技术领域
本发明属于工业真菌技术领域，具体设计一种高产甾体发酵黑根霉菌株及其甾体化合物发酵的应用技术。
背景技术
1甾体化合物C11α-羟化微生物发酵。
甾体化合物是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物，由于母核上取代基、
双键位置或立体构型的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。
羟化反应是甾体微生物转化中最重要的反应，C11羟基对于甾体药物的抗炎活性起到积极的作用。微生物能在甾体的任何位置进行羟基化反应。化学方法除了较易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入。自1952年美国普强（Upjohn）药厂Peterson和Murry最早发现黑根霉（Rhizopus nigricans）对甾体具有C11α-羟化反应后，我国黄鸣龙教授等于1958年用黑根霉使16a，17a-环氧黄体酮氧化引入C11-a羟基，从而研究成功从薯蓣皂素合成可的松的七步法路线，并一直沿用至今。
目前，工业上用于甾体C11α-羟化转化反应的微生物主要有黑根霉（Rhizopus nigricans Ehrenb.）、赭曲霉（Aspergillusochraceus）以及绿僵菌（Metarhiziumspp.）等。对于甾体C11α-羟化反应，工业上依然大量使用黑根霉，因为黑根霉性状稳定，发酵杂质少，单杂含量低，发酵技术成熟，转化率和得率也较稳定。而经过多年选育后的黑根霉，通过投料方式等方面改进，在转化率上比以往提高了1倍，相比其他C11α-羟化反应菌种，转化率过低的劣势得到了改善。依靠菌种选育手段的不断更新，黑根霉在甾体C11α-羟化反应中，还将扮演重要角色。
2黑根霉的分类地位及利用现状。
黑根霉（Rhizopusnigricans）属于真菌界（Fungi），接合菌门（Zygomycota），毛霉目（Mucorales），根霉科（Rhizopodaceae）。
在用本菌株催化底物沃氏氧化物进行11α-羟基化反应，葡萄糖与糊精作为培养基碳源时的转化率较高。其中，葡萄糖较易被微生物利用并转化成菌体生长所需的能量和碳成分，且价廉易得，广泛应用于微生物实验和工业化生产．因此，选用葡萄糖为最佳碳源。
通常黑根霉在15～35℃条件下都能生长，其中以25～30℃为最适生长温度。菌丝生长和孢子形成的最适温度为28～30oC。黑根霉生长发育要求空气相对湿度在90％以上。孢子的存活受物理和化学因素的影响。
发明内容
本发明目的是提供一种黑根霉新菌株，其生产霉菌氧化物具有转化率高、收率高，而且生物学性状比较稳定等特点，可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。
本发明的另一目的是提供所述黑根霉新菌株的在以沃氏氧化物为底物制备霉菌氧化物中的应用。
本发明的再一目的是提供所述黑根霉新菌株在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法。
实现本发明上述目的采取的技术方案是：所述黑根霉菌株属于真菌界，接合菌门，毛霉目（Mucorales），根霉科，，菌种保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏时间为2013年06月08日，保藏号为：CGMCC No.7687。
该所述的黑根霉菌株CGMCC No.7687在以沃氏氧化物为底物制备霉菌氧化物中进行应用。
本发明所述生产霉菌氧化物的方法包括以下步骤：
⑴原种复活：在原种生长温度条件下，在酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并出现大量黑色分生孢子；
⑵制备菌悬液：取无菌水倒入培养好的试管斜面中，用接种针搅拌打下气生菌丝上的孢子制备成菌悬液，再取菌悬液稀释后，涂布在酵母膏琼脂培养基平板上，在生长温度条件下培养；
⑶制备试管斜面：在培养的酵母膏琼脂培养基平板上选择单个菌落接种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上，在生长温度条件下培养；
⑷制备种子液：将试管斜面培养的菌种制备成菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在生长温度条件下，在摇床上培养，获得种子液；
⑸投料发酵：投入沃氏氧化物到种子液中摇瓶发酵培养，在菌种生长条件下，培养得到发酵液；
⑹结果检测：将每个摇瓶的发酵液经“煮沸-抽滤-粉碎-加入丙酮蒸发-回流-再抽滤-浓缩-结晶”程序后，将结晶物抽滤得到粗制品和母液，将粗制品烘干称取粗制品重量，根据投料量计算粗制品收率和转化率；
⑺选取生产菌株：在收率100%、转化率65%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管或者牛奶冻干管原种在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于甾体发酵生产；
⑻传代培养：在生长温度条件下，将选取的生产菌株接入酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并产生黑色分生孢子；
⑼培养生产母种：将煮熟的小米盛入克氏瓶并灭菌冷却后，然后将传代培养后的斜面菌种制备成菌悬液后接入克氏瓶小米培养基中培养，使得气生菌丝长满克氏瓶并产生大量黑色孢子；
⑽培养生产种子液：将生产母种接入30T发酵罐中，培养基与摇瓶培养液相同，在生长温度条件下培养，取样镜检确定没有被污染并且菌丝均匀、pH值在3.5以下，菌丝体体积在95%以上后即可压入底物溶液进行转化；
⑾底物溶液制备：溶解罐中加入水，将沃氏氧化物投入其中，再加入洗衣粉，密闭后先升温，然后降温得到底物溶液备用；
⑿投底物发酵：压入沃氏氧化物底物溶液，在生长温度下发酵培养后用氨水调节ph值，然后根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间；
⒀压滤：在发酵达到终止条件后对发酵罐内发酵液进行升温灭活，再降温后进行压滤，取滤饼打粉后备用；
⒁滤饼粉提取：将滤饼粉投入提取罐，加入丙酮，升温后回流，然后压滤至浓缩罐进行浓缩，再打入丙酮循环回流、提取，直至滤饼提取干净；
⒂粗制品浓缩：将上步的提取液浓缩至粥状物，加入NaOH和工艺用水，回收水丙酮；
⒃粗制品离心：将上步溶液置入离心机离心甩干，用工艺用水洗涤至中性并用蒸汽进行除油；同时回收母液；
⒄粗制品烘干：将上述粗制品放入烘箱，烘烤获得粗制品；
⒅精制品：将粗制品投入精制罐，加入甲苯升温，保温，再降温后压滤，加入甲苯和三氯甲烷搅拌升温浓缩，分步回收三氯甲烷和甲苯，以同样方式反复回收，然后取样检测合格后离心并回收母液，离心物烘干后即得霉菌氧化物精品。
本发明的黑根霉新菌株生物学特征如下。
菌株形态特征：匍匐菌丝弓状弯曲，在与基质相接触处产生假根；假根发达，分枝多，褐色，两节间距离1～3mm，孢囊梗直立不分枝，1～10枝丛生于假根上，淡褐色，250～4000×24～42mm，孢子囊球形至椭圆形，褐色至黑色，直径65～300mm，膜上具有小结晶，易消融；囊轴球形至椭圆形，膜薄平滑，淡褐色，直径70mm，高90mm，具中轴基，直径23～210mm；孢子形状不对称，近球形至多角形，表面具线纹，似蜜枣状，大小5.0～14.0×7.0～8.0mm，褐色至蓝灰色；接合孢子球形或卵形，直径150～210mm，黑色，具瘤状突起，配囊柄膨大，两个柄大小不一，拟接合孢子，无厚垣孢子。
菌株培养性状：在酵母膏琼脂培养基上菌落初期为白色丝状并快速生长。一般情况下，在15-30℃条件下，其菌丝体均可以生长。其最适生长温度范围为25-30℃，但是以28-30℃时其转化率最高。气生菌丝粗且均匀，分枝比较长，白色，培养成熟时长满培养器皿。培养3天之后，即可开始产接合孢子，5天之后气生菌丝便可长满整个培养皿。
本发明所述的黑根霉菌株以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法具体包括以下步骤：
1原种复活：在25～27℃温度条件下，将保存的原种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并生长大量黑色孢子；
2制备菌悬液：取无菌水倒入培养好的试管斜面中，用接种针搅拌打下气生菌丝上的孢子制备成菌悬液，再取菌悬液稀释后，涂布在直径为150mm的酵母膏琼脂培养基平板上，在25～27℃温度条件下培养；
3制备试管斜面：在培养的酵母膏琼脂培养基平板上选择单个菌落接种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上，在25～27℃温度条件下培养；
4制备种子液：将试管斜面培养的菌种制备成一定量的菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在27～28℃温度条件下，在摇床上以175～200转/分培养20～22h，获得种子液；
5投料发酵：按照1.5～2.0%的投料量投入沃氏氧化物到种子液中摇瓶发酵培养，在以上相同条件下，培养48h后得到发酵液；
6结果检测：将每个摇瓶的发酵液经“煮沸-抽滤-粉碎-加入丙酮蒸发-回流-再抽滤-浓缩-结晶”程序后，将结晶物抽滤得到粗制品和母液，将粗制品烘干称取粗制品重量，根据投料量计算粗制品收率和转化率；
7选取生产菌株：在收率100%、转化率65%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管或者牛奶冻干管原种在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于甾体发酵生产；
8传代培养：在25～27℃温度条件下，将选取的生产菌株接入酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养4～5天，直到气生菌丝长满斜面并产生黑色分生孢子；
9 培养生产母种：将煮熟的小米盛入克氏瓶并灭菌冷却后，然后将传代培养后的斜面菌种制备成菌悬液后接入克氏瓶小米培养基中，在25～27℃条件下培养5～6d，使得气生菌丝长满克氏瓶并产生大量黑色孢子；
10 培养生产种子液：将生产母种接入30T发酵罐中，培养基与摇瓶培养液相同，在27～28℃温度条件下培养21～23h，取样镜检确定没有被污染并且菌丝均匀、ph值在3.5以下，菌丝体体积在95%以上后即可压入底物溶液进行转化；
11 底物溶液制备：溶解罐中加入水，将沃氏氧化物投入其中，再加入洗衣粉，密闭后升温至121℃保温，然后降温至55摄氏度左右得到底物溶液备用；
12 投底物发酵：压入沃氏氧化物底物溶液，在27～29℃温度下发酵培养10h后用氨水调节ph值到4.0～4.5间，48～56h后根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间；
13 压滤：在发酵达到终止条件后对发酵罐内发酵液进行升温灭活至80℃后降温至55℃左右后进行压滤，取滤饼打粉后备用；
14 滤饼粉提取：将滤饼粉投入提取罐，加入菌丝体重量八倍体积的丙酮，升温至55～65℃后回流20min，然后压滤至浓缩罐进行浓缩，再打入丙酮循环回流、提取，直至滤饼提取干净；
15 粗制品浓缩：将上步的提取液浓缩至粥状物，加入NaOH和工艺用水，升温至95～105℃并维持1～2h回收水丙酮；
16 粗制品离心：将上步溶液置入离心机离心甩干，用工艺用水洗涤至中性并用蒸汽进行除油；同时回收母液；
17 粗制品烘干：将上述粗制品放入烘箱，烘烤获得粗制品；
18 精制品：将粗制品投入精制罐，加入粗品重量9倍体积的甲苯升温至90℃并保温10min，降温至35℃后压滤，反复三次后加入一倍甲苯和五倍三氯甲烷搅拌升温浓缩，80℃前回收三氯甲烷，80℃以后回收甲苯，剩一定量是再加同样的混合溶媒反复升温回收三次后取样检测合格后离心并回收母液，离心物烘干后即得霉菌氧化物精品。
本发明的有益效果是：生产的霉菌氧化物具有转化率高（50～60%）、收率高（86～89%），而且生物学性状比较稳定等特点。本发明可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。
附图说明
图1为本发明黑根霉甾体化合物微生物发酵生产流程图。
图2为本发明黑根霉发酵工艺流程图。
具体实施方式
实施例
黑根霉新菌株以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法。
一 原种复活：在25～27℃温度条件下，将保存的原种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并出现大量黑色分生孢子；
二 制备菌悬液：取无菌水倒入培养好的试管斜面中，用接种针搅拌打下气生菌丝上的孢子制备成菌悬液，再取菌悬液稀释后，涂布在直径为150mm的酵母膏琼脂培养基平板上，在25～27℃温度条件下培养；
三 制备试管斜面：在培养的酵母膏琼脂培养基平板上选择单个菌落接种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上，在25～27℃温度条件下培养；
四 制备种子液：将试管斜面培养的菌种制备成一定量的菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在27～28℃温度条件下，在摇床上以175～200转/分培养20～22h，获得种子液；
五 投料发酵：按照1.5～2.0%的投料量投入沃氏氧化物到种子液中摇瓶发酵培养，在以上相同条件下，培养48h后得到发酵液；
六 结果检测：将每个摇瓶的发酵液经“煮沸-抽滤-粉碎-加入丙酮蒸发-回流-再抽滤-浓缩-结晶”程序后，将结晶物抽滤得到粗制品和母液，将粗制品烘干称取粗制品重量，根据投料量计算粗制品收率和转化率；
七 选取生产菌株：在收率100%、转化率65%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管或者牛奶冻干管原种在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于甾体发酵生产；
八 传代培养：在25～27℃温度条件下，将选取的生产菌株接入酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养4～5天，直到气生菌丝长满斜面并产生黑色分生孢子；
九 培养生产母种：将煮熟的小米盛入克氏瓶并灭菌冷却后，然后将传代培养后的斜面菌种制备成菌悬液后接入克氏瓶小米培养基中，在25～27℃条件下培养5～6d，使得气生菌丝长满克氏瓶并产生大量黑色孢子；
十 培养生产种子液：将生产母种接入30T发酵罐中，培养基与摇瓶培养液相同，在27～28℃温度条件下培养21～23h，取样镜检确定没有被污染并且菌丝均匀、ph值在3.5以下，菌丝体体积在95%以上后即可压入底物溶液进行转化；
十一 底物溶液制备：溶解罐中加入水，将沃氏氧化物投入其中，再加入洗衣粉，密闭后升温至121℃保温，然后降温至55摄氏度左右得到底物溶液备用；
十二 投底物发酵：压入沃氏氧化物底物溶液，在27～29℃温度下发酵培养10h后用氨水调节ph值到4.0～4.5间，48～56h后根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间；
十三 压滤：在发酵达到终止条件后对发酵罐内发酵液进行升温灭活至80℃后降温至55℃左右后进行压滤，取滤饼打粉后备用；
十四 滤饼粉提取：将滤饼粉投入提取罐，加入菌丝体重量八倍体积的丙酮，升温至55～65℃后回流20min，然后压滤至浓缩罐进行浓缩，再打入丙酮循环回流、提取，直至滤饼提取干净；
十五 粗制品浓缩：将上步的提取液浓缩至粥状物，加入NaOH和工艺用水，升温至95～105℃并维持1～2h回收水丙酮；
十六 粗制品离心：将上步溶液置入离心机离心甩干，用工艺用水洗涤至中性并用蒸汽进行除油；同时回收母液；
十七 粗制品烘干：将上述粗制品放入烘箱，烘烤获得粗制品；
十八 精制品：将粗制品投入精制罐，加入粗品重量9倍体积的甲苯升温至90℃并保温10min，降温至35℃后压滤，反复三次后加入一倍甲苯和五倍三氯甲烷搅拌升温浓缩，80℃前回收三氯甲烷，80℃以后回收甲苯，剩一定量是再加同样的混合溶媒反复升温回收三次后取样检测合格后离心并回收母液，离心物烘干后即得霉菌氧化物精品。
对本发明提出的黑根霉菌株，就其菌株培养基、培养条件和摇床验证（对沃氏氧化物发酵转化为霉菌氧化物）整个过程，进行了4个实例验证：
实例1
在摇床转速175r/min，培养温度27℃，发酵时间40h的条件下,收率为100%，转化率为60.86%
实例2
在摇床转速185r/min，培养温度28℃，发酵时间48h的条件下,收率为105%，转化率为69.36%。
实例3
在摇床转速190r/min，培养温度29℃，发酵时间56h的条件下,收率为105%，转化率为67.74%。
实例4
在摇床转速200r/min，培养温度30℃，发酵时间60h的条件下,收率为100%，转化率为64.67%。
其结果表明：在培养基和培养条件（摇床转速、培养温度和培养时间）做相应变动的条件下，黑根霉菌株对沃氏氧化物的转化率和霉菌氧化物的收率分别稳定在100～105%和60～70%之间，说明本发明提出的黑根霉新型菌株具有优良的性状；而且其在大型生产规模上该菌株也具有较高的转化率和收率，其沃氏氧化物转化率为50～60%，霉菌氧化物（精品）收率为86～89%。