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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610290317.2 (22)申请日 2016.05.04 (71)申请人 陕西冠捷生物科技有限公司 地址 710000 陕西省西安市长安区灵沼乡 下南丰村沣灵路8号 (72)发明人 曹文波 (51)Int.Cl. C12P 13/04(2006.01) (54)发明名称 一种利用液态放线菌GJ制备磷脂酰丝氨酸 的方法 (57)摘要 本发明涉及一种利用液态放线菌GJ制备磷 脂酰丝氨酸的方法， 主要包括以下步骤： 将天然 的大豆卵磷脂与L-丝氨酸、 醋酸钠、 缓冲溶液、 液。
2、 态的放线菌GJ混合， 在40-43度的温度下搅拌反 应16-20小时； 反应到16小时开始薄层跟踪， 直到 反应完全， 反应产物明显与液态分离； 加入有机 溶剂萃取， 搅拌半小时， 静置1小时分离； 浓缩， 回 收有机溶剂， 到稠膏后真空抽半小时， 使浸膏内 的有机溶剂彻底没有后加入无水乙醇分散， 搅 拌， 离心； 离心过滤后的滤饼真空干燥， 既得磷脂 酰丝氨酸产品； 粉碎， 过筛， 包装。 本发明的优点 是， 采用液态的放线菌GJ， 这样可以使酶的成本 降低70以上， 总体来看整个过程简单， 反应时 间短， 生产周期小， 成本低， 产品得率高， 产品的 外观好， 含量高。 权利要求书1页 。
3、说明书4页 CN 105755064 A 2016.07.13 CN 105755064 A 1.一种利用液态放线菌GJ制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于， 主要包括以下步骤： (1)将天然的大豆卵磷脂与L-丝氨酸、 醋酸钠、 缓冲溶液、 液态的放线菌GJ混合， 在40- 43度的温度下搅拌反应16-20小时； (2)反应到16小时开始薄层跟踪， 直到反应完全， 反应完全后溶液会清亮， 反应产物明 显与液态分离； (3)加入有机溶剂萃取， 加入和缓冲溶剂等体积的有机溶剂， 搅拌半小时， 静置1小时分 离， 收集有机相； (4)浓缩， 回收有机溶剂， 到稠膏后真空抽半小时， 使浸膏内的有机溶剂。
4、彻底没有后加 入无水乙醇分散， 搅拌， 离心； (5)离心过滤后的滤饼真空干燥， 既得磷脂酰丝氨酸产品； (6)粉碎， 过筛， 包装。 2.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 所述的转化酶为液态的放线菌GJ， 其缓冲溶液是醋酸钠和氯化钙， 用乙酸微调。 3.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 所述L-丝氨酸为天然的 大豆卵磷脂的4-5倍， 醋酸钠为L-丝氨酸质量的15， 水量为天然的大豆卵磷脂的15-20 倍， 缓冲溶液的ph4.1-4.5； 先将各种缓冲盐溶于水中， 使其充分溶解， 再缓慢加入天然 的大豆卵磷脂， 搅匀， 最后加入原料2-5的液态的。
5、放线菌GJ， 升温开始反应。 4.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 步骤(2)中薄层显色一定要与对照相近， 薄层条件为： 氯仿甲醇乙酸440.2。 5.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 步骤(3)中有机溶剂为石油醚或为环己烷， 加入量为原料的15倍量， 搅拌后必须分层彻 底后方能放液。 6.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 步骤(4)无水乙醇加入量为原料的4-5倍量， 搅拌分散1小时候静置2小时以上再离心 过滤， 离心后用少量的乙醇洗涤， 无水乙醇量为产品的0.5倍左右。 7.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其。
6、特征在于： 步骤(5)中真空干燥温度温40-43度， 真空度0.08Mpa以上， 每隔2小时翻动一次。 8.根据权利要求1所述制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 步骤(6)中粉碎是要注意粉碎机的温度不能超过55度。 9.根据权利要求1-8任一项所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 其选用的天 然磷脂来源于非转基因的大豆卵磷脂， 转化所用的酶为液态的放线菌GJ。 10.根据权利要求1-8任一项所述的制备磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于： 所述放线 菌GJ是放线菌发酵产生磷脂酶D的性质和转化磷脂酰反应； 应用硫酸铵沉淀法、 乙醇沉淀 法、 聚乙二醇沉淀法对微生物发酵生产磷脂酶D进行了初。
7、步纯化。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105755064 A 2 一种利用液态放线菌GJ制备磷脂酰丝氨酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用液态放线菌GJ制备磷脂酰丝氨酸的方法。 背景技术 0002 磷脂根据甘油骨架的不同可以分为磷酸甘油脂(glycerolphospholipid)和鞘磷 脂(sphingolipid)。 它们都是极性脂。 极性脂由极性部分(叫做极性头)和非极性部分(叫做 非极性尾)组成。 其中， 甘油磷脂又可以根据极性头部集团的不同区分为磷脂酰胆碱 (Phosphatidylcholines， PC)、 磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanola。
8、mines， PE)、 磷脂酰 丝氨酸(Phosphatidylserines， PS)、 磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositols， PI)、 磷脂酰 甘油(PG)、 甘油磷脂酸(phosphatidicacid， PA)等。 0003 磷脂酰丝氨酸， 又称复合神经酸。 英文名Phosphatidylserine， 简称PS， 由天然大 豆榨油剩余物提取。 是细胞膜的活性物质， 尤其存在于大脑细胞中。 其功能主要是改善神经 细胞功能， 调节神经脉冲的传导， 增进大脑记忆， 由于其具有很强的亲脂性， 吸收后能够迅 速通过血脑屏障进入大脑， 起到舒缓血管平滑肌细胞， 增加脑部供血的。
9、作用。 0004 磷脂作为一种生物活性物质， 有着独特的理化性质和营养价值， 在世界范围内的 食品、 保健品、 医药以及饲料行业已被广泛使用， 人们通过使用磷脂可以起到调节血脂、 改 善记忆、 保护肝脏、 健脑益智、 以 及延缓衰老等生理功能的 作用。 磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine， PS)是磷脂家族中的一员， 它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能 状态的磷脂， 是人体不可或缺的物质。 所以只要正常服用磷脂酰丝氨酸类的膳食剂并不会 给身体带来额外的负担， 并且通过了许多国家的药监局认证。 0005 磷脂酰丝氨酸的制备方法主要有萃取法和酶转化法， 其中萃取法主要是肉类及鱼 。
10、类中均含有磷脂酰丝氨酸， 脑或内脏(如肝、 肾)中的含量较高。 奶制品以及蔬菜中(除豆类) 磷脂酰丝氨酸的含量非常少， 所以萃取动物的脑或内脏(如肝、 肾)的卵磷脂为主要途径， 目 前国内外主要以牛、 羊、 兔、 马、 驴等家禽的脑或内脏(如肝、 肾)为原料来萃取磷脂酰丝氨 酸， 但是近年来由于动物疾病的泛滥使得有动物作为原料所得的磷脂酰丝氨酸产品的安全 性受到人们的担心， 所以慢慢的将被淘汰。 0006 酶转化法主要是以天然的大豆卵磷脂为原料， 加入L-丝氨酸， 在磷脂酶的作用下， 生成磷脂酰丝氨酸。 目前国内外的的文献报道了利用卵磷脂和固态放线菌GJ转化磷脂酰丝 氨酸的方法， 这些方法中的。
11、放线菌GJ的来源一般是利用发酵获得液态的磷脂酶-D、 磷脂酶- E、 磷脂酶-C， 由于酶在液态状态下活性很难保持， 所以把就把液态的磷脂酶通过冷冻干燥 制备成固态的磷脂酶-D， 这样势必增加了磷脂酶的成本， 而且在这个过程中是相当一部分 有效的磷脂酶损失。 最终导致固体的磷脂酶在反应中用量增加， 同时增加了反应成本， 另 外， 在反应中固体的磷脂酶需要再次活化， 这个过程也会引起其它反映， 使得反应时间长， 产品中副产物多， ps的转化率低， 产品的状态差， 单位产品的成本高。 发明内容 说明书 1/4 页 3 CN 105755064 A 3 0007 本发明的目的是提供一种新的液态的放线。
12、菌GJ及利用液态的放线菌GJ制备磷脂 酰丝氨酸的方法， 以解决现有技术中磷脂酶-D价格高， 产品中收率低， 副产物多， 生产成本 高等问题。 0008 为了实现上述目的， 本发明采用了以下的技术方案： 一种利用液态放线菌GJ制备 磷脂酰丝氨酸的方法， 主要包括以下步骤： 0009 (1)将天然的大豆卵磷脂与L-丝氨酸、 醋酸钠、 缓冲溶液、 液态的放线菌GJ混合， 在 40-43度的温度下搅拌反应16-20小时； 0010 其中， L-丝氨酸为天然的大豆卵磷脂的4-5倍， 醋酸钠为L-丝氨酸质量的15， 水 量为天然的大豆卵磷脂的15-20倍， 缓冲溶液的ph4.1-4.5； 先将各种缓冲盐溶。
13、于水中， 使其充分溶解， 再缓慢加入天然的大豆卵磷脂， 搅匀， 最后加入原料2-5的液态的放线菌 GJ， 升温开始反应； 0011 反应到16小时候开始薄层跟踪， 直到反应完全， 反应完全后溶液会清亮， 反应产物 明显与液态分离； 0012 加入有机溶剂萃取， 加入和缓冲溶剂等体积的有机溶剂， 搅拌半小时， 静置1小时 分离， 收集有机相； 0013 浓缩， 回收有机溶剂， 到稠膏后真空抽半小时， 使浸膏内的有机溶剂彻底没有后加 入无水乙醇分散， 搅拌， 离心 0014 离心过滤后的滤饼真空干燥， 既得磷脂酰丝氨酸产品 0015 粉碎， 过筛， 包装。 0016 根据以上的流程及基本方案， 本。
14、发明对此方案作如下要求 0017 上述缓冲溶液的配置需加入少量的氯化钙校正， 确保ph值得稳定， 步骤(1)中反应 时升温一定要缓慢， 防止温度过高破坏酶效。 0018 上述步骤(2)中薄层显色一定要与对照相近， 薄层条件为： 氯仿甲醇乙酸44 0.2 0019 上述步骤(3)中有机溶剂为石油醚或为环己烷， 加入量为原料的15倍量， 搅拌后必 须分层彻底后方能放液。 0020 上述步骤(4)无水乙醇加入量为原料的4-5倍量， 搅拌分散1小时候静置2小时以 上再离心过滤。 0021 上述步骤(4)中离心后用少量的乙醇洗涤， 无水乙醇量为产品的0.5倍左右。 0022 上述步骤(5)中真空干燥温度。
15、温40-43度， 真空度0.08Mpa以上， 每隔2小时翻动一 次。 0023 上述步骤(6)中粉碎是要注意粉碎机的温度不能超过55度。 0024 本发明中所说的原料来源广泛， 优质的非转基因大豆卵磷脂， 其中磷脂酰胆碱含 量在20-90， 均可发生反应， 经综合考虑， 我们选用含量适中的磷脂酰胆碱， 即50的 大豆卵磷脂作为反应原料。 0025 磷脂酶D(PLD)是本发明合成工艺磷脂的关键技术， 因而该酶制剂及应用技术得到 重视和发展。 本发明中的放线菌GJ是放线菌发酵产生磷脂酶D的性质和转化磷脂酰反应。 应 用硫酸铵沉淀法、 乙醇沉淀法、 聚乙二醇沉淀法对微生物发酵生产磷脂酶D进行了初步纯。
16、 化。 其中， 硫酸铵盐析法在60饱和度时提纯了8.01倍， 回收率为50.9； 乙醇沉淀法在用 说明书 2/4 页 4 CN 105755064 A 4 量体积分数1.01时提纯了8.08倍， 回收率为60； 聚乙二醇沉淀法在0.4g/mL时提纯了 11.2倍， 回收率为50.9。 采用分光光度法检测不同条件下的磷脂酶D水解活力在pH值为4- 8时， 酶活性较稳定； 温度低于40时酶活力较稳定。 磷脂酶D的保存稳定性较好， 在4下保 存30天尚有80以上的酶活力。 0026 本发明的有益效果和特点： 0027 本发明的放线菌GJ为液态的， 其省去了将酶固化所产生的， 酶活降解， 提高了转化 。
17、效率， 节省了中间环节， 缩短了生产周期， 提高了转化率。 0028 在转化过程中采用了水为介质， 这样操作简单， 分离过程中利用了少量的有机溶 剂萃取， 这样省去了中间富集和重结晶的步骤， 使生产周期大大缩短， 并且提高了产品的收 率， 同时经过无水乙醇的分散， 既杀死了带入产品中少量的放线菌GJ的活性， 保证了产品的 稳定性， 同时无水乙醇可以溶解产品中的油脂， 这样可以使最终产品状态好， 粉碎容易， 为 后续的深加工提供了便利。 0029 本发明的有益效果在于： 采用了液态的放线菌GJ， 这样可以使酶的成本降低70 以上， 总体来看整个过程简单， 反应时间短， 生产周期小， 成本低， 产。
18、品得率高， 产品的外观 好， 含量高。 具体实施方式 0030 实施例1 0031 在用于反应的平底烧瓶中加入50g磷脂酰胆碱含量为53.45的大豆卵磷脂， L-丝 氨酸200g， 醋酸钠31g， 氯化钙3.6g， 1000ml的去离子水， 用少量的冰醋酸调ph使溶液的pH值 为4.3， 搅匀， 加入液态的放线菌GJ2.5ml， 搅拌缓慢升温至43度， 开始计时， 反应16小时， 薄 层检测转化率， 加入1000ml(60-90)的石油醚萃取， 有机相浓缩至浸膏， 再加入200ml无水 乙醇分散， 搅拌1小时， 静置2小时， 离心过滤， 真空干燥的46.45g磷脂酰丝氨酸含量为 55.28的粉。
19、末磷脂。 0032 实施例2 0033 在用于反应的平底烧瓶中加入50g磷脂酰胆碱含量为53.45的大豆卵磷脂， L-丝 氨酸200g， 醋酸钠31g， 氯化钙3.6g， 1000ml的去离子水， 用少量的冰醋酸调ph使溶液的pH值 为4.3， 搅匀， 加入固态的磷脂酶-D750mg， 搅拌缓慢升温至43度， 开始计时， 反应16小时， 薄 层检测转化率， 加入1000ml(60-90)的石油醚萃取， 有机相浓缩至浸膏， 再加入200ml无水 乙醇分散， 搅拌1小时， 静置2小时， 离心过滤， 真空干燥的41 .28g磷脂酰丝氨酸含量为 51.25的粉末磷脂。 0034 实施例3 0035 在。
20、用于反应的平底烧瓶中加入50g磷脂酰胆碱含量为53.45的大豆卵磷脂， L-丝 氨酸200g， 醋酸钠31g， 氯化钙3.6g， 1000ml的去离子水， 用少量的冰醋酸调ph使溶液的pH值 为4.3， 搅匀， 加入液态的放线菌GJ2.5ml， 搅拌缓慢升温至43度， 开始计时， 反应16小时， 薄 层检测转化率， 加入1000ml环己烷萃取， 有机相浓缩至浸膏， 再加入200ml无水乙醇分散， 搅 拌1小时， 静置2小时， 离心过滤， 真空干燥的44.83g磷脂酰丝氨酸含量为56.77的粉末磷 脂。 0036 实施例4 说明书 3/4 页 5 CN 105755064 A 5 0037 在用。
21、于反应的平底烧瓶中加入50g磷脂酰胆碱含量为53.45的大豆卵磷脂， L-丝 氨酸200g， 醋酸钠31g， 氯化钙3.6g， 1000ml的去离子水， 用少量的冰醋酸调ph使溶液的pH值 为4.3， 搅匀， 加入固态的磷脂酶-D750mg， 搅拌缓慢升温至43度， 开始计时， 反应16小时， 薄 层检测转化率， 加入1000ml环己烷萃取， 有机相浓缩至浸膏， 再加入200ml无水乙醇分散， 搅 拌1小时， 静置2小时， 离心过滤， 真空干燥的39.75g磷脂酰丝氨酸含量为51.95的粉末磷 脂。 0038 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 105755064 A 6 。