技术领域
本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，尤其是从千金子中提取巨大戟醇单体的分离纯化方法，属于中药分离纯化技术领域。
背景技术
千金子为大戟科植物续随子EuphorbialathyrisL.的种子。又名千两金、菩萨豆（《日华子》），续随子（《开宝本草》），拒冬实（《本草图经》），联步（《斗门方》），拒冬子（《本草汇言》），滩板救（《湖南药物志》），看园老（《贵州草药》），百药解、干金药解（《云南药用植物志》），小巴豆（《山西中草药》）。原植物续随子又名：拒冬（《开宝本草》），半枝莲（《纲目拾遗》），降龙草（《陕西中药名录》）。具有逐水退肿，破血消症，解毒杀虫的功效。
巨大戟醇，英文名：Ingenol，分子式为C20H28O5，分子量为348.433，结构式如下：
巨大戟醇来源于大戟科植物续随子EuphorbialathyrisL.的种子，是千金子药材中的活性成分，在千金子药材中的含量约十万分之六，巨大戟醇甲基丁烯酸酯治疗光线性角化病和周围皮肤区域（即区域疗法）可根除临床和亚临床光线性角化病。而目前有关对千金子中巨大戟醇单体的研究报道较少，更没有较成熟的生产提取工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巨大戟醇单体的分离纯化方法。该方法分离效率高，生产周期短，工艺稳定，操作简便，成本低廉，可实现大量巨大戟醇单体的高纯度分离制备。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种巨大戟醇单体的分离纯化方法，其特征在于：以大戟科植物续随子的种子为原料，通过提取、萃取、硅胶柱层析、溶解过滤、高效制备液相色谱分离、产品回收得到巨大戟醇单体，具体工艺步骤如下：
1）提取
将千金子药材粉碎成1～4mm的粗粉，按体积/质量加入6～10倍的乙醇溶液，提取3～4次，每次2～3小时，回收乙醇，合并过滤液，待下一步处理；
所述乙醇溶液的体积百分比浓度为80～95%；
由于巨大戟醇极性较小，因而采用80～95%的乙醇提取可确保获得较高的提取率。
2）萃取
将步骤1）所得的过滤液，加入等体积的乙酸乙酯萃取3～4次，分取上层溶液，浓缩至干，得浓缩液，进行下一步处理；可确保除去大量水溶性杂质；
3）硅胶柱层析
将步骤2）所得的浓缩液加入10倍重量的硅胶拌样，50℃干燥拌样硅胶，石油醚:乙酸乙酯体积比=1:1洗脱产品，柱层析产品液50℃浓缩至干，得固体物，待下一步处理；
采用等体积的石油醚、乙酸乙酯进行硅胶柱层析的洗脱，可确保有效除去极性较小的油脂性杂质和极性较大的杂质。
4）溶解过滤
按照固体物质量:溶剂体积=1g：20～40ml，将步骤3）所得的固体物加甲醇溶解，过滤溶解液，过滤液即是制备巨大戟醇单体的原料；可确保固体完全溶解并达到制备原料的浓度要求，以方便下一步制备。
5）HPLC制备
色谱条件如下：
色谱柱填料为：C18填料；
流动相为：乙腈-水V/V=32：68，确保流动相能使巨大戟醇产品峰与其他杂质峰很好的分离开；
取步骤4）所得的过滤液进样，进样量以过滤液所含的干品重量计为0.5～1.0g/针，在线紫外监测，检测波长为210nm，针对性收集目标化合物制备溶液，得巨大戟醇单体的HPLC制备液；
在进行高效制备液相色谱分离（HPLC）前，通过液-质联用方法确定高效液相色谱中巨大戟醇单体的峰形，色谱条件同上，即取步骤4）所得过滤液进样，进行巨大戟醇单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定巨大戟醇单体在液相色谱中对应的峰形。
6）产品回收
将步骤5）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，45～65℃浓缩至干即得巨大戟醇单体产品。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，其色谱条件如下：填料为C18，流动相为乙腈-水V/V=34：66，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为210nm。
本发明的优点在于：
1.本发明通过萃取使巨大戟醇从提取浓缩水溶液中转移至乙酸乙酯溶液中，不仅提高了目标物浓度，同时由于乙酸乙酯易于浓缩，还减少了能耗。
2.本发明采用制备型高效液相色谱系统对巨大戟醇单体进行分离纯化，达到了很好的分离效果，并且通过在线紫外监测，针对性的收集巨大戟醇单体，目标明确，同时还便于控制产品质量，产品纯度（面积归一法）可达98%以上。
3.由于高效液相色谱对样品的色泽、纯度等要求比较高，通过简单处理得到的提取液不能直接进样，因此若在进行高效液相色谱分离前，不按照本发明方法步骤对进样溶液进行前处理，则不但分离效果不好，而且还可能对仪器造成严重影响（如缩短寿命等），进而增加产品的生产成本。
4.针对千金子药材中存在的各种成分的理化性质，本发明通过前述步骤1）、2）、3）、4）的顺序搭配，以及适当的参数组合，有效提取出了巨大戟醇等成分，并除去了大量杂质，由此获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约了生产成本。
5.在高效液相色谱分离过程中，各色谱条件的选择及其组合很重要，因为它直接影响物质的出峰时间、峰形等；色谱条件主要包括色谱柱（包括填料、柱长、柱温等）、流动相（包括成分、流速等）、检测器及检测波长等。本发明通过大量的试验研究和对比分析，确定了以上所述的色谱条件，从而使物质的出峰时间、峰形、分离效果等达到最佳化，实现了巨大戟醇单体的高效分离。
附图说明
图1是本发明实施例1巨大戟醇单体产品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明仅限于下述实施例。
下述各实施例中，终产品巨大戟醇单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：
填料为C18，流动相为乙腈-水（体积比为34：68），柱温为30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为210nm。
实施例1
1）提取
将千金子药材20kg粉碎成1～4mm的粗粉，加入160L体积百分比浓度为90%的乙醇溶液，提取3次，每次2小时，回收乙醇，合并过滤液，共6000ml；
2）萃取
将步骤1）所得的过滤液，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，分取上层溶液，浓缩至干，得浓缩液3000 ml，进行下一步处理；
3）硅胶柱层析
将步骤2）所得的浓缩液加入10倍重量的硅胶拌样，50℃干燥拌样硅胶，石油醚：乙酸乙酯（1：1体积比）洗脱产品，柱层析产品液50℃浓缩至干，得固体物1.0克；
4）溶解过滤
将步骤3）所得固体物加入40ml甲醇溶解，过滤溶解液，得过滤液39ml；
5）HPLC制备
采用填料为C18的色谱柱，柱规格为25cm×5cm；
流动相组成为：乙腈-水（V/V=32：68）；
检测波长为210nm，室温操作；
取步骤4）所得的过滤液进样，进样量为0.5g/针（以过滤液所含的干品重量计），进行巨大戟醇单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物巨大戟醇单体的HPLC制备液600ml；
在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中巨大戟醇单体的峰形，取步骤4）所得过滤液进样，进行巨大戟醇单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定巨大戟醇单体在液相色谱中对应的峰形。
6）产品回收
将步骤5）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，45℃浓缩至干得到巨大戟醇单体产品0.33克。
整个生产流程用时约7天。
计算得产品收率为（0.33/20000）×100%=0.00165%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为98.00%。
实施例2
1）提取
将千金子药材60kg粉碎成1～4mm的粗粉，加入360L体积百分比浓度为95%的乙醇溶液，提取4次，每次3小时，回收乙醇，合并过滤液，共15000ml；
2）萃取
将步骤1）所得的过滤液，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，分取上层溶液，浓缩至干，得浓缩液5000ml，进行下一步处理；
3）硅胶柱层析
将步骤2）所得的浓缩液加入10倍重量的硅胶拌样，50℃干燥拌样硅胶，石油醚：乙酸乙酯（1：1体积比）洗脱产品，柱层析产品液50℃浓缩至干，得固体物4.0克；
4）溶解过滤
将步骤3）所得固体物加入120ml甲醇溶解，过滤溶解液，得过滤液115ml；
5）HPLC制备
采用填料为C18的色谱柱，柱规格为50cm×8cm；
流动相组成为：乙腈-水（V/V=32：68）；
检测波长为210nm，室温操作；
取步骤4）所得的过滤液进样，进样量为1.0g/针（以过滤液所含的干品重量计），进行巨大戟醇单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物巨大戟醇单体的HPLC制备液2000ml；
在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中巨大戟醇单体的峰形，取步骤4）所得的过滤液进样，进行巨大戟醇单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定巨大戟醇单体在液相色谱中对应的峰形。
6）产品回收
将步骤5）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，50℃浓缩至干得到巨大戟醇单体产品2.0克。
整个生产流程用时约10天。
计算得产品收率为（2.0/60000）×100%=0.00333%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.20%。
实施例3
1）提取
将千金子药材20kg粉碎成1～4mm的粗粉，加入160L体积百分比浓度为95%的乙醇溶液，提取3次，每次2小时，回收乙醇，合并过滤液，共5000ml；
2）萃取
将步骤1）所得的过滤液，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，分取上层溶液，浓缩至干，得浓缩液2000ml，进行下一步处理；
3）硅胶柱层析
将步骤2）所得的浓缩液加入10倍重量的硅胶拌样 ，50℃干燥拌样硅胶，石油醚：乙酸乙酯（1：1体积比）洗脱产品，柱层析产品液50℃浓缩至干，得固体物1.2克；
4）溶解过滤
步骤3）所得固体物加入40ml甲醇溶解，过滤溶解液，得过滤液39ml；
5）HPLC制备
采用填料为C18的色谱柱，柱规格为25cm×5cm；
流动相组成为：乙腈-水（V/V=32：68）；
检测波长为210nm，室温操作；
取步骤4）所得的过滤液进样，进样量为0.6g/针（以过滤液所含的干品重量计），进行巨大戟醇单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物巨大戟醇单体的HPLC制备液1000ml；
在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中巨大戟醇单体的峰形，取步骤4）所得的过滤液进样，进行巨大戟醇单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定巨大戟醇单体在液相色谱中对应的峰形。
6）产品回收
步骤5）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，55℃浓缩拉干得到巨大戟醇单体产品0.7克。
整个生产流程用时约6天。
计算得产品收率为（0.7/20000）×100%=0.0035%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.31%。
实施例4
1）提取
将千金子药材30kg粉碎成1～4mm的粗粉，加入300L体积百分比浓度为80%的乙醇溶液，提取3次，每次2小时，回收乙醇，合并过滤液，共7000ml；
2）萃取
将步骤1)所得的过滤液，加入等体积的乙酸乙酯萃取4次，分取上层溶液，浓缩至干，得浓缩液3000ml，进行下一步处理；
3）硅胶柱层析
将步骤2）所得的浓缩液加入10倍重量的硅胶拌样，50℃干燥拌样硅胶，石油醚：乙酸乙酯（1：1体积比）洗脱产品，柱层析产品液50℃浓缩至干，得固体物1.5克；
4）溶解过滤
步骤3）所得固体物加入30ml甲醇溶解，过滤溶解液，得过滤液29ml；
5）HPLC制备
采用填料为C18的色谱柱，柱规格为25cm×5cm；
流动相组成为：乙腈-水（V/V=32：68）；
检测波长为210nm，室温操作；
取步骤4）所得的过滤液进样，进样量为0.7g/针（以过滤液所含的干品重量计），进行巨大戟醇单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物巨大戟醇单体的HPLC制备液1200ml；
在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中巨大戟醇单体的峰形，取步骤4）所得的过滤液进样，进行巨大戟醇单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定巨大戟醇单体在液相色谱中对应的峰形。
6）产品回收
步骤5）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，65℃浓缩至干得到巨大戟醇单体产品1.2克。
整个生产流程用时约7天。
计算得产品收率为（1.2/30000）×100%=0.004%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.45%。