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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410786868.9 (22)申请日 2014.12.18 C12N 5/09(2010.01) (71)申请人 宁波美丽人生医药生物科技发展有 限公司 地址 315899 浙江省宁波市保税西区创业大 道 7 号 4 幢 305、 312 室 (72)发明人 田晓丽 (54) 发明名称 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68（MHV68） 耐 受模型中的用途 (57) 摘要 本发明涉及生物医药领域， 特别是涉及 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68（MHV68） 耐受模型中 的用途。本发明提供了 RXR 在构建鼠的 - 疱疹 病。
2、毒 68 耐受模型中的用途以及 RXR 缺乏 F9 所引 起的鼠的-疱疹病毒68耐受细胞模型的构建方 法， 并发现COX感受通路以RXR依赖的方式在对于 鼠的-疱疹病毒68的宿主防御中起着关键性的 作用， 进一步揭示了RXR在构建鼠的-疱疹病毒 68（MHV68） 耐受模型中的用途。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图7页 CN 105754947 A 2016.07.13 CN 105754947 A 1/1 页 2 1.RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68（MHV68） 耐受模型中的用途。 2.如权利要求。
3、 1 所述 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68 （MHV68） 耐受模型中的用途， 其 特征在于， 所述用途为鼠的 - 疱疹病毒耐受细胞模型构建中的用途。 3.如权利要求 2 所述 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68 （MHV68） 耐受模型中的用途， 其 特征在于， 所述耐受细胞模型为胚胎癌细胞模型。 4.如权利要求 3 所述 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68 （MHV68） 耐受模型中的用途， 其 特征在于， 所述细胞模型为癌细胞模型。 5.RXR 的过度表达所引起的鼠的 - 疱疹病毒 68 胚胎癌细胞模型的构建方法， 所述 方法具体为 ： 对野生型 RXR 和缺乏 F9 胚。
4、胎癌细胞预处理， 给予注射鼠的 - 疱疹病毒 68 （*PFU/L） ， 再通过蛋白免疫印迹 （Western Blot） 实验观察各组 RXR 蛋白的表达情况。 权 利 要 求 书 CN 105754947 A 2 1/10 页 3 RXR在构建鼠的 -疱疹病毒 68(MHV68)耐受模型中的用 途 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 特别是涉及 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68(MHV68) 耐受模型中的用途。 背景技术 0002 在病毒感染期间免疫激活导致视黄醇X受体下调， 后简称(RXR)， RXR属于核受体， 在细胞以及整个机体代谢中都是必不可少的。然而， RXR 在。
5、抵御病毒感染的宿主防御中的 作用仍然是未知的。核受体 (NRs) 代表一个大家族的转录因子参与的广谱生物学时间， 例 如发育、 生殖以及代谢。(Robinson-Rechavi 等 2003) 许多 NR 的超家族成员已经成为炎症 和免疫反应的关键调节因子(Daynes 和Jones， 2002 ； Joseph等2003 ； Ogawa等2005)， 它们 使巨噬细胞和树突状细胞感受其脂质环境并塑造其免疫反应。(Nagy 等 2012)RXR 占据在 核受体的中心位置， 因为他们可以与其他家族成员一起形成异二聚体， 因此参与多种生理 过程包括细胞分化， 免疫反应以及脂质代谢和糖代谢 (kef。
6、ebvre 等 2010 ； Roszer 等 2013)。 RXR 也能够形成同二聚体激活其靶基因 (A 等人 2004 ； Zhang 等 1992) 最近研究进展表明， RXR 是巨噬细胞的关键调节因子， 在免疫和代谢性紊乱中起到关键作用。RXR 有三种同型异 构体， RXR(NR2B1)RXR (NR2B2),RXR (NR2B3)。每个同型异构体存在于特定的几个亚型中， 在发育过程中具有特异的组织分布和表达模式。 (Roszer等2013)以往的研究表明， 在骨髓 细胞中最丰富的受体， 或者说至少是功能最重要的受体是 RXR(Mangelsdorf 等 1992)。维 生素 A 衍生。
7、物 9 顺维甲酸 (9cRA) 是第一个发现的 RXR 的天然配体 (Perez 等 2012) 内源性 脂肪酸如二十二碳六烯酸 (DHA)、 油酸和植烷酸也是 RXR 的配体 (Dawson 和 Xia,2012)， 许 多 RXR 特异性合成配体例如 LG100268(LG268)， AGN194204 和贝沙罗汀也被称为视黄醇， 被 用于研究和临床应用 (Perez 等 2012)。 0003 巨噬细胞在固有免疫中起到关键作用， 不仅仅在宿主防御病原体， 细胞碎片清除， 组织损伤后重塑， 组织脂质代谢的整合器作用， 但也可以产生一些列分泌产物， 这些分泌产 物可以影响其他免疫细胞的活性以。
8、及其迁移 (Glass 和 Olefsky2012 ； Nagy 等 2012)。在 组织中巨噬细胞的长期活化状态以及其病原体的保留可以创造一种炎症微环境， 这反过来 又有助于动脉粥样硬化、 胰岛素抵抗和神经退行性疾病 (Glass 和 Olefsky2012 ； Roszer 等 2013)。因此， 在巨噬细胞的免疫和代谢过程的精密调节是非常重要的。在巨噬细胞中， 诸如 Toll 样受体的模式识别受体活化可以激发快速的炎症或通过产生前炎性因子 型 干扰素来激发抗病毒反应。(Newton 和 Dixit2012;Takeuchi 和 Akira,2010) 多个核受体 家族成员已被证实可以抑制。
9、 TLR 诱导的体内和体外的炎症反应， 其中包括维生素 D 受体 VDRs， 过氧化物酶增值激活受体 PPARs， 肝脏 X 受体 LXRs 和糖皮质激素受体 (Castrillo 和 Tontonoz2004;Nagpal 等 2001 ； Nagy 等 2012;Ogawa 等 2005)， 同时， 由病原体激活的 TLRs 也可以调节巨噬细胞核受体靶基因。例如 TLR3/4 配体可以强烈抑制包括 ABCA1 和 ABCG1 的 LXR 靶基因从而阻断来着巨噬细胞胆固醇外流。(Castrillo 等 2003). 越来越多的证 说 明 书 CN 105754947 A 3 2/10 页 4。
10、 据表明， 核受体与过氧化物酶增值激活受体之间的相互作用可以调节炎症反应和细胞代谢 (Castrillo 等 2003 ； Nagy 等 2012 ； Roszer 等 2013)。然而， 核受体与宿主抗病毒反应之 间的相互作用还需要进一步的研究。 0004 细胞抗病毒反应的活化涉及许多信号转导途径可以产生 型干扰素。简单的说， 病毒核酸激活 TLR3、 TLR7/8、 TLR9 或细胞内受体如维甲酸诱导基因 样受体家族、 黑色素 瘤分化相关抗原 5， 可以激活通路导致人 TANK 结合激酶 1 的激活， 磷酸化， 人干扰素调节因 子 3 的迁移进入细胞核以及干扰素的转录等一系列变化。(New。
11、ton 和 Dixit2012 ； Takeuchi 和 Akira， 2009,2010). 干扰素诱导多种抗病毒基因表达。许多基因比如说干扰素刺激基因 15、 干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白 1 寡腺苷酸合成酶 2 可以直接抑制病毒的生长周期过程 (Sadler 和 Williams2008)。其他诸如人干扰素调节因子 1、 人干扰素调节因子 7、 以及病毒 核酸感受器 (RIG- 和 MDA5) 进一步健全了干扰素反应。(Takeuchi 和 Akira， 2009)。我 们以前研究发现， RXR 在病毒干扰过程中通过干扰素调节因子 3 依赖性但干扰素非依赖性 通路表达下调。(Chow 等 。
12、2006) 进一步的证据表明 ： 病毒感染的小鼠在诸如阿司匹林的药 物刺激下对肝毒性更加敏感， 会产生一种类似于人类雷氏综合症的症状， 这可能是因为药 物代谢导致RXR下游的酶表达抑制的原因。 (Chow等2006)尽管有这些有趣的研究现象， 为 什么在固有免疫反应病毒感染中 RXR 的表达下降， 还有 RXR 的下调是否会影响病毒感染过 程中的宿主防御， 这些都尚不清楚。 0005 环氧合酶1和环氧合酶2(COX1和COX2)是前列腺素生物合成的关键酶。 COX1在许 多组织中持续表达， COX2 是可诱导的酶， 二者均可以促使前列腺素 E2 产生 (Vane 等 1998)。 PGE2 的。
13、产生增加会导致大多数检测病毒的复制增加 ( 巨细胞病毒、 水泡型口炎病毒、 牛白 细胞增多病毒、 单纯疱疹病毒-1、 人类疱疹病毒-6、 伪狂犬病毒、 小鼠肝炎病毒-68)(Ray等 2004 ； Steer 和 Corbett,2003;Symensma 等 2003)。最近的研究表明前列腺素 E2 通过激活 前列腺素 E2 受体 EP2 和 EP4 受体来激活 PI3K - Akt- GSK3 通路从而抑制干扰素 和干 扰素 。(Fabricius 等 2010 ； Xu 等 2008)。尽管前列腺素 E2 的产生增加主要是由于病毒 感染过程中环氧合酶 2 的产生增加 (Steer 和 C。
14、orbett2003)。药理学以及遗传相关证据也 表明， 由环氧合酶 1 调节产生的前列腺素 E2 在调节 型干扰素产生和宿主抗病毒反应中 起到关键作用。(Carey 等 2005 ； Chen 等 2012 ； Ray 等 2004)。 ； 比如环氧合酶 1 特异性抑制 剂增加伪狂犬病毒 PFV 的复制 (Ray 等 2004) 给予环氧合酶 1 敲除但未给予环氧合酶 2 敲 除的小鼠更能抵抗流感病毒的侵袭 (Carey 等 2005) 环氧合酶 1 启动子通过高度乙酰化在 组蛋白去乙酰化缺陷的巨噬细胞中产生干扰素抑制 (Chen 等 2012) 尽管多个研究表明， 环 氧合酶 1 调节 型。
15、干扰素的抑制， 但是通过宿主抗病毒反应调节环氧合酶 1 的研究仍然极 少。 发明内容 0006 鼠 疱疹病毒 68 是双链 DNA 病毒， 感染机体后能入侵多种细胞， 包括巨噬细 胞、 淋巴细胞、 呈纤维细胞等， 在宿主细胞中长期潜伏感染。视黄醇 X 受体 (Retinoid X receptor)， 后简称 (RXR)， RXR 属于核受体 (nuclear receptors)， 在细胞以及整个机体代 谢中都是必不可少的。然而， RXR 在抵御病毒感染的宿主防御中的作用仍然是未知的。 0007 鉴于以上所述现有技术， 本发明提供 RXR 在构建鼠的 - 疱疹病毒 68(mouse 说 明 。
16、书 CN 105754947 A 4 3/10 页 5 gamma-herpessvirus 68)( 登录号 ) 耐受模型中的用途。 0008 优选的， 所述用途为鼠 疱疹病毒 68 耐受细胞模型构建中的用途， 具体为 RXR 缺 乏 F9 所引起的鼠 疱疹病毒 68 毒耐受。 0009 更优选的， 所述耐受细胞模型为胚胎癌细胞模型。 0010 进一步优选的， 所述细胞模型为癌细胞模型。 0011 由于 RXR 缺乏 F9 对于鼠 疱疹病毒 68 耐受， 且 RXR 表达水平可能调控鼠 疱 疹病毒 68 感染的宿主耐受性， 并抵制细菌感染， 所以 RXR 缺乏 F9 可用于构建鼠 疱疹病 毒。
17、 68 耐受胚胎癌细胞模型， 在构建鼠 疱疹病毒 68(MHV68) 耐受模型中具有实际应用价 值。 0012 本发明进一步提供 RXR 缺乏 F9 所引起的鼠 疱疹病毒 68 耐受胚胎癌细胞模型 的构建方法， 所述方法具体为 ： 对野生型 RXR 和缺乏 F9 胚胎癌细胞预处理， 给予注射鼠 疱疹病毒68(*PFU/L)， 通过蛋白免疫印迹(Western Blot)实验观察各组RXR蛋白的表达 情况。 0013 所述注射鼠 疱疹病毒 68 的具体方法为 ： 给予骨髓源性巨噬细胞 1ug/ml poly ： C 病毒转染， 或给予骨髓源性巨噬细胞感染 poly dA:dT4 小时 ， QRT。
18、-PCR 检测 RXR mRNA 表达。 0014 本发明证实了 RXR 表达水平可调控鼠 疱疹病毒 68 感染的宿主耐受性并进一步 阐述了相关免疫机理。 0015 本发明发明人发现 RXR 介导的固有免疫响应在鼠 疱疹病毒 68 感染过程中的的 宿主防御中不可或缺 ； 并率先证明了在鼠 疱疹病毒 68 感染的宿主防御中， RXR-Cox-1 依 赖性途径有着关键性的作用。 0016 本发明发明人对野生型RXR和缺乏F9胚胎癌细胞给予注射鼠疱疹病毒68并观 察相关感染结果后发现， 通过噬菌斑测定 RXR 缺乏感染后细胞明显比野生型细胞对 MHV68 更具有抵抗性。野生型胚胎细胞对于 MHV68。
19、 显著易感， 其在感染 *h 时上清液中病毒滴度明 显上升， 且相对于RXR缺乏F9胚胎癌细胞， 野生型RXR胚胎癌细胞的存活率明显下降。 巧合 的是， 环氧和酶 1(COX1) 在催化花生四烯酸转化为多个前列腺素上与环氧和酶 2(COX2) 表 现出类似的功能。另外， 当发明人将 RAW264.7 细胞植入 6 孔板中铺成 6*105， 给予 DMSO 或 RXR 激动剂或 RXR 拮抗剂处理 16-24 小时。病毒传播同之前描述的一致 (Doyle 等 2002)。 在培养基中细胞感染MHV68(感染复数=0.01)1小时后， 重新更换含有百分之一胎牛血清的 DMEM。在第 12 小时 -。
20、16 小时质检收集其上清液、 MHV68-luc 感染由荧光素酶检测试剂盒进 行定量检测 (Promega)。感染方式同前描述一致， 并由荧光素酶检测试剂盒进行定量检测 (Promega)。 0017 综上所述， 本发明发明人证实了 RXR-Cox-1 依赖性途径在对于 MHV68 的宿主防御 中起着关键性的作用， 进一步证实了 RXR 在构建鼠 - 疱疹病毒 68(MHV68) 耐受模型中具 有实际应用价值。 0018 附图说明 ： 图 1 显示为 RXR 表达调控宿主细胞对 MHV68 感染的耐受性 ： (A) 巨噬细胞给予 MHV68 或 HSV-1( 感染 8 小时 )、 VSV( 感。
21、染 4 小时 )， QRT-PCR 检测 RXR mRNA 表达 ( 感染复数 =1) ； (B)巨噬细胞给予poly ： C(1g/ml)病毒转染， 或给予poly dA:dT感染， 4小时后 QRT-PCR 说 明 书 CN 105754947 A 5 4/10 页 6 检测 RXR mRNA 表达 ； (C) 野生型 RAW 细胞 ( 模拟 ) 以及 RAW264.7 细胞使其转染 pBABE 空 载体 ( 空 ) 和转染 pBABE 人 RXR 载体 (hRXR)， 其产物的 RXR 蛋白表达 ； (D) 通过逆 转录感染， RXR null 与 hRXR 或与 pBABE 空载体重组。
22、。三个独立的 RXR 过度表达群体 的建立 ； (E)RXR WT 和 RXR 缺乏 F9 的胚胎癌细胞系 (RXR null) 中 RXR 蛋白的表达。 hRXR1(pop1)、 hRXR 2(pop2)、 hRXR3(pop3)， 在这些细胞系以及野生型细胞中 RXR 表 达由免疫印迹实验证实， 非特异性条带 (NS) 作为对照组。 0019 (A)(B)(C) 的数据表现为均数 标准差 (n=3)， 上图作为其代表性实验。在三个 独立的实验中得到相似的结果 ： *P 0.05 且 * P 0.01(t 检验 )， (C)(D)(E) 的数据证 实三个独立实验的代表。 0020 图 2 显。
23、示为配体激活 RXR 提高宿主细胞对 DNA 病毒感染的易感性 ： (A)RAW264.7 RXR 给予 DMSO、 AGB19420(100nM)16 小时预处理后， 细胞感染 MHV68 表达荧光素酶 ( 感染复 数=0.5)细胞在裂解液中裂解24小时后， 根据发光分析实验对荧光素酶活力进行检测 ； (B) RAW264.7 细胞持续表达 pBABE 载体或表达 hRXR， 给予 DMSO、 9cRA、 HX531， 16 小时预处理 后， 细胞感染 MHV68 表达荧光素酶 ( 感染复数 =0.5) 细胞在裂解液中裂解 24 小时后， 根据 发光分析实验对荧光素酶活力进行检测 ； 数据代。
24、表了 2 个独立的实验。*P 0.05(t 检验 )(A)(B) 数据表现为均数 标准差 (n=3)， 上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果 ： *P 0.05 且 * P 0.01(t 检验 )。 0021 图 3 显示为配体激活 RXR 抑制多个抗病毒基因 ： (A)RAW264.7 细胞给予 9cRA 或 给予 DMSO， 两组组均预处理 16 小时后转染 poly ： C(1g/ml) 2 小时， 提取其 RNA， 制作 Affimetrix430.2 芯片检测基因表达 ； (B)RAW264.7 细胞给予 9cRA 或给予 DMSO 或给予 HX531， 三组均预处。
25、理 16 小时后转染 poly ： C(1g/ml)， 转染后 2 小时， 提取其 RNA， 并通过 半定量 PCR 检测干扰素和 Isg15mRNA 的表达 ； (C) 抗病毒激活干扰素诱导因子的表达， 通过 半定量 PCR 检测 (B) 中样本的 Gbp1、 Isg20、 Oas2 和 Irf7 的 mRNA 表达 ； (D) 干扰素 敲 除的骨髓源性巨噬细胞给予 9cRA 或给予 DMSO 或给予 HX531， 三组均预处理 16 小时后转染 1ug/ml poly ： C， 并通过半定量 PCR 检测干扰素和 Isg15mRNA 的表达。 0022 (B)(C)(D) 数据表现为均数 。
26、标准差 (n 3)， 上图作为其代表性实验。在三个 独立的实验中得到相似的结果 ： *P 0.05 且 *P 0.01(t 检验 ) 0023 图 7 显示为 RXR 配体的活化抑制 1 型干扰素的表达。J2 骨髓源性巨噬细胞经过 DMSO、 9cRA(100nM)或HX531(1M)预处理16小时， 紧接着转染1g/ml poly ： C 4小时， 4 小时后 QRT-PCR 检测 IfnmRNA(A) 和 Ifn4mRNA(B) 表达 ； 0024 图 4 显示为 RXR 过度表达通过下游 RIG-1 和 TLR3 信号通路抑制干扰素转录 ： (A) RAW264.7细胞转染干扰素启动子荧。
27、光素酶受体(IFNb-luc)给予DMSO或给予9顺式维甲酸 预处理 9 小时后， 对其进行 poly ： C 刺激。(5g/ml)poly ： C 刺激 20 小时后收集其产物， 根据发光分析实验对荧光素酶活力进行检测 ； (B-F) 干扰素 荧光素酶受体共转染标记载 体或人 RXR， 表明 RIG-1 以及 TLR3 信号通路作用元件转染 293 细胞 24 小时后， 可以检测出 裂解产物中荧光素酶活性 ； 图 5 显示为配体激活 RXR 诱导环氧合酶 1 产生但抑制环氧合酶 2 的产生 ： (A&B) RAW264.7 细胞或 J2 骨髓源性巨噬细胞在特定的时间点给予 DMSO 或 9c。
28、RA 预处理后， 转 说 明 书 CN 105754947 A 6 5/10 页 7 染 1g/ml poly ： C, 两小时后提取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测干扰素 mRNA 表达 ； (C) RAW264.7 细胞给予 DMSO 或 9cRA 预处理 16 小时后提取其 RNA， 制作 Affimetrix430.2 基 因芯片来检测基因表达 ； (D-E)J2 骨髓源性巨噬细胞在特定的时间点给予 DMSO 或 9cRA 预 处理后提取其 RNA， 并通过半定量 PCR 检测环氧合酶 1、 环氧合酶 2mRNA 表达 ； (F)J2 骨髓源 性巨噬细胞经过与(D-E)一致预处理。
29、后， 通过免疫印迹实验检测环氧合酶1蛋白表达水平， GAPDH 作为对照组。 数据代表了 3 个独立的实验。p0.05(t 检验 )， 在三个独立的实验中得到相似的结果 ： p0.05 并且 P0.01(t 检验 ) 图 8 显示为短时间预处理受体激动剂并没有改变 I 型干扰素及其下游基因的表达。 图 9 显示为 RXR 和 RAR 激动剂诱导环氧合酶 1 的表达。 0025 图 6 显示为环氧合酶 1 调节 RXR 对干扰素产生的抑制作用 ： (A) 环氧合酶 1 和环 氧合酶 2 的标准化探针强度基因数据如图 4A 所示。根据 430.2 基因芯片的设计， 标准化探 针强度与基因的绝对复制。
30、呈正相关。基因表达数据表现为均数 标准差 (* P 0.01， t 检验) ； (B)J2骨髓源性巨噬细胞给予DMSO或9cRA预处理或者在9cRA中加入环氧合酶1/2 泛抑制剂吲哚美辛 / 双氯芬酸 (10nM) 处理 24 小时后转染 1ug/mlpoly ： C2 小时或 4 小时 后提取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测干扰素 1 和干扰素 4mRNA 表达 ； (C)J2 骨髓源性巨噬 细胞转染对照组干扰RNA、 干扰环氧合酶1、 干扰环氧合酶2、 干扰环氧合酶1&2， 24小时后给 予 DMSO 或 9 顺式维甲酸预处理 16 小时， 转染 1ug/mlpoly ： C2 小时。
31、后提取其 RNA 并通过 半定量 PCR 检测干扰素 4mRNA 表达 ； (D)J2 骨髓源性巨噬细胞给予 DMSO 或 9 顺式维甲酸或 者在 9 顺式维甲酸中加入环氧合酶 1 特异性抑制剂 SC560(10nM) 或加入环氧合酶 2 特异性 抑制剂 NS398(10nM) 预处理 24 小时后， 转染 1ug/mlpoly ： C2 小时或 4 小时后提取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测干扰素 4mRNA 表达 ； (E) 来自于野生型的原代骨髓源性巨噬细胞或 环氧合酶 1 敲除的小鼠给予 DMSO、 9 顺式维甲酸、 HX531 预处理 72 小时后 ( 每 24 小时更换 培养。
32、基并增加配方 ) 转染 1ug/mlpoly ： C4 小时后提取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测干扰 素 1 和干扰素 4mRNA 表达 ； (F) 病毒感染通过病原体识别受体下游信号来激活干扰素调节 因子 3， 然后引起多个抗病毒基因的转录。同时干扰素调节因子 3 的激活抑制核受体 RXR， 通过诱导环氧合酶 1 抑制抗病毒基因的表达。 0026 (B-F) 数据表现为均数 标准差 (n 3)， 上图作为其代表性实验。在三个独立 的实验中得到相似的结果 ： *P 0.05 且 *P 0.01(t 检验 )。 0027 图 10 显示为在 9 顺式维甲酸预处理组以及 Poly ： C 。
33、激活巨噬细胞组， 环氧合酶 1 在前列腺素 (PGE2) 生物合成中起主要作用 ： (A) 将 Cox1 或 Cox2 进行梯度稀释， 以其作 为模板， 分别进行 qPCR。结果显示 Cox1 及 Cox2 标准曲线中扩增循环值 (Ct 值 ) 及拷贝数 可得出该 细胞模型中环氧合酶 1 及环氧合酶 2 的绝对表达量 ； (B)J2 骨髓源性巨噬细胞在 9 顺式维甲酸预处理 16 小时后， 转染 1ug/mlpoly ： C2 小时后提取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测环氧合酶 1 以及环氧合酶 2 的绝对表达量 ( 标准曲线如图 10A 所示 )， 两个独立实 验的实验数据已在图中显示。
34、 ； (C)J2 骨髓源性巨噬细胞在转染空白对照 (siRNA)， si-Cox1， si-Cox2 或 si-Cox1 与 si-Cox224 小时后， 随后 DMSO 或 9 顺式维甲酸处理 16 小时后， 再转 染 1ug/mlpoly ： C2 小时后提取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测环氧合酶 1mRNA 及环氧合 酶 2mRNA 的绝对表达量 (D) 野生型细胞或 Cox1 缺失型 J2 骨髓源性巨噬细胞在 DMSO， 9cRA 说 明 书 CN 105754947 A 7 6/10 页 8 或 HX531 处理 16 小时后， 转染 1ug/mlpoly ： C2 小时后提。
35、取其 RNA 并通过半定量 PCR 检测 lfnmRNA表达量。 (E)J2骨髓源性巨噬细胞在DMSO或9cRA处理16h后， 收集细胞上清液， ELISA 检测 PGE2 表达量。(F)J2 骨髓源性巨噬细胞用 DMSO 或 9cRA 预处理 16h， 收集上清 作为对照组。随后， 在指定时间转染 1ug/ml poly ： C， 通过 ELISA 检测对照组与 poly ： C 转染组上清中 PGE2 表达量。 0028 (C-F) 数据表现为均数 标准差 (n=3)， 上图作为其代表性实验。在三个独立的 实验中得到相似的结果 ： *P 0.05 且 * P 0.01(t 检验 ) 具体实。
36、施方式 0029 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式， 本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。 本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用， 本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用， 在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。 0030 在进一步描述本发明具体实施方式之前， 应理解， 本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案 ； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围 ； 在本发明说明书和权利要求书中， 除非文中 另外明确指出， 单数形式 “一个” 、“一”。
37、 和 “这个” 包括复数形式。 0031 当实施例给出数值范围时， 应理解， 除非本发明另有说明， 每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义， 本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。 除实施例中使用的具体方法、 设备、 材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载， 还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来实 现本发明。 0032 除非另外说明， 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、 生物化学、 染。
38、色质结构和分析、 分析化学、 细胞培养、 重组 DNA 技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明， 具体可参见 Sambrook 等 MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL， Second edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989 and Third edition， 2001 ； Ausubel 等， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， John Wiley & Sons， New York， 1987 and periodic 。
39、updates ； the series METHODS IN ENZYMOLOGY， Academic Press， San Diego ； Wolffe， CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego， 1998 ； METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol.304， Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe， eds.)， Academic Press， San Diego， 1999 ； 和 METHODS IN MOLECULAR 。
40、BIOLOGY， Vol.119， Chromatin Protocols(P.B.Becker， ed.)Humana Press， Totowa， 1999 等。 0033 核受体超家族 (nuclear receptor superfamily) 是一组配体激活的转录因子家 族， 通过在信号分子与转录应答间建立联系， 调控着细胞的生长和分化。RXR 在抵御病毒感 染的宿主防御中的作用仍然是未知的。我们发现 RXR 缺乏 F9 导致宿主细胞对鼠的 - 疱 疹病毒 68(MHV68) 的耐受性， 抵制病毒的感染。与这些功能型研究相反的是， 配体刺激 RXR 在巨噬细胞显著抑制抗病毒基因的表达。
41、， 其中包括一型干扰素以及多种干扰素刺激基因。 说 明 书 CN 105754947 A 8 7/10 页 9 我们的研究已经提供了进一步证据表明， COX1 在 RXR 刺激巨噬细胞中显著诱导产生， 介导 RXR 对一型干扰素的抑制作用， 因此我们发现了一种新型的 RXR-Cox-1 依赖性途径， 其在抑 制一型干扰素 - 调节抗病毒免疫中起到重要作用。这说明， RXR 在病毒感染的自身免疫反 应中通过下调其表达来抑制抗病毒基因的表达， 并在宿主抗病毒反应中起到优势作用。 0034 各实施例中所使用的 RAW264.7 细胞系从 ATCC 公司购得， 并给与 DMEM 加百分之十 的FBS以。
42、及百分之一的青霉素或链霉素共同培养。 RAW264.7细胞系从ATCC公司购得， 并给 与 DMEM 加百分之十的 FBS 以及百分之一的青霉素或链霉素共同培养。 0035 本发明实施例中所使用的 MHV68-luc 由 UCLA 的孙仁博士提供。 0036 将 RAW264.7 细胞植入 6 孔板中铺成 6*105， 给予 DMSO 或 RXR 激动剂或 RXR 拮抗 剂处理 16-24 小时。病毒传播同之前描述的一致 (Doyle 等 2002)。在培养基中细胞感 染 MHV68( 感染复数 =0.01)1 小时后， 重新更换含有百分之一胎牛血清的 DMEM。在第 12 小时 -16 小时。
43、质检收集其上清液、 MHV68-luc 感染由荧光素酶检测试剂盒进行定量检测 (Promega)。 0037 稳定的细胞系的构建方法 ： 人 RXR 克隆到 pBABE 嘌呤霉素逆转录载体中， 重组 pBABE- 人 RXR， pBABE 空载体， 或 pBABE- 人 RXR 共转染载体 psiA48 小时。收集病毒上清液 用来将人 RXR 转换为 RAW264.7 或 F9 胚胎癌细胞。感染细胞通过嘌呤霉素 (2g/ml) 形成转 化株 2 周后， 转化细胞即成为稳定的细胞系。 0038 无限增值的骨髓源性巨噬细胞制备方法参见 Palleroni 等 1991 ； zhou 等 2008。。
44、 0039 poly ： C、 poly dA:dT 和 siRNA 转染 ： poly ： C 与 poly dA:dT 在六孔板转染， 脂质体 2000 溶解于改良型 DMEM 培养基 5 分 钟， 2gpoly ： C 或 2g poly dA:dT 溶解于改良型 DMEM 培养基 , 将以上脂质体 2000 溶液以 及 poly ： C 或 poly dA:dT 溶液混合， 室温培养 15 分钟， 随后， 混合液加入含有 1.6ml 新鲜 培养基的细胞中。酶联免疫吸附法中的转染试剂 (polyplus 制备公司 ) 用做小干扰 RNA 的 转染。根据厂家说明， 将 10nM 对照组小干。
45、扰 RNA 或所示小干扰 RNA 转染 J2 骨髓源性巨噬 细胞中。 0040 统计方法 ： 病毒滴度曲线使用对数秩检验进行比较。 对于其他数据的统计显著性， 通过 2 tailed unpaired t test， 2-tailed Mann-Whitney U test 确定 PFU 数据， 视情况 使用 1-way ANOVA corrected 多重比较法。P 取值小于等于 0.05， 则被认为在统计学上是 显著的。所有计算均使用 GraphPad Software Inc. 的 Windows 的 Prism 软件程序。PFU 数据中的横条为各例的平均值， 各图中的误差条表示结构方程。
46、模型 (SEM) 和重复数据。 0041 实施例 1 RXR 的表达调控着宿主耐受性的鼠的 - 疱疹病毒 68 的感染 ： 我们以往的基因研究已经确立了一种新型的干扰素调节因子 3 依赖性但干扰素非依 赖性的机制来下调 RXR 的表达 (Chow 等 2006)。通过不同类型的病毒感染来确定 RXR 的表 达水平， 骨髓来源的巨噬细胞被鼠的 - 疱疹病毒 68 病毒感染。结果表明， 感染以上病毒 后引起 RXR 的表达下调 ( 如图 1A 所示 )。RXR 基因的抑制并不是由于感染后细胞状态改变 引起， 因为 L32 控制基因没有变化 ( 数据未显示 )。给予 RNA 病毒类似物 poly ：。
47、 C 和 DNA 病毒类似物 poly dA:dT， 可以激活细胞内病毒， 也显著抑制在骨髓巨噬细胞中 RXR 的表达。 ( 如图 1B 所示 ) 更重要的是， 它证实了这种抑制是宿主反应抗病毒刺激产生而不是病毒直 说 明 书 CN 105754947 A 9 8/10 页 10 接抑制宿主基因产生的。为了确定 RXR 在宿主的免疫反应在病毒感染过程中是否起到作 用， 可以持续稳定的表达人类 RXR， 逆转录病毒感染产生 pBABE 控制载体。( 如图 1C 所示 ) 鼠的 - 疱疹病毒 68 在人类 RXR 中感染引起过度表达的 Raw264.7 细胞系比对照组的细胞 病毒载量更多。这个结果。
48、在不同的群体之间以及单细胞克隆持续表达人类 RXR 之间是一致 的 ( 数据未显示 )。这些数据表明 RXR 缺乏 F9 提高宿主细胞对病毒感染的耐受性。 0042 为了进一步明确 RXR 在宿主抗病毒感染中的作用， 野生型 RXR 和缺乏 F9 胚胎癌细 胞给予注射鼠的 - 疱疹病毒 68， 通过蛋白免疫印迹测定 RXR 缺乏感染后细胞明显比野生 型细胞对水泡型口炎病毒更具有抵抗性。( 如图 1E 所示 ) 为了确定这种差异是否为 RXR 依 赖性， RXR 缺乏 F9 细胞通过逆转录病毒的感染重新建立人类 RXR 以及 pBABE 控制载体。给 予三种不同的人类 RXR 注射鼠的 - 疱疹。
49、病毒 68 比给予 RXR 缺乏 F9 细胞系重塑 pBABE 控 制产生更高的病毒滴度。( 如图 1D 所示 ) 这些结果表明 RXR 的缺乏提高了鼠的 - 疱疹病 毒 68 感染的宿主耐受性。 0043 综上所述， 在 RXR 过度表达的细胞给予更多病毒感染以及 RXR 缺乏细胞给予较少 的病毒感染， 说明 RXR 表达水平可能调控鼠的 - 疱疹病毒 68 感染的宿主耐受性。 0044 实施例 2 配体激活 RXR 抑制多种抗病毒基因的表达 ： 为了研究 RXR 是如何减弱宿主免疫反应并有利于病毒感染， 本发明发明人对给予 RXR 激动剂预先处理组以及巨噬细胞 Poly ： C 转染组进行了基因芯片检测。结果表明 9 顺式 维甲酸可以抑制多种 Poly ： C 诱导基因， 其中包括 型干扰素基因 ( 例如 IFN1、 IFN2、 IFN4、 IFN5)Isg15、 Ifit3以及Gbp3(如图3A)考虑到型干扰素以及其下游的干扰素刺激 基因 ISGs 在抗病毒感染中对宿主的免疫反应发挥着重要的作用， RXR 介导的对这些抗病毒 基因的抑制可能是宿主对病毒感染的易。