技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法。
背景技术
基因组印记是一种表观遗传现象，印记基因具有单等位表达和亲本特异性。通过每个染 色体的印记可以对其亲本来源进行判断。然而印记标记的机制研究表明，DNA甲基化在基因 组印记现象中起重要作用，因此甲基化动态和印记机制成为研究热点。大部分印记基因成簇 存在，绝缘子调控模型或长链非编码RNAs调控模型对其表达进行调控。越来越多的证据表 明DNA甲基化不仅仅与印记基因表达相关，同时，印记基因的表达调控还与翻译后组蛋白 修饰有关。
目前，对基因组印记的研究主要集中在人和鼠中，而在家畜，特别是猪上的研究较少。 因此在猪上鉴定印记基因对于基因组印记在物种间的保守性研究具有重要意义。此外，家畜 大多数印记基因是调控生长发育的主效基因，这些基因对胚胎早期发育、出生后的生长速度、 产肉量、瘦肉率、饲料效率等数量性状有极大影响。基于印记基因在生长和发育中的重要调 控作用，鉴定出新的猪印记基因是一个值得探讨的新课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种效果理想、成本低、操作简便的家猪印记基因 Rasgrf1的鉴定方法。
(1)采用PCR-SSCP-PAGE的方法查找Rasgrf1基因外显子序列SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)：
I.提取皖南黑猪和巴克夏猪的DNA，进行Rasgrf1基因外显子1和外显子14部分序 列的克隆；
II.PCR-SSCP方法分型；
III.不同基因型个体PCR产物的纯化、克隆和测序。
(2)总RNA的提取和cDNA的制备：
I.正反杂交模型的建立：正交：巴克夏猪♂×皖南黑猪♀；反交：皖南黑猪♂×巴克夏猪 ♀；巴克夏猪♂与皖南黑猪♀交配产生的F1代仔猪为正交F1，皖南黑猪♂与巴克夏猪♀交配产 生的F1代仔猪为反交F1；
II.SNP位点杂合个体的筛查：出生1日龄的正反交F1代仔猪各8头，分别提取各亲本 以及F1代仔猪个体的基因组DNA，用于杂合子鉴定；采用PCR-RFLP方法，基于步骤(1) 查找到的SNP位点，该SNP位点处杂合基因型的个体为F1代杂合子仔猪个体；
III.总RNA的提取和cDNA的制备：提取F1代1日龄正反交仔猪各8头以及杂合子仔 猪7头的14种不同组织的RNA，反转录成cDNA；7头杂合子仔猪中包括正交3头，反交4 头；14种不同组织为脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、 小肠、背最长肌和垂体；
(3)采用RT-PCR-RFLP方法鉴定印记状态
I.RT-PCR-RFLP鉴定印记状态：
取F1代1日龄正交3头、反交4头杂合子仔猪的14种不同组织cDNA，利用锚定引物 进行RT-PCR；采用RT-PCR-RFLP方法检测杂合子仔猪各组织器官mRNA酶消化带型，并根 据其亲本的基因型判断Rasgrf1基因在特定阶段和组织是父系印记还是母系印记或者不存在 印记；所述锚定引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
II.q-RT-PCR
取F1代1日龄正反交仔猪各8头的14种不同组织cDNA，利用锚定引物进行q-RT-PCR， 检测Rasgrf1基因在14个组织，即脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、 睾丸、子宫、小肠、背最长肌和垂体的mRNA表达水平；所述锚定引物对应的核苷酸序列如 序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
(4)目的基因蛋白水平的检测
取F1代1日龄正交3头、反交4头杂合子仔猪，选取其Rasgrf1基因双等位基因表达的 两种组织心和脾，单等位基因表达的两种组织肝和小肠进行Rasgrf1基因编码的蛋白质分布 的研究，包括石蜡组织切片的制作和免疫荧光观察两大步骤；
(5)亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析方法
通过对猪Rasgrf1基因启动子活性的分析，预测核心启动子区和该片段内CTCF结合区 域，经软件预测确定此两区域GpG岛的分布情况；样品经过亚硫酸盐处理后，通过设计特异 性引物对其进行PCR扩增，而后测序进行基因甲基化程度分析。
本发明所述的家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法，其中，步骤(4)中石蜡组织切片的制 作具体包括如下步骤：
(1)固定：脾在新鲜配制的Bouin溶液中固定24h，其他组织在10％中性甲醛固定液固 定24h；
(2)脱水：使用浓度逐级升高的梯度乙醇依次脱水，30％→50％→60％→70％→80％→ 90％→95％Ⅰ、Ⅱ→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，各60min；
(3)透明：体积比为1︰1二甲苯无水乙醇混合液20min→二甲苯Ι、Ⅱ，各10min；
(4)浸蜡：体积比为1︰1二甲苯石蜡混合液1h→石蜡Ⅰ、Ⅱ，各1h；
(5)包埋：将溶化的石蜡倒入包埋盒内，用镊子将浸蜡彻底的组织块放入，蜡块大小满足 切片需要、便于切片机固定和切片；
(6)切片：组织块制成蜡块，稳固置于切片机上即可开始切片，厚度为6μm；
(7)展片：展片温度控制在43℃以下；
免疫荧光：
(1)烤片温度为60℃，2-8h；
(2)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各15min；
(3)梯度酒精复水：100％酒精Ⅰ、Ⅱ各10min→95％酒精Ⅰ、Ⅱ各10min→80％酒精5 min→70％酒精5min→50％酒精5min→蒸馏水3min×2次→PBS 5min；
(4)抗原修复：切片置于枸橼酸修复液中，100％火力3min至微微沸腾→50％火力维持7 min→停止加热自然冷却30min；
(5)封闭：PBS 3min，滤纸擦去标本外的PBS→滴加封闭血清1％BSA→湿盒中37℃封闭 30min→滤纸擦去封闭液；
(6)一抗：滴加200μL体积比为1:100稀释的兔抗人Rasgrf1蛋白多克隆抗体，4℃孵育过 夜→PBS 3min×5次洗去一抗，滤纸擦去标本外的PBS；
(7)二抗：滴加200μL体积比为1:100稀释的荧光标记山羊抗兔IgG，室温孵育1h→PBS 3 min×5次洗去二抗，滤纸擦去标本外的PBS；
(8)染核：滴加PI避光孵育8min→PBS3min×3次洗去PI，滤纸擦去标本外的PBS；
(9)甘油封片，立即在共聚焦显微镜下观察。
本发明所述的家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法，其中，步骤(5)中甲基化分析方法具 体包括如下步骤：
DNA修饰(根据Milli-pore甲基化试剂盒说明书)，具体步骤如下：
(1)DNA修饰：
100μL含1.0μg DNA溶液中加入7.0μL 3mol/L的氢氧化钠，充分混匀；50℃孵育DNA10 min后加550μL现配的DNA修饰试剂Ⅰ，涡旋；50℃避光孵育16h；
(2)首次脱盐
在DNA溶液中加入5μL充分涡旋重悬DNA修饰试剂Ⅲ，再加入750μL DNA修饰试剂 Ⅱ，混匀；室温孵育10min，5000g离心10s，弃上清；加1.0mL70％乙醇，涡旋，5000g离 心10s，弃上清，重复三次；第三次弃上清后，高速离心2min，吸去上清；
(3)第二次脱盐
在上述沉淀中加入50μL 20mmol/L NaOH/90％乙醇，涡旋重悬颗粒于室温孵育5min； 5000g离心10s，收集内容物于管底；加1.0ml 90％乙醇，涡旋洗涤颗粒，离心，弃上清，重 复一次；第二次洗涤，弃上清后高速离心3min，吸净上清，室温干燥20min；加TE缓冲液， 50-60℃孵育样品15min，洗脱DNA，高速离心3min，将上清转入新的PCR管，分装-20℃ 保存；
甲基化特异性PCR引物设计：
通过甲基化预测网站(www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)预测猪Rasgrf1基因上游2kb左右 区域的CpG岛的分布情况，用甲基化在线软件MethPrimer设计引物；
所述引物包括用于Rasgrf1启动子区甲基化分析的引物和CTCF结合区域甲基化分析的 引物；所述用于Rasgrf1启动子部分甲基化分析的引物为DNA修饰前引物、岛1引物、岛2 引物和岛3引物，所述DNA修饰前引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述岛1引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；所 述岛2引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述岛3引物的 核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述CTCF结合区域甲基化分 析引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
结果判定：
以预测的GpG岛区域为模板的PCR扩增片段连接载体进行测序，结果与DNA修饰前特 异性引物扩增的片段进行对比确定GpG岛的分布情况，进而得出该序列甲基化程度。
本发明家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法与现有技术不同之处在于：
本发明所述为一种家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法。在猪上鉴定出更多调控生长性状 的印记基因对家畜印记基因功能、机制和比较不同物种间基因组印记规律等相关研究是非常 重要的，且对猪遗传育种工作具有重大指导意义。本发明通过在亲缘关系较远的猪(巴克夏 猪、皖南黑猪)筛查Rasgrf1基因的多态性，检测到其14外显子部分序列中存在一个SNP位 点。因此，以巴克夏猪♂×皖南黑猪♀以及皖南黑猪♂×巴克夏猪♀杂交产生的F1代仔猪为研 究对象，分析Rasgrf1基因在1日龄杂合子仔猪14种组织器官的印记表达规律，并对该基因 印记表达的组织特异性进行印记机制的初步探讨，取得的系列研究结果可为皖南黑猪优良性 状的开发和利用提供理论依据。其中，巴克夏猪为西方品种，皖南黑猪为我国安徽省本土品 种，两个品种亲缘关系比较远，容易找到SNP位点；且正、反杂交模型有效地避免了基因在 单个品种上表达的差异性；RT-PCR-RFLP方法结合测序检测基因的印记状态高效、方便、可 行。本发明采用正、反交的表型差异结合SNP的表达分析方法，能够对本土家猪Rasgrf1基 因的印记表达状态做出准确和快速的鉴定。
下面结合附图对本发明的家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法作进一步说明。
附图说明
图1为扩增出的目的片段1.2％琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为DNA marker，泳道1和泳 道2为引物Exon1F/Exon1R扩增的特异性片段(193bp)；泳道3-6为引物Exon 14F/Exon14R 扩增的特异性片段(228bp)；
图2为引物Exon 14F/Exon14R以不同基因组为模板扩增的目的片段在12％非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳图；泳道1-7、9、10、13和14为同一种带型，泳道8、11和12同一种带型；
图3为引物Exon 1F/Exon1R以不同基因组为模板扩增的目的片段在12％非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳图；泳道1-13带型一致；
图4为引物Exon 14F/Exon14R以皖南黑猪样本为模板扩增的目的片段测序峰图；
图5为引物Exon 14F/exon14R以巴克夏猪样本为模板扩增的目的片段测序峰图；比较图 4和图5，存在一个SNP位点(g.84709G/A)，箭头表示；
图6为引物Exon 14F/Exon14R以皖南黑猪DNA为模板扩增的序列与以巴克夏猪DNA为 模板扩增的序列比对结果；第14外显子中存在g.84709G/A SNP位点，氨基酸序列显示该SNP 为同义突变；
图7为猪RASGRF1基因PCR-RFLP图；M为DNA marker(从上到下分别为500、400、 300、200、150、100、75、50和25bp)，GG，AA和AG代表不同的基因型
图8为猪Rasgrf1等位基因特异性表达图谱；限制性内切酶Vpak11AI消化结果显示，正 交(a)和反交(b)产生的F1杂合仔猪中，该基因在猪的肝和小肠优先表达母源等位基因(泳道13 和14)，在肺中优先表达父源等位基因，在其他11个组织器官中双等位基因表达；泳道1 为DNA marker；泳道2-15依次为1日龄杂合子仔猪背最长肌、心脏、脾脏、胃、胰脏、背 膘、脑、肾脏、垂体、子宫、睾丸、肝脏、小肠、肺脏共14个组织器官的cDNA样品为模板 的特异性PCR产物；泳道16、17和18分别依次为杂合子仔猪以及其父本、母本DNA样品 为模板的特异性PCR产物；
图9为荧光定量PCR检测Rasgrf1mRNA在组织中的表达水平；纵坐标为猪Rasgrf1基因 相对表达量，横坐标为该基因表达检测部位依次为背最长肌、心脏、脾脏、胃、胰脏、背膘、 脑、肾、垂体、子宫、睾丸、肝、小肠、肺；灰色柱表示巴克夏和皖南黑猪正交F1代仔猪各 组织器官；黑色柱代表巴克夏和皖南黑猪反交F1代仔猪各组织器官；相对表达以mean±SEM (n＝3)表示，*表示正反交同一组织器官Rasgrf1mRNA表达存在显著差异(P<0.05)，不同字母 表示同一杂交模式后代不同组织器官Rasgrf1mRNA表达存在显著差异(P<0.05)；
图10为扩增的猪Rasgrf1基因5’端上游1283bp核苷酸序列中存在三个CpG岛分别为岛 1、岛2和岛3；
图11为预测的猪Rasgrf1基因5’端上游启动子区CpG岛和Rasgrf1与mir-184基因间区 CTCF均显示为低甲基化状态。
附图中的中英文对照：
longissimus dorsi：背最长肌
heart：心脏
spleen：脾脏
stomach：胃
pancreas：胰脏
backfat:背膘
brain:脑
kidney:肾
pituitary:垂体
ovary:子宫
testis:睾丸
liver:肝
small intestine:小肠
lung:肺
relative expression of porcine Rasgrf1:猪Rasgrf1基因相对表达量
percentage:百分含量
synonymous：同义的
heterozygous pigs:杂合子仔猪
Father:父本
Mother:母本
Berkshire boar×Wannan black sow F1:巴克夏公猪×皖南黑猪母猪杂交1代
Wannan black boar×Berkshire sow F1:皖南黑猪公猪×巴克夏母猪杂交1代
具体实施方式
一、材料与方法
1、试验材料、仪器与试剂
(1)用于分离基因、克隆启动子和寻找SNP的样品
DNA样品由皖南黑猪(n＝30)、巴克夏猪(n＝30)耳组织中提取，所有猪由安徽丰润生态农 业开发有限公司提供，样品均在本实验室提取，-20℃保存备用。
(2)用于印记和甲基化状态分析的样品
经产的体重相近(100kg左右)的巴克夏猪♀4头、皖南黑猪♀4头，成年巴克夏猪♂、皖南 黑猪♂各1头。前腔静脉采血，枸橼酸钠抗凝，于-20℃保存备用。
出生1日龄的正交F1(巴克夏猪♂与皖南黑猪♀交配产生的F1为正交F1。)和反交F1 (皖南黑猪♂与巴克夏猪♀交配产生的F1为反交F1)各8头。分别提取各亲本以及F1个体 的基因组DNA，用于杂合子鉴定。
7头F1代1日龄杂合子仔猪(正交3头、反交4头)的14种组织(脑、心脏、肝脏、脾脏、 肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小肠、背最长肌和垂体)采集完立刻放于液氮罐 中，之后-80℃保存备用，用于RNA和DNA提取，完成印记鉴定及甲基化分析。
(3)用于研究基因mRNA表达的样品和组织学研究的样品
F1代1日龄正反交仔猪各8头以及杂合子仔猪7头(正交3头、反交4头)，处死，解剖， 立即取14种组织(脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小 肠、背最长肌和垂体)，生理盐水冲洗表面血液，切成合适大小组织块装入2ml冻存管立刻放 于液氮罐中，-80℃保存；切取适当大小的组织做石蜡组织切片，10％中性甲醛或Bouin溶液 常规固定。
(4)主要试剂
表1 本试验用到的主要试剂
(5)主要实验设备
MDF-U382E超低温冰箱(三洋，日)，高速冷冻离心机(sigma，德)，凝胶成像仪与伯乐凝 胶成像分析系统(伯乐，美)，NANODROP核酸蛋白测定仪(Thermo Fisher，美)，梯度PCR仪 (伯乐，美)，荧光定量PCR仪(Corbett Research，澳大利亚)，水平电泳仪(北京市六一仪器厂)， RM2235石蜡组织切片机(莱卡，德)，FV1000激光共聚焦显微镜(奥林巴斯，日)，超净工作 台SW-CJ-2F(苏净集团)，2.5μL微量移液器、10μL、20μL微量移液器(Eppendorf，德)； 微波炉(中国格兰仕公司)；以及国产的震荡器、水浴锅、摇床等。
(6)常用试剂及配制
核酸抽提：
5×TBE的配方：54gTriss碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，加蒸馏水至1000ml， 室温保存待用，用时稀释10倍即成0.5×TBE。
50×TAE：700mL双蒸水中242g Tris碱，加入57.l mL冰乙酸、100mL 0.5mol/L EDTA(PH8.0)，加水定容至1000mL，室温保存，用时稀释100倍即成0.5×TBE。
STE缓冲液：在800mL蒸馏水中溶解2.925g NaCl、1M Tris.Cl 25mL、0.5M EDTA(pH8.0)5ml、加水定容至500mL。
稀释嗅化乙锭EB(10mg/mL)：1g EB溶于100mL双蒸水中，充分搅拌至溶解，放入棕 色试剂瓶，避光保存。
PBS缓冲液：称取4g的NaCl、0.72g的Na2HPO4、0.12g的KH2PO4和0.1g的 KCl溶解于500mL烧杯中，溶解过程要边搅拌边溶解，同时添加HCl溶液将pH调到 7.4，随后将pH调到7.4的溶液倒入500mL的容量瓶中，添加超纯水定容。最后放入压力 蒸汽灭菌器中进行高压灭菌，灭菌完成后置于常温保存。
抗凝剂ACD：取1.47g葡萄糖、1.32g柠檬酸钠和0.48g柠檬酸全部倒入烧杯里，将 混合物倒入100mL的容量瓶中，超纯水定容。高压灭菌备用。
基因克隆：
LB液体培养基：分别称取所需量的胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g和NaCl 10g，置于 烧杯中，加入1.2L蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化，用1mol/L NaOH溶液 调pH至7.2，加蒸馏水至2L，最后高压灭菌备用。
LB固体培养基：按每100mlLB液体培养基加入1.5g琼脂粉的比例，加入琼脂粉，高压 灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时(手可触摸) 加入抗生素，培养基倒入培养皿，打开盖子，在紫外下照10-15min，用封口胶封边，并倒置 放于4℃保存，一个月内使用。
Amp(氨苄青霉素)的稀释：称取5g Ampicillin置于50ml塑料离心管中。加入40ml灭菌 水，充分混合溶解之后定容至50mL，0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装(1mL/管)后，置于－ 20℃保存。
CaCl2溶液(0.L mol/L)：每1.l g CaCL2(无水、分析纯)加入100mL蒸馏水，灭菌后待用。
SSCP-PAGE
10％过硫酸胺：把0.15g过硫酸胺溶解于终量为1.5ml的水溶液中，该溶液可在4℃ 保存数周。
30％聚丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g N,N′-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为70mL的 水中，加热至37℃溶解之后，补加水至终体积为100mL。用滤器(0.45mm孔径)过滤除菌， 置棕色瓶中保存于室温。
变性加样缓冲液：在98％的去离子甲酰胺中加入EDTA(pH 8.0)至终浓度10mM，0.025％ 溴酚兰、0.025％二甲苯菁FF。
20％硝酸银溶液：20g硝酸银溶于100mL双蒸水，置于棕色瓶中，室温保存。
DNA修饰试剂
3mol/L氢氧化钠：准确称取氢氧化钠3g，完全溶于一定量的蒸馏水中，摇匀，然后继 续加水至25ml刻度处。
20mmol/L NaOH/90％乙醇：90mL乙醇中加入9.34mL H2O再加入660μL 3mol/L氢氧 化钠。
溶解试剂Ⅰ：室温溶化后打开，以每个样0.227g的比例称取试剂Ⅰ溶解于0.571mL蒸 馏水中，涡旋充分。以每个样20μL 3mol/L氢氧化钠的比例调pH至5.0。避光保存。
溶解试剂Ⅱ：室温溶化后打开，20mL蒸馏水中加入1μLβ-巯基乙醇配成溶解液。对于 每个样品，加750μL上述溶解液溶解1.35gDNA修饰试剂Ⅱ，充分混匀。2-8℃避光保存。
(7)所用引物
表2 本试验所用引物序列和PCR参数
(8)主要的生物信息学网站及分析软件
物种遗传信息查询http://asia.ensembl.org/index.html
查找相关物种SNPhttp://genewindow.nci.nih.gov/Welcome
蛋白编码http://www.jcat.de/Start.jsp
猪基因组比对网站http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat
基因结构预测http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/
关于鼠印记基因的网站http://www.mousebook.org/catalog.php？catalog＝imprinting
印记基因网站http://www.geneimprint.com/
印记基因网站http://igc.otago.ac.nz/home.htlm
甲基化引物设计在线软件MethPrimer http://www.urogene.org/methprimer/
Blast：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
CTCF预测网站http://insulatordb.uthsc.edu/storm_db1.0.php
设计普通引物、寻找酶切位点：primer premier5.0
查看测序图谱：Chromas
分析核酸序列：DNAstar5.01
进化关系：MEGA5.0
qPCR结果分析：Rotor-Gene Q Series Software
凝胶成像系统软件：Image Lab Version 3.0build 11
统计数据：SPSS19.0
2、试验方法
PCR-SSCP-PAGE查找SNP
耳组织基因组DNA的提取：
(1)取耳组织，放到70％乙醇，带回实验室-70℃保存备用。
(2)每份样品取1㎎于1.5mL EP管中，用剪子将样品尽量剪碎
(3)向各个离心管加入600μLSTE，1.2μL RNase(20mg/mL)充分混匀，37℃水浴2h，向 各个离心管中加入蛋白酶K 10μL，再加入20％SDS 15μL充分混匀。
(4)55℃水浴消化过夜，观测结果，除毛发以外的耳组织全部被消化
(5)冷却至室温，加入等体积苯酚，缓慢的颠倒混匀离心管20min，直至两相混合形成乳 浊液，12000rpm离心10min
(6)取上清，加等体积苯酚，缓慢颠倒离心管20min，12000rpm离心10min
(7)取上清，加等体积酚、氯仿、异戊醇，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min
(8)取上清，加等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10min，12000rpm离心10min
(9)取上清，加入0.1体积的NaAc(约60μL)，轻轻混匀溶液，加2倍体积的无水冰乙 醇沉淀DNA，缓慢转动离心管，可见白色DNA沉淀
(10)将样品置于冰上15～30min，取出，12000rpm离心10min，使DNA沉淀于离心 管底部
(11)倒上清，加入75％的乙醇至管2/3体积，混匀漂洗以除残余的盐，4℃，12000rmp 离心10min，倒掉管中的乙醇
(12)重复上步2～3次
(13)倒上清，不盖管盖，室温中10～15min让乙醇挥发将DNA干燥(注意不能太干燥)
(14)加300μL TE溶解，DNA，置4℃保存
核酸浓度和纯度的检测：
取1μL待测DNA溶液，于核酸蛋白测定仪上测定，DNA纯度＝OD260/OD280DNA和RNA的纯品OD260/OD280比值分别为1.8和2.0，如果污染了蛋白质或苯酚， 其值明显低于纯品比值。
Rasgrf1的PCR反应体系：
总体系为25μL，其中模板(DNA)1μL，lxPCR buffer，引物0.2μM，dNTP150μM，MgCl2： 1.5mM和Taq DNA polymerase 1U。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃45s，退火温度 45s，72℃延伸l min/kb，共35个循环；最后72℃延伸7min；退火温度见表2。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
12％非变性聚丙烯酰胺凝胶：
玻璃板、量筒和烧杯清洗干净，玻璃板空气干燥；将平口玻璃板和凹口玻璃板放至桌面， 给玻璃板滴少量100％乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，空气干燥；平口玻璃板和凹口玻 璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林；放上厚度适当的板条，然后用夹子(夹子夹在板条中间) 将玻璃板固定于灌胶架上；配胶(12％非变性聚丙烯酰胺凝胶：按表3体积配置)、灌胶，缓慢 插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固。
表3 12％非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
电泳：
胶凝固后，拔去梳子，取下胶底端的板条，用水稍微冲洗点样孔处，斜着将玻璃板放入 电泳槽，避免胶底端与缓冲液相接处产生气泡，用夹子从上端将玻璃板固定于电泳槽上，再 加入缓冲液，使上槽缓冲液至少盖住点样孔，下槽缓冲液至少与胶下边缘相平齐，然后用电 泳缓冲液冲洗点样孔；每个样品点10-12μL PCR产物(含染料)，最后点Marker DNA；恒压或 恒流电泳，恒流，1板，50mA-60mA，电压约300V；2板，100-120mA，电压约300-400V。
硝酸银染色方法：
当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，关闭电泳仪，打开夹子，取下玻璃板，将胶从玻 璃板上取下，标记胶块，以便于辨认，然后开始银染处理，处理均在摇床上进行，具体步骤 分别为：胶块清水清洗，0.2％硝酸银染色(5-10min)、2％氢氧化钠显色(5-10min，使用前加 0.2％甲醛)
基因型不同的个体PCR产物的纯化、克隆和测序
PCR产物的纯化
按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)说明书进行，步骤如下：将要分离的PCR产 物至少10μL于TAE缓冲液配制的琼脂糖凝胶上在TAE缓冲液中电泳，EB染色，在紫外光 下切下所需片段，放入1.5mL离心管；加入700μL溶胶液，55℃水浴至胶完全溶化(约 5-10min)；放冷至室温，倾入离心柱中，12000r/min离心30s；弃废液，在离心柱中加入500μL 清洗液，8000r/min离心1min；重复上一步；弃废液，将离心柱放入另一1.5mL离心管中并 加入20μL超纯水或洗脱液，静置2min，12000r/min离心2min，洗脱至1.5mL离心管，-20℃ 保存备用。
纯化的PCR扩增片段的克隆
将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接，连接体系：10μL反应体系中含有5.0μL连接缓 冲液，0.8μLpMD18-T载体，4.2μL纯化的PCR产物。将组分混匀离心后于4℃过夜。
连接产物的转化
在冰上将2.5-10μL连接产物加入盛有200μL感受态细胞的1.5mL离心管中，用移液枪 吸打均匀，冰浴30min后在42℃循环水浴热激90s，快速冰浴2min，再加入400-600μL LB 培养基，在37℃恒温摇床温浴复苏45-60min(180r/min)，然后4000r/min 4min。吸除多余上 清液，使离心管中留有约100μL上清液，用移液枪吸打管底的细菌沉淀使其均匀，然后将菌 液涂布于含Amp的LB平板，37℃培养12-16h。然后从平板上挑取单菌落接入200-600μL 的LB培养基中37℃振摇培养，以备提取质粒。
阳性克隆子的序列测定
以单菌落扩大培养的菌液做模板，用相应的原扩增引物或通用引物进行扩增，根据目的 片段的大小确定阳性克隆子。阳性克隆子抽提质粒进行商业测序。
筛选和确定候选印记基因
正、反杂交模型的建立
正交：巴克夏猪♂×皖南黑猪♀；反交：皖南黑猪♂×巴克夏猪♀。巴克夏猪♂与皖南黑猪♀ 交配产生的F1代仔猪为正交F1。皖南黑猪♂与巴克夏猪♀交配产生的F1代仔猪为反交F1。 提取亲本和1日龄F1正、反交杂合子仔猪14种不同组织的RNA，反转录成cDNA，利用锚 锭引物Exon 14F’和Exon 14R’进行RT-PCR，根据正、反交Fl代杂合子个体的差异带和父本 的带型判断父系或母系或双等位基因表达。
候选印记基因的印记状态
外显子区域内的单核苷酸多态性(single nucleotide polymophism,SNP)，即来自父母双方 的等位基因在其编码区或外显子内不翻译区的某个单核苷酸位点出现多态，为区分不同亲本 来源的等位基因提供了直接而又有效的标记。一旦找到外显子序列上的SNP，就可以研究其 杂合子个体在各组织器官中的mRNA转录水平，确定该基因的印记状态，并且根据其亲本的 基因型可以判断该基因在特定阶段和组织是父系印记还是母系印记或者不存在印记。
总RNA的提取和cDNA的制备
总RNA的提取
猪14种组织(脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小 肠、背最长肌和垂体)总RNA的提取采用大连宝生物公司的Trizol Reaget试剂说明书进行， 所用的陶瓷研钵、玻璃器皿和金属工具经180-240℃烘烤8小时以上；塑料制品经DEPC-H2O 浸泡15小时以上，然后灭菌烘干备用。参考本实验室以往的方法，具体步骤如下：
(l)将冰冻组织放入盛有液氮的研钵中，用研杵迅速将组织磨成粉末，研磨过程不断添加 液氮以保持组织冷冻。
(2)将粉末转移到已加入1.0mLTrizol的2mL离心管，室温静置5min。
(3)于2-8℃以12000g/min离心10min，使混合物分为两相。
(4)将上层水相移入另一2mL离心管中，加入200μL氯仿，盖紧管盖，用力摇晃离心管 15s，室温静置2-3min，于2-8℃以12000g/min离心15min。
(5)将上清液小心转移到另一2mL离心管中，加入500μL异丙醇，轻轻摇匀，室温静置 10min。
(6)于2-8℃，12000g/min离心10min，沉淀RNA，小心移去上清液，防止沉淀丢失。
(7)加入至少l mL75％乙醇，轻轻摇动洗涤沉淀，7500g、2-8s℃离心5min。
(8)弃上清5000g、2-8℃离心l min，慢慢取出离心管，用移液器小心吸出与沉淀分离的 液体，室温下风干。
(9)至沉淀呈透明或半透明时，加入适量(20-100μL)DEPC-H2O溶解，-70℃保存。
cDNA的合成
用反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)，按下列组份(表4)配制反转录反应液。
表4 反转录反应操作步骤
反转录反应的条件如下：37℃水浴15min，85℃水浴5s。反转录后获得的样品cDNA 用于PCR检测后，再补充RNase free水至40μL。将反转录产物保存于-20℃备用。
cDNA质量的鉴定
按照下列配方加入试剂，经PCR反应后得出产物，并用1％琼脂糖凝胶进行产物检测(表 5)。
表5 常规PCR操作方法
RT-PCR-RFLP鉴定印记状态
RT-PCR反应体系
总体系为25μL，其中模板(cDNA)1μL，l x PCR buffer，引物0.2μM，dNTP150μM，MgCl2： 1.5mM和Taq DNA polymerase 1U。
RT-PCR反应条件
94℃预变性4min；94℃45s，退火温度45s，72℃延伸l min/kb，共35个循环；最后72℃ 延伸7min；退火温度见表2。
RT-PCR-RFLP
根据测序结果确定SNP以及附近的准确序列，查找相应的限制性内切酶。取8.5μLPCR 产物加入0.2-0.5μL(10U/μL)限制性内切酶Vpak11AI和1μL 10×buffer(含10×BSA)，在最适 温度下消化4h，消化产物经琼脂糖或聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下或银染后 观察带型并一一记录消化结果。
Q-RT-PCR
取F1代1日龄正反交仔猪个体各8头的14种组织(脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、 胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小肠、背最长肌和垂体)的cDNA样品，进行定量PCR。
将待测样品的反转录产物进行等量混合，用混合的cDNA mix对整个反应条件进行优化。 包括目的基因及内参基因的引物设计与合成、试剂的验证、内标基因的有效性验证、目的基 因的确认和最佳的退火温度、引物的浓度和最佳的实验条件评估等。
猪Rasgrf1和内参β-Actin基因用实时荧光定量PCR方法来检测它们的表达量，在 Rotor-gene 6000荧光定量PCR仪上进行反应。反应体系为25μL，具体步骤如下(表6)：
表6 RT-PCR反应操作步骤
目的基因蛋白水平的检测
石蜡组织切片的制作
(1)固定：脾(新鲜配制的Bouin溶液中固定24h)，其他组织(10％中性甲醛固定液固定24 h)；
(2)脱水：使用浓度逐级升高的梯度乙醇依次脱水。30％→50％→60％→70％→80％→ 90％→95％Ⅰ、Ⅱ→无水乙醇ⅠⅡ，各60min；
(3)透明：二甲苯无水乙醇混合液(1︰1)20min→二甲苯Ι、Ⅱ，各10min；
(4)浸蜡：二甲苯石蜡混合液(1︰1)1h→石蜡Ⅰ、Ⅱ，各1h；
(5)包埋：将溶化的石蜡倒入包埋盒内，用镊子将浸蜡彻底的组织块放入，蜡块大小以满 足切片需要、便于切片机固定和切片为宜；
(6)切片：组织块制成蜡块，稳固置于切片机上即可开始切片，厚度为6μm；
(7)展片：展片温度控制在43℃以内。
免疫荧光
(1)烤片温度为60℃，2-8h；
(2)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各15min；
(3)梯度酒精复水(100％酒精Ⅰ、Ⅱ各10min→95％酒精Ⅰ、Ⅱ各10min→80％酒精5 min→70％酒精5min→50％酒精5min→蒸馏水3min×2次→PBS5min)；
(4)抗原修复：切片至于枸橼酸修复液中，100％火力3min至微微沸腾→50％火力维持7 min→停止加热自然冷却30min；
(5)封闭：PBS 3min，滤纸擦去标本外的PBS→滴加封闭血清(1％BSA)→湿盒中37℃封闭 30min→滤纸擦去封闭液；
(6)一抗：滴加200μL体积比为1:100稀释的兔抗人Rasgrf1蛋白多克隆抗体，4℃孵育过 夜→PBS 3min×5次洗去一抗，滤纸擦去标本外的PBS；
(7)二抗：滴加200μL体积比为1:100稀释的荧光标记山羊抗兔IgG，室温孵育1h→PBS 3min×5次洗去二抗，滤纸擦去标本外的PBS；
(8)染核：滴加PI避光孵育8min→PBS3min×3次洗去PI，滤纸擦去标本外的PBS；
(9)甘油封片，立即在共聚焦显微镜下观察。
亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析方法
DNA修饰(根据Milli-pore甲基化试剂盒说明书)，具体步骤如下：
具体步骤如下：
(1)DNA修饰：
100μL含1.0μg DNA溶液中加入7.0μL 3mol/L的氢氧化钠，充分混匀；50℃孵育 DNA10min后加550μL现配的DNA修饰试剂Ⅰ，涡旋；50℃避光孵育16h。
(2)首次脱盐
在DNA溶液中加入5μL充分涡旋重悬DNA修饰试剂Ⅲ，再加入750μL DNA修饰试剂 Ⅱ，混匀；室温孵育10min，5000g离心10s，弃上清；加1.0mL70％乙醇，涡旋，5000g离 心10s，弃上清，重复三次；第三次弃上清后，高速离心2min，吸去上清。
(3)第二次脱盐
在上述沉淀中加入50μL 20mmol/L NaOH/90％乙醇，涡旋重悬颗粒于室温孵育5min； 5000g离心10s，收集内容物于管底。加1.0ml 90％乙醇，涡旋洗涤颗粒，离心，弃上清，重 复一次。第二次洗涤，弃上清后高速离心3min，吸净上清，室温干燥20min；加TE缓冲液， 50-60℃孵育样品15min，洗脱DNA，高速离心3min，将上清转入新的PCR管，分装-20℃ 保存。
甲基化特异性PCR引物设计
通过甲基化预测网站www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/预测猪Rasgrf1基因上游2kb左右区域 的CpG岛的分布情况。用甲基化在线软件MethPrimer设计引物。包括DNA修饰前特异性引 物和甲基化简并性引物。
所述引物包括用于Rasgrf1启动子区甲基化分析的引物和CTCF结合区域甲基化分析引 物；所述用于Rasgrf1启动子部分甲基化分析的引物为DNA修饰前引物、岛1引物、岛2引 物和岛3引物，所述DNA修饰前引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6 所示；所述岛1引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；所述岛2 引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述岛3引物的核苷酸 序列如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述CTCF结合区域甲基化分析引物 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
结果判定
以预测的GpG岛区域为模板的PCR扩增片段连接载体进行测序，结果与DNA修饰前特 异性引物扩增的片段进行对比确定GpG岛的分布情况，进而得出该序列甲基化程度。
二、结果
1、猪Rasgrf1基因保守区域的分离及同源性分析
本试验克隆得到在不同物种间相对保守的Rasgrf1基因的第1和第14外显子的部分序列 (图1)。序列分析结果表明家猪Rasgrf1基因第14外显子为高CG含量(59.29％)，猪与人和鼠 的该部分序列同源性分别为93.4％和83.9％；第1外显子为高CG含量(67.60％)，猪与人和 鼠的该部分序列同源性分别为91.2％和79.3％。
2、猪Rasgrf1基因印记状态分析
(1)外显子序列的SNP检测
PCR-SSCP-PAGE结果显示：在皖南黑猪和巴克夏猪群体中查找Rasgrf1基因外显子部分 的SNP，不同品种群体中该基因的部分第14外显子保守序列经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 发现存在不同的带型。(图2)，同样为保守序列的外显子1部分序列经非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳图发现带型相同(图3)；进一步克隆测序发现，皖南黑猪与巴克夏猪Rasgrf1基因第14 外显子上存在SNP位点(g.84709G/A)，且为同义突变。
图1到图6为不同品种猪个体间Rasgrf1特定位置SNP的筛查，图1为扩增出的目的片 段1.2％琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DNA marker，泳道1和泳道2为引物Exon1F/Exon1R 扩增的特异性片段(193bp)；泳道3-6为引物Exon 14F/Exon14R扩增的特异性片段(228bp)； 图2为引物Exon 14F/Exon14R以不同基因组为模板扩增的目的片段在12％非变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳图，泳道1-7、9、10、13和14为同一种带型，泳道8、10、11和12为同一种带型； 图3为引物Exon 1F/Exon1R以不同基因组为模板扩增的目的片段在12％非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳图，该片段没有SNP；图4为引物Exon 14F/Exon14R以皖南黑猪样本为模板扩增的目 的片段测序峰图；图5为引物Exon 14F/exon14R以巴克夏猪样本为模板扩增的目的片段测序 峰图。存在一个SNP位点(g.84709G/A)，箭头表示；图6为引物Exon 14F/Exon14R以皖南 黑猪DNA为模板扩增的序列与以巴克夏猪DNA为模板扩增的序列比对结果，第14外显子 中存在SNP，氨基酸序列显示该SNP为同义突变。
(2)SNP位点杂合个体的筛查
通过杂合个体SNP位点不同的等位基因，可判断其是来自父本还是母本的遗传物质。SNP 位点杂合个体的筛选是鉴定基因印记状态的必备条件。引物Exon 14F/exon14R扩增Rasgrf1 基因片段，经限制性内切酶Vpak11AI消化后电泳，筛查到7头F1仔猪为g.84709G/A位点 杂合子个体，其中正交3头，反交4头。等位基因g.84709G的产物分别为116，75和38bp； 等位基因g.84709A的产物分别为191和38bp；该位点为杂合子的产物为191，116，75和38 bp，共4条带(图7)。图7为猪FASGRF1基因引物Exon 14F/exon14R扩增片段PCR-RFLP 图，M为DNA marker(从上到下分别为500、400、300、200、150、100、75、50和25bp)， GG，AA和AG代表不同的基因型。
(3)Rasgrf1在不同组织器官的印记状态分析
RT-PCR-RFLP结果(图8)显示，正交(a)和反交(b)产生的F1代杂合子个体中，该基因 在猪的肝和小肠均优先表达母源等位基因(泳道13和14)，在肝中均优先表达父源等位基因(泳 道15)，在其他11个组织器官中双等位基因表达。图8为猪Rasgrf1等位基因特异性表达图 谱，泳道2至泳道15为以g.84709G/A位点杂合子1日龄仔猪14个组织器官的cDNA样品 为模板的特异性PCR产物，泳道16、17和18为以杂合子仔猪及其亲本DNA样品为模板的 特异性PCR产物。泳道1为DNA marker(从上往下条带依次是500、400、300、200、150、 100、75、50和25bp)。
(4)Rasgrf1在不同组织器官转录水平
Q-RT-PCR结果(图9)显示猪Rasgrf1基因mRNA表达水平在在14种组织器官中存在差 异；巴克夏猪♂与皖南黑猪♀杂交、皖南黑猪♂与巴克夏猪♀杂交F1代仔猪14种组织器官 Rasgrf1基因mRNA的表达具有相似的组织表达谱模式，均为在脑、垂体、胰腺高丰度表达， 其次是肾、胃、肺、睾丸、小肠、卵巢、脾脏和肝脏，在背最长肌、心脏和背膘中表达水平 低。并且在脑、垂体和胰腺等高丰度表达的组织中，巴克夏猪♂与皖南黑猪♀杂交F1仔猪个 体Rasgrf1基因mRNA的表达水平高于皖南黑猪♂与巴克夏猪♀杂交F1代仔猪个体。
图9为荧光定量PCR检测Rasgrf1mRNA在各组织中的表达水平。相对表达以 mean±SEM(n＝3)表示，*表示不同品种同一组织器官Rasgrf1mRNA表达存在显著差异 (P<0.05)，不同字母表示同一品种猪不同组织器官Rasgrf1mRNA表达存在显著差异(P<0.05)。
(5)部分组织Rasgrf1蛋白表达
由激光共聚焦显微镜观察切片可知Rasgrf1基因编码的蛋白广泛存在于心、脾、小肠和 肝中。PI(碘化丙啶)对细胞核进行染色，在激发和发射波长分别为535nm和615nm处， PI-DNA复合物呈红色荧光，视野内的红色颗粒为细胞核。带DyLight488活性染料二抗与猪 Rasgrf1蛋白的抗体进行特异性结合，在绿色发射光下，激发和发射波长分别493nm和518 nm处，染料-蛋白复合物呈绿色荧光，绿色颗粒即标记为目的蛋白。结果显示，Rasgrf1基因 编码的蛋白质围绕细胞核分布，主要存在细胞质和细胞间质中；Rasgrf1蛋白在心脏中表达 最高，脾脏次之且明显高于肝脏和小肠。免疫荧光的结果提示在Rasgrf1基因单等位表达的 组织中该蛋白翻译水平相对较低。
(6)正反杂交仔猪印记基因甲基化分析
Rasgrf1基因启动子区的确定
通过启动子区预测网站http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl对Rasgrf1基 因上游5’端进行分析发现419bp和779bp处存在分值较高的核心启动子区。启动子序列中突 出的G和A表示转录起始位点。
启动子区CpG岛和调控区CTCF的预测
运用软件Methprimer预测发现猪Rasgrf1基因启动子区有三处CpG岛(图10)；以猪染色 体7:53659330-53883708为参考序列，预测CTCF位置，并且预测的CTCF结合位点在该处的 CpG岛内。以亚硫酸氢钠处理后的DNA为目的序列设计特异性的甲基化引物或CpG岛附近 的简并引物对CpG岛以及附近的序列进行PCR扩增。
(7)Rasgrf1基因调控区的甲基化
由于DNA双链经亚硫酸氢钠修饰后，两条单链不再互补，故DNA修饰后的特异性引物 均只针对一条单链设计；在第一轮PCR循环中以其中一条引物(上游)扩增出互补链之后，另 一条引物(下游)才开始在PCR循环中起作用。DNA未修饰引物作为DNA亚硫酸氢钠修饰的 对照。对照组和特异性甲基化引物的PCR产物连接载体测序，比对分析得出Rasgrf1基因调 控区的甲基化程度(图11)。结果表明：在核心启动子区域的三个CpG岛和CTCF结合区域的 CpG岛甲基化程度均较低，不同于小鼠和大鼠Rasgrf1基因核心启动子区域CpG岛甲基化状 态，提示猪Rasgrf1基因的印记调控机制可能与小鼠、大鼠Rasgrf1基因印记调控机制不同。
本发明的目的在于鉴定新的猪印记基因，为下一步研究该印记基因功能和印记机理打下 基础。本试验通过筛查亲缘关系较远的猪(巴克夏猪、皖南黑猪)Rasgrf1基因的多态位点， 在第14外显子检测到了1个SNP位点。其中，巴克夏猪为西方猪品种，皖南黑猪为我国安 徽省本地品种，此两个品种亲缘关系比较远，容易找到SNP位点。因此，以巴克夏猪♂×皖 南黑猪♀以及皖南黑猪♂×巴克夏猪♀杂交产生的F1代仔猪为研究对象，选取在该SNP位点 为杂合基因型的个体为试验材料，进一步分析Rasgrf1基因在1日龄仔猪上14种组织器官的 印记表达规律。正、反杂交模型有效地避免了基因在单个品种上表达的差异性，RT-PCR-RFLP 方法结合测序检测基因的印记表达状态方便、可行。本试验采用正、反交的表型差异结合SNP 的表达分析方法，能够对本土家猪Rasgrf1基因的印记表达状态做出准确和快速的鉴定。
本发明在Rasgrf1基因转录水平组织表达谱模式无显著差异(本试验发现猪Rasgrf1基因 在大脑、垂体、胰脏表达最高，其次在肾、胃、肺、睾丸、小肠、卵巢、脾和肝，在背最长、 心和脂肪中表达最低；猪Rasgrf1基因在脑、垂体和胰脏中高效表达与先前该基因在人、鼠 上表达的研究报道结果一致。)的前提下，选取了Rasgrf1基因双等位基因表达的两种组织(心 和脾)，单等位基因表达的两种组织(肝和小肠)进行Rasgrf1基因编码的蛋白质分布的研究。 结果显示，Rasgrf1蛋白在心脏中表达最高，脾脏次之且明显高于肝脏和小肠。结果提示在 Rasgrf1基因单等位表达的组织中该蛋白翻译水平相对较低。
本发明通过对猪Rasgrf1基因启动子活性的分析，预测出了其核心启动子区和该片段内 CTCF结合区域，并经软件预测此两处存在丰富的CpG岛。样品经过亚硫酸盐处理后，通过 特异性引物对其进行PCR扩增，而后测序进行甲基化分析。结果表明：在核心启动子区域的 三个CpG岛和CTCF结合区域的CpG岛甲基化程度均较低。不同于小鼠和大鼠Rasgrf1基因 核心启动子区域CpG岛甲基化状态，提示猪Rasgrf1基因的印记调控机制可能与小鼠和大鼠 Rasgrf1基因印记调控机制不同。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。