技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一个能与血管紧张素转换酶结合，抑制其活性， 也能抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性的二肽。
背景技术
血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE,EC3.4.15.1，文献中曾用名有 kininaseIl,dipeptidyl carboxypeptidase I等)是一种二羧肽酶，是导致高血压的一个关键酶，它 通过水解作用把血管紧张肽Ⅰ转化成血管紧张肽Ⅱ，与此同时，ACE还可钝化血管舒缓激肽， 这两种作用均可导致血管收缩，从而引起高血压。因此ACE被认为是引起高血压的一个重 要因素。经研究发现血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，可通过抑制ACE的活性而达到降血 压的作用。ACE抑制剂广泛用于治疗心血管、高血压、心力衰竭、肾衰竭等疾病。ACE抑制 剂最初是从蛇毒中发现的，随后人们发现从食物原料中提取的ACE抑制肽，如明胶、酪蛋白、 鱼、无花果树胶、α-玉米蛋白等都可作为制备ACE抑制肽的原料。
3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是体内催化3-羟基-3-甲基戊二酸单 酰辅酶A(HMG-CoA)生成二羟甲基戊酸(MVA)的关键酶，这一步是体内合成胆固醇的限速步 骤，也是目前最主要的高血脂症临床药物的靶点。HMG-CoA还原酶抑制剂是降血脂功效成 分和药物筛选主要手段之一。
降血压的药物常见的有：
①、利尿剂：代表药物有氢氯噬嗓、氨苯蝶吮、螺内酉旨等。
②、片受体阻滞剂：代表药物有普蔡洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、纳多洛尔等。
③、钙通道阻滞剂：代表药物有硝苯地平、氨氯地平、非洛地平、尼群地平、拉西地平 等。
④、血管紧张素转换酶抑制剂：代表药物有卡托普利、苯那普利、赖诺普利、依那普利、 西拉普利等。
⑤、a一受体阻滞剂：代表药物有呱哇嗓、特拉哩嗦等。
⑥、血管紧张素11受体拮抗剂：代表药物有洛沙坦、撷沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、 伊贝沙坦、替米沙坦等。
降血脂的药物有：
1、苯氧芳酸类：此类药物有非诺贝特、吉非罗齐、苯扎贝特等。苯氧芳酸类药物降血脂 作用强，起效快，降甘油三酯的作用比降胆固醇的作用强。
2、三羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶抑制剂：此类药物有洛伐他丁、辛伐他丁、普伐他丁 等。此类药物以降胆固醇为主，降脂作用强，起效快。
3、烟酸类：此类药物中氧甲吡嗪较常用，降低血清甘油三脂的作用比降低胆固醇强。
4、多不饱和脂肪酸类：包括各种植物种子油。如橡胶种子油，月见草子，水飞蓟种子的 油和海鱼的制剂。这类药物有降血脂和降低血粘度的作用，但作用比较温和。
5、泛硫乙胺：为辅酶A的衍生物，有降低血清胆固醇、甘油三脂和升高高密度脂蛋白- 胆固醇的作用。
6、藻酸双酯钠(PPS)：是以海藻撮物为原料的类肝素海洋药物。具有显著降低血粘度、 扩张血管和降低血脂，升高HGD水平的作用。主要用于缺血性心脑血管疾病的防治。
7、其他降血脂药物：如银杏类(天保宁)实验证明能使血清甘油三脂(TG)显著降低。
现有药物报道，除中药外，同时具有降血压和降血脂作用的药物很少见。因为这两种药 所作用的靶标不同。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有降血压和降血脂双功能的二肽GD及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种二肽GD，该二肽GD的氨基酸序列为：Gly-Asp。
本发明还同时提供了上述二肽GD的用途：作为ACE抑制肽和HMG-CoA还原酶抑制肽。
本发明的二肽GD可通过委托吉尔生化（上海）有限公司合成获得。
本发明所报道的二肽GD是针对ACE和HMG-CoA还原酶两个靶标均具有抑制活性，从而 表现出同时具有降血压和降血脂双功能的特性。
本发明中所涉及的各项检测方法具体如下：
1、ACE抑制活性的检测方法：
ACE在37℃，pH值为8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟物 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸（HA），该物质在紫外225nm处具有特征吸 收峰；当加入ACE抑制剂时ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少， 通过HPLC方法，测定加入抑制剂前后所生成马尿酸的量的变化即可算出抑制活性的大小。
反应体系为：依次分别加入20μL0.1U/mL的ACE、50μL ACE抑制肽（即GD二肽）在 37℃温浴5min，然后加入10μL5mM的HHL底物启动ACE的催化反应，在37℃振荡水浴 30min后加入250μL1.0moL/L的HCl终止反应，体系溶液过0.45μm滤膜后进行RP-HPLC 检测分析马尿酸（HA）的含量。上述同样条件，以50μL0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL /L的NaCl，pH=8.3)代替ACE抑制剂作为空白反应体系。
注：上述ACE、HHL底物均是以0.1moL/L的硼酸缓冲液(含0.3moL/L的NaCl，pH= 8.3)为溶剂。
ACE抑制肽（GD二肽），以不同浓度溶解在0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的 NaCl，pH=8.3)中而得。
RP-HPLC检测：溶剂Ⅰ为0.05%（V/V）三氟乙酸(TFA)和0.05%（v/v）的三乙胺(TTA) 溶于去离子水中，溶剂Ⅱ为100%的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70%：30%（体积 比），流速为0.5mL/min，检测波长为225nm,检测柱温为30℃。
ACE抑制活性根据下式计算：
I%=（A-B）/A×100%
A：不加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
B：加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
ACE：1U单位定义为，在标准检测条件下，在37℃，1min时间内催化底物 (Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine,HHL)，产生1μM马尿酸所消耗ACE的量。即，为ACE的活 性单位。
2、降血脂肽活性的体外检测方法：
色谱条件
C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。流动相为:V(K2HPO4-KH2PO4)：V(甲 醇)=85：15，pH7.2，等度洗脱，流速1mL/min；检测波长337nm；进样量20μL；柱温 25℃。
反应体系实验步骤
反应中各种组分的加入量及顺序如表1，反应温度37℃水浴，反应完成后加入200μL0.5 mol/L NaOH溶液终止反应，按上述的色谱条件测量样品中NADPH的浓度。反应时间根据酶 对照组时间梯度来确定。
表1反应体系组成成分
备注说明：反应缓冲液为0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，HMGR溶液的浓度为6.56μg/mL， HMG-CoA溶液浓度为5.23mmol/mL，NADPH溶液浓度为1mg/mL。
实验结果的计算
加入抑制剂后,HMG-CoA还原酶的活性受到抑制，底物反应的量减少。因此,可以利用 HPLC测定反应前后NADPH量的变化来评价抑制剂对HMG-CoA还原酶的抑制率。计算公 式为：
R=(S抑制剂-S对照)/(S空白-S对照)×100
式中，R为抑制率(%)；S空白、S对照和S抑制剂分别为空白组、酶对照组和抑制剂组中 NADPH的峰面积(mAU.min)。
本发明的优点和积极效果：
（1）该二肽GD可以抑制血管紧张素转换酶的活性。
依据本发明所述的氨基酸序列，可委托吉尔生化（上海）有限公司合成，从而获得本 发明所述的ACE抑制肽（或简称为二肽GD）。
（2）本发明的ACE抑制肽（或简称为二肽GD）同时具有HMG-CoA还原酶抑制活性。
本发明的ACE抑制肽和HMG-CoA还原酶抑制肽（或简称为二肽GD）的用法和用量如下：
本发明的二肽为口服型，用量为口服，每次1.5g，每日2～3次。
具体实施方式
实施例1、
1）、二肽GD在1.0mg/mL的浓度下的ACE抑制活性：
色谱条件：溶剂Ⅰ为0.05%三氟乙酸(TFA)和0.05%的三乙胺(TTA)溶于去离子水中(即 每升溶剂Ⅰ中含有0.5mL的三氟乙酸和0.5mL的三乙胺)，溶剂Ⅱ为100%的色谱纯乙睛。溶剂 Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70%：30%（体积比），ultimate3000戴安液相色谱仪，色谱柱为waters Symmetry C185μm4.6×250mm,流速为0.5mL/min，进样量10μL，检测波长为225nm,检测 柱温为30℃。
检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽GD，进行活性检测（检测方法同上）。此时 GD浓度为1.0mg/mL。
结果：二肽GD在1.0mg/mL时的ACE抑制活性为31.48%。
2）、二肽GD在1.0mg/mL的浓度下的HMG-CoA还原酶抑制活性：
色谱条件：C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。流动相为:V (K2HPO4-KH2PO4)：V(甲醇)=85：15，pH7.2，等度洗脱，流速1mL/min；检测波长337nm； 进样量20μL；柱温25℃。
检测方法：将通过化学合成法获得此的二肽GD，进行活性检测（检测方法同上）。此时 GD浓度为1.0mg/mL。
结果：二肽GD在1.0mg/mL时的HMG-CoA还原酶抑制活性为44.68%。
实施例2、
1）、二肽GD在2.0mg/mL的浓度下的ACE抑制活性：
色谱条件：溶剂Ⅰ为0.05%三氟乙酸(TFA)和0.05%的三乙胺(TTA)溶于去离子水中； 溶剂Ⅱ为100%的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70%：30%，ultimate3000戴安液相 色谱仪，色谱柱为waters Symmetry C185μm4.6×250mm,流速为0.5mL/min，进样量10μL， 检测波长为225nm,检测柱温为30℃。
检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽GD，进行活性检测（检测方法同上）。此时 GD浓度为2.0mg/mL。
结果：二肽GD在2.0mg/mL时的ACE抑制活性为55.74%。
2）、二肽GD在2.0mg/mL的浓度下的HMG-CoA还原酶抑制活性：
色谱条件：C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。流动相为:V (K2HPO4-KH2PO4)：V(甲醇)=85：15，pH7.2，等度洗脱，流速1mL/min；检测波长337nm； 进样量20μL；柱温25℃。
检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽GD，进行活性检测（检测方法同上）。此时 GD浓度为2.0mg/mL。
结果：二肽GD在2.0mg/mL时的HMG-CoA还原酶抑制活性为61.20%。
通过实施例1和实施例2中的抑制浓度和活性数据，说明此二肽GD的活性与浓度存在 量效关系，此二肽GD同时具有ACE抑制活性和HMG-CoA还原酶抑制未见报道，属于新的 兼具ACE抑制活性和HMG-CoA还原酶抑制活性的双功能肽。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形，比如不同蛋白质来源降解分离所得的GD结构及其衍生 化结构。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江省农业科学院
<120> 具有降血压和降血脂双功能的二肽GD及其用途
<160> 1
<210> 1
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二肽GD
<400> 1
Gly Asp