一种中度嗜盐的无机解磷功能菌.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102051340 A (43)申请公布日 2011.05.11 CN 102051340 A *CN102051340A* (21)申请号 201010546338.9 (22)申请日 2010.11.17 CGMCC No.4212 2010.09.30 C12N 1/20(2006.01) (71)申请人 国家海洋局第一海洋研究所 地址 266061 山东省青岛市崂山区仙霞岭路 6 号 (72)发明人 曲凌云 孙修勤 朱凤玲 洪旭光 张进兴 (54) 发明名称 一种中度嗜盐的无机解磷功能菌 (57) 摘要 本发明涉及保藏号为 CGMCC No.4212 的一种 。

2、中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8， 本发明属微生 物技术领域。目前我国滨海盐土种植中缺乏有效 的无机解磷菌。本发明涉及的菌株分离自海底沉 积物， 其能在 pH 值为 4-9、 NaCl 浓度为 0.5-15 (w/v) 的环境中生长。本发明涉及的菌株具有溶 解磷酸钙的能力， 实验室培养结果表明该细菌能 使初始 pH 值为 7.8， 可溶性磷浓度为 0 的含磷酸 钙的培养基中最终可溶性磷浓度达到 280mg/l， pH 值降至 5。本发明提供的无机解磷菌菌株 YH8 由于有较广的pH值和NaCl生长适应范围， 可适应 滨海盐土生存环境， 并能明显降低培养环境的 pH 值， 这使本发明十分有意义。。

3、 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102051346 A1/1 页 2 1. 一种中度嗜盐的无机解磷功能菌， 其特征在于中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.) 属于 Kushneria 属， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 保藏号为 CGMCC No.4212， 保藏日期为 2010 年 9 月 30 号。 2. 根据权利要求书 1 所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌， 其特征在于中度嗜盐的 无机解磷功能菌 YH8(Ku。

4、shneria sp.) 为革兰氏阴性杆菌， 氧化酶阴性， 接触酶阳性 ； 在 MA 培养基(Difco， 货号 ： 212185)上形成淡黄色菌落， 菌落为圆形 ； 其DNA基因组的G+C含量是 60.1mol。 3. 根据权利要求书 1 所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌， 其特征在于中度嗜盐的 无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.)NaCl 生长耐受范围为 0.5-15 (w/v)。 4. 根据权利要求书 1 所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌， 其特征在于中度嗜盐的 无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.) 能在 pH 值为 4-9 的环境中生长。 5. 根据。

5、权利要求书 1 所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌， 其特征在于 ： 从斜面 挑取中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.) 菌落接种于装有 100ml A 液体培 养基的 250ml 三角瓶中， 接种量为 105cfu/ml ； 28、 150rpm/m 震荡培养 10 天后， 将菌液 8000rpm/m 离心 10min， 取上清夜， 利用钼蓝比色法测定上清夜的有效磷含量， 有效磷含量 超过 280mg/l ； 对上清夜进行 pH 值测定， pH 值为 5 ； 所 述 的 A 培 养 基 为 ： 葡 萄 糖 10g， (NH4)2SO40.5g， MgSO47H2O 0。

6、.3g， KCl 0.3g， FeSO47H2O0.036g， MnSO47H2O 0.03g， Ca3(PO4)2 12.0g， NaCl 30g， 去离子水 1000ml， pH 值 7.8， 在 115灭菌 30min。 权 利 要 求 书 CN 102051340 A CN 102051346 A1/4 页 3 一种中度嗜盐的无机解磷功能菌 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物。 背景技术 0002 滨海盐土是我国重要土地资源的一部分。我国有长约 3000km 的海岸线， 估计在 15 米等深线内的浅海与滩涂有 2.1 亿亩， 其中长江口以北的江苏、 山东、 河北、 辽宁诸省滨 海。

7、盐土面积就达 1500 万亩， 滩涂面积则难估计。另外， 由于气候等原因， 这些数字每年还在 增加， 比如仅十几年来， 黄河河口年平均推进速度为 2.77km， 年平均造陆面积为 46.33 平方 公里， 即年增 6.95 万亩土地。与此相对， 从 1998 年到 2007 年， 我国耕地面积从 19.45 亿亩 下降至 18.26 亿亩， 随着人口的不断增长， 人口对土地的压力将进一步增大。开发和利用沿 海滩涂等盐土对于我们缓解人口对耕地的压力提供了一个可行的方向， 也是我国农业生产 中十分迫切和重要的任务。滨海盐土的特征是整个土体盐分含量高， 盐分组成以氯化物为 主， 且 pH 高， 可溶。

8、性磷酸盐含量低， 绝大部分以难溶性磷酸盐的形式存在。而在滨海盐土的 改造利用中， 虽然耐盐作物可以被引入和培养生长， 但由于滨海盐土的高含盐量、 高 pH 值、 有效 N/P 和有机质含量低等特性严重影响作物生长和种子萌发率， 最终导致作物产量低， 生态改造效果不明显， 经济效益不显著。目前提高土壤中磷的有效性促进植物高产的技术 主要是施加磷肥， 但实践表明施入土壤中的磷有 75-90很快与土壤中的钙等结合， 形成难 溶性的磷酸盐， 积累在土壤中， 致使磷肥的利用率较低， 而化肥的过度投入又会加重土地板 结， 对滨海系统造成面源污染， 影响整个系统的可持续发展。 0003 事实上， 大部分滨海。

9、盐土缺磷是 “遗传学缺磷” 而非 “土壤学缺磷” ， 其中潜在的磷 库含量很大， 但提供作物生长发育的磷流却很小。如何挖掘滨海盐土潜在磷库资源， 发展 生态型农业生产， 是国家区域农业综合开发的重点和难点， 近十年来在这方面的研究受到 国家有关部门和农业科技界的高度重视。研究表明， 土壤磷素循环是以微生物活动为中心 的， 微生物的活动对磷的转化和有效性影响很大 ： 在微生物的生命活动将产生有机酸 ( 如 柠檬酸、 乳酸、 苹果酸等 )， 这些有机酸通过螯合土壤中的钙和降低 pH 使土壤中的磷酸钙不 稳定， 释放出磷， 这种解磷作用最终能够将土壤中难溶性的磷酸盐转化为水溶性有效磷， 从 而改善作。

10、物磷素营养状况， 促进作物的生长， 因此开展高效溶磷微生物的研究并加大该类 微生物肥料的应用， 对滨海盐土农业持续发展有重要的理论意义和实际意义。但在我国滨 海盐土农业生产中， 微生物肥料使用率不到20(发达国家达到50)， 究其原因主要是菌 种问题。目前市面上磷细菌肥料中的磷细菌多来源于陆源环境， 虽然在普通土壤环境中解 磷效果好， 但不适应滨海盐土的环境条件， 在滨海盐土中施用时， 菌种存活繁殖力低， 存活 时间短， 解磷效果不稳定。在这样的情况下， 本发明提供的菌种可以很好的在较广的 pH 值 和 NaCl 范围内适应生长， 并能明显降低培养环境的 pH 值， 增加有效磷的含量， 这使本。

11、发明 将会有很好的应用前景。 说 明 书 CN 102051340 A CN 102051346 A2/4 页 4 发明内容 0004 本发明的目的在于 ： 针对目前滨海盐土农业生产中缺乏有效磷细菌的问题， 而提 供一种能在高盐、 高 pH 值条件下活跃生长繁殖的无机解磷菌。 0005 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的 ： 0006 本发明通过以不同的盐度和无机磷培养基为富集条件， 从我国黄海近海沉积 物中取样， 分离筛选得到多株菌， 经过多级筛选， 获得一株中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.)。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心 (C。

12、GMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 保藏号为 CGMCC No.4212， 保藏日期为 2010 年 9 月 30 号。中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.) 通过 16S rDNA 基因序列比对分析与其最相近的种属是 Kushneria 属的 Kushneria aurantia(Genbank AM941746)， 同源性为 95， 因此该菌为被命名为 Kushneria sp.， 属于 Kushneria属， 为好养菌， 革兰氏阴性， 氧化酶阴性， 接触酶阳性 ； 在MA培养基(Difco， 货号 ： 212185) 上形成淡黄。

13、色菌落， 菌落为圆形 ； 其 DNA 基因组的 G+C 含量是 60.1mol ； 其 16S rDNA的Genbank登陆号为HQ284161。 该菌NaCl生长耐受范围为0.5-15(w/v) ； 该菌能在 pH 值为 4-9 的环境中生长。本发明从斜面挑取中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.) 菌落接种于装有 100ml A 液体培养基的 250ml 三角瓶中， 接种量为 105cfu/ml ； 28、 150rpm/m 震荡培养 10 天后， 将菌液 8000rpm/m 离心 10min， 取上清夜， 利用钼蓝比色法测 定上清夜的有效磷含量， 有效磷含量超过 2。

14、80mg/l ； 对上清夜进行 pH 值测定， pH 值为 5 ； 所述的 A 培养基为 ： 葡萄糖 10g， (NH4)2SO40.5g， MgSO47H2O 0.3g， KCl 0.3g， FeSO47H2O 0.036g， MnSO47H2O 0.03g， Ca3(PO4)2 12.0g， NaCl 30g， 去离子水 1000ml， pH 值 7.8， 在 115灭菌 30min。 0007 本发明的优点在于 ： 中度嗜盐的无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.)， 有较广的 pH 值 (4-9) 和 NaCl(0.5-15 )(w/v) 生长适应范围， 在生长繁殖中能明显。

15、降低培养环境的 pH 值， 增加培养环境有效磷含量。 附图说明 0008 图 1 为本发明所述菌株在无机磷细菌固体培养基上产生的透明圈 具体实施方式 0009 实施例 1 菌株的筛选纯化与保藏 0010 样品采集 ： 采样地点为中国黄海近海 (36.50N， 123.82E) 沉积物， 样品采集后， 装 入灭菌的封口聚乙烯袋中， 置于冰盒内带回实验室， -20保存。 0011 菌株筛选纯化 ： 将上述采集的样品， 取1g移入100ml灭菌海水中震荡均匀， 稀释成 不同的梯度10-3、 10-4和10-5， 从中取出100l以涂布法接种于高盐的无机磷细菌固体培养 基中， 每个梯度三个重复， 28。

16、， 72h 培养后挑选产生透明圈的阳性菌落进一步筛选和纯化 验证。 在纯化验证过程中， 培养条件为28培养7天， 选取能稳定产生较大透明圈的菌株进 一步纯化验证， 经过五次筛选， 获得了无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.)( 见图 1)。 0012 所述无机磷细菌固体培养基配方为 ： 葡萄糖 10g， (NH4)2SO4 0.5g， MgSO47H2O 0.3g， KCl 0.3g， FeSO47H2O 0.036g， MnSO47H2O 0.03g， Ca3(PO4)2 12.0g， NaCl 30g， 琼 说 明 书 CN 102051340 A CN 102051346 。

17、A3/4 页 5 脂 20g， 去离子水 1000ml， pH 值 7.8， 在 115灭菌 30min 倒平板， 冷却后备用。 0013 本实施例分离得到的无机解磷功能菌 YH8YH8(Kushneria sp.)， 属于 Kushneria 属。为好养菌， 革兰氏阴性， 氧化酶阴性， 接触酶阳性 ； 在 MA 2216 培养基 (Difco， 货 号 ： 212185) 上培养 2 天后形成淡黄色菌落， 菌落为圆形 ； 其 DNA 基因组的 G+C 含量是 60.1mol ； 其 16SrDNA 的 Genbank 登陆号为 HQ284161。 0014 菌株保藏 ： 该菌已经于 2010。

18、 年 9 月 30 号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生 物研究所， 保藏号为 CGMCC No.4212。在实验室中， 该菌株长期保藏方式为将菌株加入含 30甘油的MB 2216培养基(Difco， 货号 ： 279110)培养基中， 在-80保存 ； 短期保藏方式 为将菌株接种在 MA 2216 培养基斜面上， 在 4保存备用。 0015 实施例 2 无机解磷功能菌 YH8 盐度及 pH 值生长耐受性试验 0016 一、 盐度生长耐受性试验 0017 盐度梯度培养基配置 ： 以无盐LB培养。

19、基为基础培养基， 向其中补充NaCl得到盐度 分别为 0， 0.5， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0， 6.0， 8.0， 10.0， 12.0， 15.0， 20.0， 25.0 及 30.0 (w/ v) 的一系列盐度梯度培养基， pH 值 7.8， 在 115灭菌 30min 后冷却备用。 0018 所述无盐 LB 培养基配方为 ： 蛋白胨 10g， 酵母膏 5g， 蒸馏水 1000ml， pH 值 7.4-7.8 0019 将无机解磷功能菌 YH8 以 105cfu/ml 浓度接种于盐度梯度培养基， 每个梯度设三 个重复， 接种后在 28条件下振荡培养 10d， 记录菌。

20、株生长情况， 菌株 YH8 在 NaCl 浓度为 0.5， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0， 6.0， 8.0， 10.0， 12.0， 15.0 (w/v) 的培养条件下可以生长。 0020 二、 pH 值生长耐受性试验 0021 pH 值梯度培养基配置 ： 以 MB 2216 培养基为基础培养基， 向其中加 5M NaOH 或 2M HCl溶液调整其pH值得到pH值分别为3.0， 4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， 10.0的一系列盐度 梯度培养基， 在 115灭菌 30min 后冷却备用 0022 将无机解磷功能菌 YH8 以 105cfu/ml 。

21、浓度接种于 pH 值梯度培养基， 每个梯度设三 个重复， 接种后在 28条件下振荡培养 10d， 记录菌株生长情况， 菌株 YH8 在 pH 值为 4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0 的培养条件下可以生长。 0023 实验结果表明 ： 无机解磷功能菌 YH8 有较广的 pH 值和 NaCl 生长适应范围， 该菌 NaCl 生长耐受范围为 0.5-15 (w/v) ； 该菌能在 pH 值为 4-9 的环境中生长。 0024 实施例 3 无机解磷功能菌 YH8 解磷能力测定 0025 一、 制备无机解磷功能菌 YH8 解磷发酵液 0026 本实施案例分实验组和空白对照组。 0。

22、027 实验组 ： 将无机解磷功能菌 YH8(Kushneria sp.) 以 105cfu/ml 浓度接种于装有 100ml 无机磷细菌解磷液体培养基的 250ml 三角瓶中， 设三个重复， 28、 150rpm/m 震荡培 养 10 天 得到解磷发酵液。用奥立龙 MODEL818 型 pH 计测定发酵液 pH 值。 0028 空白对照组 ： 对照中不接种无机解磷功能菌 YH8。 0029 无机磷细菌解磷液体培养基配置 ： 葡萄糖 10g， (NH4)2SO4 0.5g， MgSO47H2O 0.3g， KCl0.3g， FeSO47H2O 0.036g， MnSO47H2O 0.03g， 。

23、Ca3(PO4)2 12.0g， NaCl 30g， 去离子水 1000ml， pH 值 7.8， 在 115灭菌 30min 冷却后备用。 0030 二、 有效磷测定 说 明 书 CN 102051340 A CN 102051346 A4/4 页 6 0031 有效磷测定采用钼蓝比色法测定 0032 1) 标准曲线制作 ： 分别取标准溶液 0、 1、 2、 3、 5mL， 用蒸馏水稀释到 10ml， 然后加 入 200uL 的抗坏血酸溶液混匀后放置 15min， 加入 200uL 的混合溶液混匀， 20min 后测定 OD800nm 值。 0033 2) 解磷发酵液有效磷测定 ： 将上述解。

24、磷发酵液 8000rpm/m 离心 10min， 取上清夜 20uL稀释到10ml， 然后加入200uL的抗坏血酸溶液混匀后放置15min， 加入200uL的混合溶 液混匀， 20min 后测定 OD800nm 值。 0034 标准溶液 ： 配 100mmol/L 的 KH2PO4母液， 使用液浓度为 100umol/L。 0035 抗坏血酸溶液 ： 10 克溶于 100mL 水中。 0036 混合溶液 ： 22.5mL 钼酸铵溶液加 2.5mL 酒石酸锑钾， 然后用 6mol/L 的硫酸定容至 100ml。 0037 钼酸铵溶液 ： 10 克溶于 100mL 水中。 0038 酒石酸锑钾 ： 6 克溶于 200mL 水中。 0039 测定结果表明， 实验组发酵液 pH 从初始 7.8 下降到 5.0， 有效磷含量超过 280mg/ l ； 空白对照组中 pH 维持 7.8， 有效磷含量为 1mg/l。 说 明 书 CN 102051340 A CN 102051346 A1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102051340 A 。