 葡聚糖酶 （E.C。

8、. 3.2.9.11） 和 - 葡萄糖苷酶 （E.C. 3.2.1.21） 。纤维素的降解需要这些酶的协同作用才能完成， 单一酶 组分对纤维素的降解能力很差。多功能纤维素酶 （MFC） 同时具有内切 -1,4- 葡聚糖酶、 外切 -1,4- 葡聚糖酶和内切 -1,4- 木聚糖酶 3 种酶活性， 能高效分解天然纤维素。 0003 目前生产纤维素酶的主要生产菌株有木霉、 青霉和曲酶， 生产方法是通过对这 些丝状真菌的固体发酵或液体发酵获得纤维素酶， 由于这些丝状真菌所产生的纤维素酶 成分单一， 在实际应用中酶的活力较低， 不能有效地降解纤维素 （如上所述纤维素的降解 需要多种酶的协同作用才能完成）。

9、 ， 而且目前纤维素酶的生产工艺复杂、 生产成本高。本 发明的银耳芽孢工程菌株生产的多功能纤维素酶同时具有内切 -1,4- 葡聚糖酶、 外 切-1,4-葡聚糖酶和内切-1,4-木聚糖酶3种酶活性， 能高效地降解纤维素。 而且银 耳芽孢工程菌株的启动子为组成型启动子， 不受其他诱导物的影响， 生产性能稳定。同时， 本发明使用的培养基为农业废弃物甘蔗渣， 生产成本低。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种利用银耳芽孢工程菌株高效生 产重组多功能纤维素的方法。 0005 本发明通过以下技术方案实现上述目的 ： 发明提供了一种重组多功能纤维素酶的生产方法， 多功能纤维素酶。

10、基因转化银耳芽孢 获得银耳芽孢工程菌株， 作为生产菌株， 以甘蔗渣粉为主要原料作为培养基， 摇瓶发酵生产 重组多功能纤维素酶。 0006 所述培养基的配方为 ： 甘蔗渣粉 （20 目） 17-23g/L， 酵母膏 3.1-4.9 g/L， 磷酸氢 二钾 1g/L， 磷酸二氢钾 0.46g/L， 硫酸镁 1g/L， pH 值 5.0-5.5 ； 摇瓶发酵的条件是发酵温度 23-25、 发酵时间 3-4d、 转速 165-190r/min。最佳培养条件为 ： 培养温度 25、 培养时间 4d、 摇床转速 180r/min。 0007 所述的银耳芽孢工程菌株菌种龄 60-72h， 菌株在培养基中的接。

11、种量为 1-5%， 即每 100mL 的培养基中接种 1-5mL 的银耳芽孢菌种， 其芽孢浓度的 OD600值为 1.5-1.9。该银耳 芽孢工程菌株是多功能纤维素酶基因转化银耳芽孢获得的， 其制备方法可参见赵淑娴硕士 说 明 书 CN 102093959 A CN 102093965 A2/4 页 4 论文 （多功能纤维素酶基因mfc遗传转化银耳芽孢的研究， 华南农业大学硕士论文， 2008 年 6 月） 。 0008 可以采用以下优选方案进行发酵生产 ： （1） 将所述银耳芽孢工程菌株接种于 PDSA 固体培养基上， 25培养 4 5d， 挑取单菌 落接种于 100mL PDSB 液体培养。

12、基中， 25， 180r/min 振荡培养 72h ； （2） 配制甘蔗渣培养基， 甘蔗渣粉 （20 目） 17-23g/L， 酵母膏 3.1-4.9 g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷酸二氢钾 0.46g/L， 硫酸镁 1g/L， pH 值 5.0-5.5， 分装于 250mL 三角瓶中， 每瓶装液 量 100mL， 高压灭菌 ； （3） 在超净工作中每瓶接种 1mL 步骤 （1） 中培养的菌种， 接种后置于 25下摇床培养， 摇床转速 165-190r/min。 0009 （4） 培养 4d 后终止培养， 离心收集发酵液。 0010 其中的 PDSA 固体培养基配方为以下重量份数的物质构。

13、成 ： 马铃薯 200 份、 葡萄糖 20 份、 磷酸氢二钾 3 份、 硫酸镁 1.5 份、 葡萄糖 20 份、 琼脂 20 份， 水补充至总重量 1000 份。 PDSA 液体培养基配方为以下重量份数的物质构成 ： 马铃薯 200 份、 葡萄糖 20 份、 磷酸氢二 钾 3 份、 硫酸镁 1.5 份、 葡萄糖 20 份， 水补充至总重量 1000 份。 0011 本发明是通过单因素筛选、 PB 设计及响应面实验的方法获得了银耳芽孢工程菌株 高效生产重组多功能纤维素的最佳培养基配方及最佳培养条件。不仅为重组多功能纤维 素酶的高效生产提供了一种有效的方法， 而且也为农业废弃物的合理利用提供科学理。

14、论依 据。 0012 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果 ： 1. 本发明的方法能有效地使银耳芽孢工程菌株利用廉价的农业废弃物甘蔗渣生产重 组多功能纤维素酶。 0013 2. 本发明方法所产生的重组多功能纤维素酶， 其酶的分子量大小与天然从福寿螺 胃液中分离的多功能纤维素酶的大小相一致， 为 48.6KDa， 酶的活性也与天然的相一致。比 原核表达系统和酵母表达系统表达的重组多功能纤维素酶在酶学性质上均有显著的优势， 原核表达系统的重组多功能纤维素酶活性低， 且是胞内酶不易纯化， 酵母表达系统表达的 重组多功能纤维素酶酶由于被过度糖基化， 因此酶的活性也不及天然的多功能纤维素酶。 附图说。

15、明 0014 图 1 是银耳芽孢工程菌株在不同氮源下培养产生的重组多功能纤维素酶的酶活 性 ； 图 2 是银耳芽孢工程菌株在不同碳源下培养产生的重组多功能纤维素酶的酶活性 ； 图 3 酵母膏对重组多功能纤维素酶的 Xylanase 活力的交互作用 ； 图 4 转速对重组多功能纤维素酶的 Xylanase 活力的交互作用 ； 图 5 酵母膏对重组多功能纤维素酶的 CMCase 活力的交互作用 ； 图 6 转速对重组多功能纤维素酶的 CMCase 活力的交互作用 ； 图 7 N=12 的 Plackett-Burman 实验设计与 MFC 的木聚糖酶 (Xylanase) 活力结果 ； 图 8 N。

16、=12 的 Plackett-Burman 实验设计与 MFC 的内切葡聚糖酶 (CMCase) 活力结果 ； 图 9 响应面设计与结果 ； 说 明 书 CN 102093959 A CN 102093965 A3/4 页 5 图 10 响应面设计 MFC 的木聚糖酶 （Xylanase） 活力的多元二次模型和变量分析 ； 图 11 响应面设计 MFC 的内切葡聚糖酶 (CMCase) 活力的多元二次模型和变量分析。 具体实施方式 0015 下面结合实施例， 对本发明技术方案作进一步说明。 0016 实施例 1 配制培养基 ： PDSA培养基 ： 马铃薯 （去皮） 200g、 葡萄糖20g、 。

17、磷酸氢二钾3g、 硫酸镁1.5g、 葡萄糖20g、 琼脂 20g， 蒸馏水定容至 1000mL， 高压灭菌后备用。 0017 PDSB 培养基 ： PDSA 培养基中不加琼脂， 高压灭菌后备用。 0018 基础产酶培养基 ： 碳源 20g、 氮源 4g、 磷酸氢二钾 1g、 磷酸二氢钾 0.46g、 硫酸镁 1g， 调节初始 pH 为 5.5， 蒸馏水定容至 1000ml， 高温灭菌。 0019 重组多功能纤维素酶多种生产方法的对比 ： （1） 根据赵淑娴硕士论文 （多功能纤维素酶基因mfc遗传转化银耳芽孢的研究， 华南农 业大学硕士论文， 2008 年 6 月） 的方法， 构建获得银耳芽孢工。

18、程菌株 ycLes3， 接种于 PDSA 平 板 25培养 4 5d， 挑取单菌落接种于 100mL PDSB 培养基， 25， 180 r/min 振荡培养 3d。 0020 （2）在基础产酶培养基的基础上， 以葡萄糖为唯一碳源， 硫酸铵、 磷酸二氢铵、 蛋白胨、 酵母膏、 牛肉膏、 玉米粉、 麸皮、 黄豆粉分别为氮源接种 1mL 上述 PDSB 中的菌液 25 180rpm 振荡培养， 取培养 96h 的发酵液测定其酶活性， 筛选出最佳氮源。 0021 （3） 在基础产酶培养基的基础上， 以筛选出的氮源为唯一氮源， 葡萄糖、 蔗糖、 麦芽 糖、 香蕉皮粉、 微晶纤维素、 甘蔗渣、 处理甘蔗。

19、渣、 玉米芯粉、 玉米粉分别为碳源接种 1mL 上 述 PDSB 中的菌液 25 180rpm 振荡培养， 取培养 96h 的发酵液， 采用 DNS 法测定其酶活性， 确定最适碳源。 0022 （4）运 用 Design-Expert 7.1.3 软 件，选 用 11 因 素、实 验 次 数 为 12 的 Plackett-Burman 设计， 考察碳源、 氮源、 发酵温度、 转速、 接种量、 种龄、 发酵时间、 初始 pH 对产酶影响的显著性， 余留 3 个空项作误差分析。每个因素取 2 个水平，“低水平” 和 “高水 平” 均依据实验情况而定。以 Xylanase 活力和 CMCase 活。

20、力为响应值， 采用 Design-Expert 7.1.3 软件建立方差分析模型， 选择 P 0.05 的因素为主效应因素。 0023 （5）根据 Box-Bohnken 设计原理， 由 Plackett-Burman 设计确定的因素， 每个因 素取 3 个水平， 以 （-1， 0， 1） 编码进行实验。以木聚糖酶 (Xylanase) 活力和内切葡聚糖酶 （CMCase） 活力为响应值， 借助 Design-Expert 7.1.3 软件对数据进行二次回归拟合， 得到 多元二次回归方程， 分析各因素的主效应和交互效应， 对实验数据分析得到多元二次回归 方程各变量的偏回归系数估计值， 从而建立。

21、二次响应面经验模型， 依据回归方程来绘制响 应面立体分析图， 得出响应面规范分析结果， 从而寻求最佳水平， 进而确定最佳产酶培养体 系。 0024 上述结果如图 1-4、 图 7-5 所示。 0025 由图1可知， 无机氮源硫酸铵和磷酸二氢铵对ycLes3菌株产重组多功能纤维素酶 的影响不明显， 而有机氮源蛋白胨、 酵母膏、 牛肉膏、 玉米粉、 麸皮、 黄豆粉的影响明显， 其中 酵母膏的作用最为显著， 因此确定酵母膏作为 ycLes3 菌株发酵产重组多功能纤维素酶的 说 明 书 CN 102093959 A CN 102093965 A4/4 页 6 最佳氮源。图 2 所示不同的碳源对 ycL。

22、es3 菌株产重组多功能纤维素酶的影响不同， 其中以 甘蔗渣的作用最为显著。因此确定甘蔗渣为 ycLes3 菌株发酵产重组多功能纤维素酶的最 佳碳源。综合图 7、 图 8 的结果显示， 甘蔗渣、 酵母膏、 转速以及发酵时间为影响 ycLes3 发 酵产重组多功能纤维素酶的主效应因素。图 10 和图 11 的结果显示， 实验所选模型高度显 著且模型拟合程度很好， 数据残差 （Residual） 均由随即误差引起， 模型选择适合。图 3- 图 6 为借助 Design Expert7.1.3 软件依据回归方程来绘制响应面立体分析图及其等高线， 考 察所拟合的响应曲面的形状响应面立体图如下图所示。 。

23、利用该组图可以对影响重组多功能 纤维素酶活力的发酵条件中任何 2 种因素交互效应进行分析和评价， 并确定最佳因素水平 范围， 等高线的形状反映交互效应的强弱大小， 椭圆形表示两因素之间的交互作用显著。 由 图可知， 因素的低水平或高水平都不利于重组多功能纤维素酶的生产， 只有当甘蔗渣、 酵母 膏、 发酵时间、 转速控制在一定范围之间时， 酶活力才最高。 0026 实施例 2 （1） 将实施例 1 制备的 ycLes3 菌株接种于 PDSA 平板上， 25培养 4d， 挑取单菌落接种 于 100mL PDSB 液体培养基中， 25， 180r/min 振荡培养 72h ； （2） 配制甘蔗渣培养。

24、基， 甘蔗渣粉 20.31g/L， 酵母膏 4.11 g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷酸 二氢钾 0.46g/L， 硫酸镁 1g/L， 调节 pH 值 5.5 ； 分装于 250mL 三角瓶中， 每瓶装液量 100mL， 高压灭菌 ； （3） 在超净工作中每瓶接种 1mL 步骤 （1） 中培养的菌种， 接种后置于 25下摇床培养， 摇床转速为 180r/min。 0027 （4） 培养 4d 后终止培养， 离心收集发酵液。 0028 其中的 PDSA 固体培养基配方为以下重量份数的物质构成 ： 马铃薯 200 份、 葡萄糖 20 份、 磷酸氢二钾 3 份、 硫酸镁 1.5 份、 葡萄糖 2。

25、0 份、 琼脂 20 份， 水补充至总重量 1000 份。 PDSA 液体培养基配方为以下重量份数的物质构成 ： 马铃薯 200 份、 葡萄糖 20 份、 磷酸氢二 钾 3 份、 硫酸镁 1.5 份、 葡萄糖 20 份， 水补充至总重量 1000 份。 0029 收集发酵液后， 采用 DNS 法测定其酶活性， 检测结果显示木聚糖酶 （Xylanase） 酶 活 1.09105 U/L， 内切葡聚糖酶 （CMCase） 酶活为 3.7104 U/L 。 说 明 书 CN 102093959 A CN 102093965 A1/9 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 10209395。

26、9 A CN 102093965 A2/9 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A3/9 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A4/9 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A5/9 页 11 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A6/9 页 12 图 8 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A7/9 页 13 图 9 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A8/9 页 14 图 10 说 明 书 附 图 CN 102093959 A CN 102093965 A9/9 页 15 图 11 说 明 书 附 图 CN 102093959 A 。