人血管内皮生长因子165b与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102121024 A (43)申请公布日 2011.07.13 CN 102121024 A *CN102121024A* (21)申请号 201010580162.9 (22)申请日 2010.12.09 C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 朱瑞宇 金坚 辛鑫 臧娴 戴慧云 张大成 雷楗勇 陈蕴 (54) 发明。

2、名称 人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白 的融合蛋白及其制备 (57) 摘要 人血管内皮生长因子 165b(hVEGF165b) 与人 血清白蛋白 (HSA) 的融合蛋白及其制备技术的发 明属于长效重组融合蛋白技术领域。本发明的 融合蛋白包括与人血管内皮生长因子 165b 至少 85序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少 85序列同源的第二区。利用限制性酶切连接的 方法将 hVEGF165b 与 HSA 拼接， 中间不加入任何 连接肽。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性 的前提下， 进行个别氨基酸残基的取代、 缺失或加 入， 它们在保留了 hVEGF165b 活性的基础上， 可望 显著。

3、延长在体内的半衰期， 是药学领域中， 能够替 代 hVEGF165b 的， 有良好前景的药用融合蛋白。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 102121030 A1/3 页 2 1.hVEGF165b 与人血清白蛋白的融合蛋白的基因序列和蛋白质序列， 如下 ： (1) 基因序列 ： GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGA TTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAG CAGTGTCC。

4、ATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATG AGTCAGCTGAAAATTGTGACAAA TCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACTGCTGTGCAAAACAAGAACCT GAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTG ATGTGATGTGCACTGCTTTTCAT GACAATGAAGAGAC。

5、ATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGG AACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGG TATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAAC TTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCG TCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAG CTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCC AAAGCTGAGTTTGCAGAAGT。

6、TTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAG ATCTGCTTGAATGTGCTGATGAC AGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAA AACCTCTGTTGGAAAAATCCCAC TGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTA AGGATGTTTGCAAAAACTATGCT GAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCAT。

7、GTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGC TGCTGCTGAGACTTGCCAAGACA TATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAAT TTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCT CAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAG TTCGTTACACCAAGAAAGTACCC CAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTC。

8、AAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATC CTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGT GCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAG TCACCAAATGCTGCACAGAATCC TTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTG AAACATTCACCTTCCATGCAGAT ATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAA。

9、ACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGC CCAAGGCAACAAAAGAGCAACTG AAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTG CCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTT GCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGA 权 利 要 求 书 CN 102121024 A CN 102121030 A2/3 页 3 AGTTCATGGATGTCTATCAGC。

10、GC AGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCA AGCCATCCTGTGTGCCCCTGATG CGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGA TTATGCGGATCAAACCTCACCAA GGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAA GACAAGAAAATCCCTGTGGGCCT TGC。

11、TCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACT CGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTT GAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATCTCTCACCAGGAAAGAC (2) 氨基酸序列 ： DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDK LCTVATLRETYGEMADCCAKQEP ERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY。

12、FYAPELLFFAKRYKAAFTECC QAADKAACLLPKLDELRDEGKAS SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSH CIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE。

13、AKRMPCAEDYLSVVL NQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLV AASQAALGLAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDE GLECVPTEESNITMQIMRIKPHQ GQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQL。

14、ELNERTCRS LTRKD 2. 人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法， 其特征是 ： hVEGF165b 与人血清白蛋白融合基因， 中间不加任何连接肽对应的核苷酸序列 ； 得到的 HSA-hVEGF165b 融合基因插入到克隆载体， 转化到宿主系统中进行表达， 融合基因被整合到 宿主的染色体中。 3. 权力要求 1 和 2 所述的人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白， 其 特征 ： 是包括与人血管内皮生长因子至少 85序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少 85序列同源的第二区 ； 所述的与人血管内皮生长因子 165b 至少 85序列同源的的第。

15、一 区位于融合蛋白的 C 末端， 与人血清白蛋白至少 85序列同源的第二区位于融合蛋白的 N 末端， 中间不加任何连接肽 ； 或所述的与人血管内皮生长因子 165b 至少 85序列同源的第 一区位于融合蛋白的 N 末端， 与人血清白蛋白至少 85序列同源的第二区位于融合蛋白的 C 末端， 中间不加任何连接肽。 4.权力要求1、 2和3所述的人血管内皮生长因子165b与人血清白蛋白的融合蛋白， 其 权 利 要 求 书 CN 102121024 A CN 102121030 A3/3 页 4 特征是 ： 所述的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子 165b 至少 95序列同源的第一区和 与人血清白蛋白。

16、至少 95序列同源的第二区。 5.权力要求1、 2和3所述的人血管内皮生长因子165b与人血清白蛋白的融合蛋白， 其 特征是 ： 所述的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子 165b 氨基酸残基序列相同的第一区 和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区， 或上述两区的功能等同物。 6. 权力要求 5 所述的人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白， 其特征 是 ： 所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下， 对融合蛋白的个别氨基 酸的残基的取代、 缺失或加入得到的多肽。 7.权力要求1、 2和3所述的人血管内皮生长因子165b与人血清白蛋白的融合蛋白， 其 特征是 ： 。

17、提供携带编码融合蛋白的基因序列的重组表达载体， pPIC9K-HSA-hVEGF165b。 8.权力要求1、 2和3所述的人血管内皮生长因子165b与人血清白蛋白的融合蛋白， 其 特征是表达融合蛋白的宿主优选是酵母， 酵母中优选毕赤酵母， 毕赤酵母中优选是 GS115， X-33。 9. 权力要求 1、 2 和 3 所述的人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白在 替代 hVEGF165b 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102121024 A CN 102121030 A1/4 页 5 人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白及 其制备 技术领域 0001 。

18、人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融 合蛋白药物技术领域 ： 涉及 DNA 重组技术， 药物蛋白与 HSA 的融合使得药物成为长效药物。 背景技术 0002 血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor， VEGF)是血管内皮细 胞的特异丝裂原， 1989 年由 Ferrara 等在牛垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化 出来的， 具有细胞质的钙聚集作用， 促进血管内皮细胞增殖， 诱导血管生成， 增加血管通透 性， 血管保护等生物学作用。 0003 人的 VEGF 基因位于染色体的 6p21.3， 编码 VE。

19、GF 的基因长 14kb， 由 8 个外显子和 7 个内含子交替组成， 分子量 35 45kD。VEGF 根据 VEGFmRNA 剪接方式不同分为多个变构 体， 有 VEGF121、 VEGF145、 VEGF165、 VEGF183、 VEGF189 和 VEGF206。VEGF165 以同源二聚体的 形式存在， 糖基化的 VEGF165 二聚体相对分子质量约为 45000， 非糖基化的相对分子质量约 为43000。 血管内皮生长因子165(VEGF165)是目前发现的最重要的肿瘤血管形成促进剂之 一， 具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能， 在肿瘤的发展和转移中起着重要作用。 0004。

20、 近来又发现一种内源性剪接变构体， 即 VEGF165b. 其与 VEGF165 区别仅在于编码 的末端六个氨基酸的差异。 多存在于正常细胞、 组织及血液循环中， 尤其在具有高水压传导 性的组织如脉络丛以及肾小囊足细胞中(目前所检测的有前列腺癌及肾细胞癌)表达水平 却很低， VEGF165b 能抑制 VEGF165 介导的内皮细胞增殖和在血管中迁移和血管舒张前的迁 移， 从而抑制肿瘤的生长， 将有很大的临床应用价值。 0005 在肿瘤的治疗上， 已有很多抗血管生成的药物问世， 包括反义寡核苷酸， 可溶 性 VEGF 受体类似物， 小分子 VEGF 受体酪氨酸激酶抑制剂如 SU5416、 SU1。

21、1248、 PTK787/ ZK222584 等， 但效果不是十分有效， 并且其单克隆抗体常有免疫原性， 而那些人工合成的小 分子物质常存在不可预知的副作用， 因此， VEGF165b 作为内源性抑制剂剪接变构体在临床 应用上显示出美好前景。 0006 由于 hVEGF165b 分子量非常小， 体内代谢速度相当快， 因此为了达到治疗效果， 需 要频繁大剂量用药。昂贵的价格和频频用药造成的不便将严重限制了此种药物的应用。 0007 人血清白蛋白 (Human serum albumin， HSA) 是血浆中的主要蛋白成分， 它除了具 有维持血浆渗透压功能以外， 还能担当许多内源因子和外源药物的载。

22、体， 从而调节激素活 性， 所载物质的毒性， 以及药物的利用度。成熟的 HSA 有 585 个氨基酸残基组成， 含有 17 对 二硫键， 分子量约为 66.5KDa， 如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量， 再正常 情况下， 不易被肾小球虑过， 血浆半衰期在 20 天左右。同时， HSA 在人体内没有酶学和免疫 学活性， 是一种理想的生物活性蛋白载体。 说 明 书 CN 102121024 A CN 102121030 A2/4 页 6 发明内容 0008 本发明的一个内容是提供hVEGF165b与HSA生理特性于一体的人血管内皮生长因 子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白， 该融合。

23、蛋白在保持了人血管内皮生长因子 165b 生理 特性的基础上， 增加了作用位点， 延长了体内半衰期， 改善了溶解度， 具有优良的药学特性。 0009 该融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。 0010 本发明的技术方案 ： 在前期的研究中本实验室保藏了重组质粒 PIC9K-hVEGF165 以及pBluescript-HSA质粒。 pBluescript-HSA质粒上只有一个Bsu3611酶切位点在HSA末 端， 设计含有 HSA Bsu361I 酶切位点及下游表达区序列的 hVEGF165b 上游引物和含有 NotI 酶切位点以及 hVEGF165b 与 hVEGF165 不同的 6 个末。

24、端氨基酸对应的碱基的下游引物， 扩增 得到 hVEGF165b 基因， 然后通过限制性双酶切置入 HSA 下游， 获得 HSA-hVEGF165b 融合基 因， 中间不含任何连接肽序列。将该融合基因插入到克隆载体， 转化到宿主系统， 融合基因 就会整合到宿主的染色体中进行表达。 0011 如此一来， 我们制备的人血管内皮生长因子 165b 与人血清白蛋白的融合蛋白， 包 括与人血管内皮生长因子 165b 至少 85序列同源的二联体的第一区和与人血清白蛋白至 少 85序列同源的第二区 ； 所述的与人血管内皮生长因子 165b 至少 85序列同源的二联 体的第一区位于融合蛋白的 C 末端， 与人血。

25、清白蛋白至少 85序列同源的第二区位于融合 蛋白的 N 末端， 中间不加任何连接肽 ； 或所述的与人血管内皮生长因子 165b 至少 85序列 同源的二联体的第一区位于融合蛋白的 N 末端， 与人血清白蛋白至少 85序列同源的第二 区位于融合蛋白的 C 末端， 中间不加任何连接肽。优选的是所述的融合蛋白包括与人血清 白蛋白至少95序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子165b至少95序列同源的第 二区。 所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人血管内皮 生长因子 165b 氨基酸残基序列相同的第二区， 或上述两区的功能等同物。所述的功能等同 物是在不改变所述的融合蛋白特。

26、性的前提下， 对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、 缺 失或加入得到的多肽。 0012 本发明 hVEGF165b 和 HSA 之间不加任何连接肽， 可以避免因连接肽的加入而带来 的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。 0013 本发明的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编 码区的重组表达载体。 0014 表达融合蛋白的宿主可以是细菌、 酵母、 动物细胞或植物细胞。 表达出来的融合蛋 白可以存在于宿主细胞内， 也可以从宿主细胞中分泌出来 ； 分泌所用的信号肽可以是天然 的人血清白蛋白的信号肽， 也可以是酿酒酵母阿尔法交配因子的信号肽， 或者这两种信号 肽的类似物 ； 目。

27、的基因可以被整合到宿主的染色体中， 也可以插入到质粒中。 本发明优选的 宿主系统是酵母表达系统， 优选的酵母表达系统是毕赤酵母表达系统， 优选的毕赤酵母表 达系统是 GS115 和 X33。这种表达系统除了具备原核表达系统的易操作、 生长迅速、 营养要 求简单、 易工业放大的特点外， 还具有真核细胞的蛋白后修饰系统， 有利于大量生产高质量 的重组蛋白。 0015 与宿主对应的表达载体大多可以购买商品化的， 如毕赤酵母表达系统对应的载 体， 分泌型的有 pPIC9K、 pHIL-S1、 pPICZ、 pYAM75P6， 胞内型有 pPIC3K、 pPICZ、 pHWO10、 pGAPZ、 pGA。

28、PZ 等。优选的是毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9K， 它是酵母整合载体， 带有组 说 明 书 CN 102121024 A CN 102121030 A3/4 页 7 氨酸缺陷型的选择性标记基因 HIS4、 AOX1 启动子、 MF 分泌信号肽和 G418 抗性基因等元 件。AOX1( 醇氧化酶操纵子 )5 序列、 3 序列用于方便编码基因整合至酵母基因组和控制 编码基因的表达。 0016 转化带有融合 cDNA 的表达载体到宿主细胞中， 可以用锂盐法、 PEG 法、 原生质体 法、 电穿孔法或化学转化等方法。转化之后， 可以用多种方法鉴定是否成功， 如提取基因组 DNA 进行 PCR 鉴。

29、定， 或者对细胞培养上清中的蛋白进行 HSA 抗体和 hVEGF165b 多抗检测。 0017 生产本发明的融合蛋白可以通过培养带有本发明构件的 DNA 的宿主系统来进行， 具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器。培养分为两个阶段 ： 宿主系统生长阶段和融合 蛋白合成阶段。之后可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明 DNA 构建体的细胞培养物中 分离纯化融合蛋白， 包括盐析、 沉淀、 超滤、 层析、 制备电泳等技术及这些技术的组合。 附图说明 0018 图 1 ： 重组质粒 pPIC9K-HSA-hVEGF165b 物理图谱 0019 图 2 ： 重组质粒 pPIC9K-HSA-VEGF165b 。

30、的酶切鉴定 0020 1 ： DNA Ladder Marker D ； 2 ： pPIC9K-HSA-hVEGF165b 经 EcoRI/NotI 双酶切 ； 3 ： 未 经酶切的 pPIC9K-HSA-hVEGF165b 质粒 0021 图 3 ： 融合蛋白的 SDS-PAGE 分析 0022 M ： 为低分子量蛋白质标准 ； 1 ： pPIC9K 空质粒重组菌表达结果 ； 2-9 为 GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165b 的发酵液上消 0023 图 4 ： 超滤前后样品的 SDS-PAGE 分析 0024 M ： 为低分子量蛋白质标准 ； 1 ： 超滤前 ； 2 ： 超。

31、滤后 0025 图 5 ： Blue-Sepharose 层析纯化过程的 SDS-PAGE 分析 0026 M ： 低分子量蛋白质标准 ； 1 ： 上样流穿液 ； 2 ： 2M高盐洗脱收集液 ； 3-5 ： 1M精氨酸洗 脱收集液 0027 具体实施方法 0028 一、 实验材料 ： 0029 JM109 空 菌、 DH5/pPIC9K、 毕 赤 酵 母 GS115(his4Mut+)、 PIC9K-hVEGF165b 以 及 pBluescript-HSA 质粒为本实验室保藏 ； 质粒抽提试剂盒、 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自 上海生工生物工程技术服务有限公司 ； pyrobest DNA 聚合。

32、酶、 限制性内切酶、 DNA Ladder Marker 等购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ； 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限 公司代为合成 ； 所有测序服务由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 0030 二、 实验方法 ： 0031 实施例 1 ： pPIC9K-HSA-VEGF165b 毕赤酵母表达质粒的构建。 0032 以 PIC9K-hVEGF165b 为模板， 通过 PCR 扩增出 hVEGF165b 基因， 引物如下 ： 0033 上游引物 ： 5 -GCCCTTAGGCTTAGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3 0034 ( 划线为 Bsu361I 酶。

33、切位点 ) 0035 下游引物 ： 5-GTAGCGGCCGCTTAGTCTTTCCTGGTGAGAGATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTC AAG-3 0036 ( 划线为 NotI 酶切位点 ) 说 明 书 CN 102121024 A CN 102121030 A4/4 页 8 0037 用 2.0的琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果， 同收 500bp 左右的片断， 用 Bsu361I、 NotI 对同收片断和 pBluescript-HSA 质粒进行双酶切， 连接再转化到新鲜制作的 JM109 感 受态细胞。挑选阳性转化子进行酶切验证。阳性重组子提取质粒再通过 EcoRI/Not。

34、I 双酶 切获得片断插入到pPIC9K对应的酶切位点， 获得正确的pPIC9K-HSA-VEGF165b毕赤酵母表 达质粒 ( 图 1)， 并通过 EcoRI/NotI 双酶切 ( 图 2) 及测序进行验证。 0038 实施例 2 ： 重组酵母表达系统构建及融合蛋白的表达 ； 0039 活化并过夜培养 JM109/pPIC9K-HSA-hVEGF165b， 提取的质粒， 经 SalI 线性化， 电 击转化毕赤酵母 GS115， 转化物涂布与含 0.25mg/ml G418 的 MD 平板上， 30培养 72 小 时， 挑取所有的长出的菌落到含 0.5mg/ml G418 的 YPD 平板上， 。

35、30培养 2-3 天。挑取 长势好的菌落到 20ml 液体 YPD 培养基中， 30过夜培养， 提取 GS115 全基因组 DNA， PCR 鉴定出阳性重组子， 并把它保存在含 20甘油的 YPD 中， 冻存于 -80， 命名为 GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165b。 0040 将 GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165b 接种到装有 30ml BMGY(100mM 磷酸钾， PH 6.0 ； 1.34 YNB ； 410-5生物素 ； 3甘油 ) 的 250ml 三角瓶中， 215rpm， 30培养 24-36 小时， 冷冻沉降菌体， 弃去上清， 加入 25ml。

36、 BMMY(100mM 磷酸钾， PH 6.0 ； 1.34 YNB ； 410-5生 物素 ； 2.5甲醇 )。每 24 小时补加一次甲醇， 诱导 3 天。SDS-PAGE 检测重组融合蛋白的表 达情况 ： 采用5浓缩胶及12分离胶的不连续垂直平板电泳， 考马斯亮监R-250染色(图 3)。挑选表达量较高的菌株扩大培养， 收集离心得上清， 上清液经 10kDa 分子截留量的膜超 滤浓缩 ( 图 4)， 再经 Blue-Sepharose 层析分离， 1M 精氨酸洗脱获得较纯的 HSA-hVEGF165b 融合蛋白 ( 图 5)。 说 明 书 CN 102121024 A CN 102121030 A1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102121024 A CN 102121030 A2/2 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102121024 A 。