一种制霉菌素的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103755758 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103755758 A (21)申请号 201410028136.3 (22)申请日 2014.01.21 C07H 17/08(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 北京安汀医药生物科技有限公司 地址 100101 北京市朝阳区小营路 13 号亚 非大厦 9008 室 (72)发明人 程雪翔 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 (54) 发明名称 一种制霉菌素的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种制霉菌素的制备方法，。

2、 包 括使用水溶性有机溶剂从诺尔斯氏链霉菌发酵液 提取制霉菌素以及将制霉菌素进一步纯化结晶的 步骤。本发明所述制备方法采用特定的提取工艺 及纯化结晶工艺， 获得了高收率、 高纯度的制霉菌 素结晶的制备， 适于大规模的工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103755758 A CN 103755758 A 1/2 页 2 1. 一种制霉菌素的制备方法， 其特征在于， 包括 ： （1） 将水溶性有机溶剂加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中 ； （2） 调节步。

3、骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 4-6， 然后为 6.5-7.5 ； 过滤去除未溶解的物 质， 蒸发去除所述有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中制浆， 将所得浆 液升温至 55-58， 然后冷却至 6-8， 从浆液中回收制霉菌素。 2. 根据权利要求 1 所述制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述水溶性有机溶剂为异 丙醇和 / 或正丙醇 ； 优选地， 所述水溶性有机溶剂在所得混合溶液中的体积百分比为 55%-72%、 优选为 60%-70%、 更优选为 65%。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述制备方法。

4、， 其特征在于， 步骤 （2） 为 ： 调节步骤 （1） 所得混 合溶液的pH值为4.5-5.5、 优选为5， 然后为6.5-7.5、 优选为7 ； 过滤去除未溶解的物质， 蒸 发去除所述有机溶剂， 回收所得沉淀即为制霉菌素沉淀。 4. 根据权利要求 1-3 任一项所述制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 所述含六偏焦磷 酸钠的异丙醇水溶液中， 六偏焦磷酸钠的按 g/ml 计的质量体积百分含量为 0.8-3.0%、 优选 为 1.0-3.0%、 更优选为 2.2% ； 优选地， 所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中， 异丙醇的体积百分含量为 20-40v/ v%、 优选为 30%。 5.。

5、 根据权利要求 1-4 任一项所述制备方法， 其特征在于， 还包括步骤 ： （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在甲醇 - 氯化钙溶液中， 加入水， 调节溶液的 pH 值 为 5.9-6.1， 过滤去除未溶解的物质， 调节所得滤液的 pH 值为 5.3-5.5， 加热至 50-55持 续 15-40 分钟、 优选 20-30 分钟， 加入与缩减之前的水体积相当的水， 然后从所得混合物中 回收晶体得制霉菌素结晶。 6. 根据权利要求 5 所述制备方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 所述甲醇 - 氯化钙溶液中， 氯化钙的按 g/ml 计的质量体积百分比为 1-4%、 优选为 2-3%、。

6、 更优选为 2%。 7. 根据权利要求 5 或 6 所述制备方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 第一次加入的水量为 甲醇 - 氯化钙溶液体积的 1/2。 8. 根据权利要求 5-7 任一项所述制备方法， 其特征在于， 步骤 （4） 具体为 ： 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为2%的甲醇-氯化钙溶液 中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 5.9-6.1、 优选为 6.0， 过滤去除未溶解的物质， 调节所得滤液的 pH 值为 5.3-5.5、 优选为 5.4， 加热至 50-55持续 15-40 分钟、 优选 20-30 分钟， 加入与缩减之前的。

7、水体积相当的水， 调节并维持溶液的pH值为5.0-5.2、 优选为5.1， 然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。 9. 根据权利要求 1-8 任一项所述制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （1） 将正丙醇和 / 或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中， 使得其在混合溶液中的体 积百分比为 65% ； （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 5， 然后为 7 ； 过滤去除未溶解的物质， 蒸发去 除有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含以 g/ml 计的 2.2% 六偏焦磷酸钠的 30v/v% 的异 权 利 要 求 书 CN 10375。

8、5758 A 2 2/2 页 3 丙醇水溶液中制浆， 将所得浆液升温至 55-58， 然后冷却至 6-8， 从浆液中回收制霉菌 素 ； （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为 2% 的甲醇 - 氯化钙 溶液中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 5.9-6.1、 优选为 6.0， 过滤去除未溶解的物 质， 调节所得滤液的 pH 值为 5.3-5.5、 优选为 5.4， 加热至 50-55持续 20-30 分钟， 加入与 缩减之前的水体积相当的水， 调节并维持溶液的 pH 值为 5.0-5.2、 优选为 5.1， 然后从所得 混合物中回收晶体得制霉菌。

9、素结晶。 权 利 要 求 书 CN 103755758 A 3 1/4 页 4 一种制霉菌素的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及药物制备技术领域， 尤其涉及一种制霉菌素原料药的制备方法。 背景技术 0002 制霉菌素是由 Hazen 和 Brown 于 1950 年发现的由 Streptomyces noursei 发酵后 分离得到的抗真菌类抗生素， 在 1956 年开始临床应用， 对念珠菌引起的胃肠炎、 阴道感染， 以及由于长期使用广谱抗生素所致的念珠菌病的预防和治疗有良好的效用。 0003 由诺尔斯氏链霉菌属制备制霉菌素的方法在 1951 年 1 月 12 日提交的序号为 208,9。

10、78 的 Hazen 和 Brown 的同时待审的申请中有描述。粗制的制霉菌素浓缩液可通过用 几部分的甲醇提取菌丝垫， 然后用乙酸乙酯分级沉淀， 用 0.85%NaCl 溶液洗涤沉淀， 将沉淀 溶解在甲醇中并用乙醚分级沉淀来处理甲醇溶液。 活性晶体材料可通过在丁醇和盐水之间 分配和通过从甲醇中部分沉淀由所得粗制浓缩液中获得， 。高纯度的晶体制霉菌素通过使 部分纯化的制霉菌素浓缩液在通过混合正丁醇、 甲醇、 水和己烷制作的两相系统中分配， 并 允许该系统暴露于空气蒸发直到晶体在截面上聚集而得。 0004 以上描述的方法可产生晶体制霉菌素， 但是由于杂质的存在和低产量备受争议， 并且难以控制和进行。

11、大规模的工业化生产。 发明内容 0005 本发明的目的在于提出一种高收率、 高纯度的制霉菌素制备方法。 0006 为达此目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0007 一种制霉菌素的制备方法， 包括 ： 0008 （1） 将水溶性有机溶剂加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中 ； 0009 （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 4-6， 然后为 6.5-7.5 ； 过滤去除未溶解 的物质， 蒸发去除所述有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； 0010 （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中制浆， 将所 得浆液升温至 55-58， 然后冷却至 6-8， 从浆液中回收制。

12、霉菌素。 0011 上述制备方法中， 作为优选， 步骤 （1） 中， 所述水溶性有机溶剂为异丙醇和 / 或正 丙醇 ； 0012 优选地， 所述水溶性有机溶剂在所得混合溶液中的体积百分比为 55%-72%、 优选为 60%-70%、 更优选为 65%。 0013 在具体的实施方式中， 所述水溶性有机溶剂在所得混合溶液中的体积百分比可以 为 55%、 56%、 57%、 58%、 59%、 60%、 61%、 62%、 63%、 64%、 65%、 66%、 67%、 68%、 69%、 70%、 71% 或 72%。 0014 作为优选， 步骤 （2） 为 ： 调节步骤 （1） 所得混合溶液的。

13、 pH 值为 4.5-5.5、 优选为 5， 然后为 6.5-7.5、 优选为 7 ； 过滤去除未溶解的物质， 蒸发去除所述有机溶剂， 回收所得沉淀 即为制霉菌素沉淀。 0015 在具体的实施方式中， 步骤 （2） 中， 可调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 4.5、 说 明 书 CN 103755758 A 4 2/4 页 5 4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5.0、 5.1、 5.2、 5.3、 5.4、 5.5， 然后再调节至 6.5、 6.6、 6.7、 6.8、 6.9、 7.0、 7.1、 7.2、 7.3、 7.4、 7.5。 0016 作为优选， 步骤 （3）。

14、 中， 所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中， 六偏焦磷酸钠的 按 g/ml 计的质量体积百分含量为 0.8-3.0%， 优选为 1.0-3.0%， 更优选为 2.2%。 0017 在具体的实施方式中， 所述含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中， 六偏焦磷酸钠 的按 g/ml 计的质量体积百分含量可以为 0.8%、 0.9%、 1.0%、 1.1%、 1.2%、 1.3%、 1.4%、 1.5%、 1.6%、 1.7%、 1.8%、 1.9%、 2.0%、 2.1%、 2.2%、 2.3%、 2.4%、 2.5%、 2.6%、 2.7%、 2.8%、 2.9% 或 3.0%。 0018 优选地， 所述。

15、含六偏焦磷酸钠的异丙醇水溶液中， 异丙醇的体积百分含量为 20-40v/v%、 优选为 30%。 0019 作为优选， 上述制备方法还包括进一步纯化结晶制霉菌素的步骤， 具体为 ： 0020 （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在甲醇 - 氯化钙溶液中， 加入水， 调节溶液 的 pH 值为 5.9-6.1， 过滤去除未溶解的物质， 调节所得滤液的 pH 值为 5.3-5.5， 加热至 50-55持续15-40分钟、 优选20-30分钟， 加入与缩减之前的水体积相当的水， 然后从所得 混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。 0021 作为优选， 步骤 （4） 中， 所述甲醇 - 氯化钙溶液中， 。

16、氯化钙的按 g/ml 计的质量体积 百分比为 1-4%、 优选为 2-3%、 更优选为 2%。 0022 作为优选， 步骤 （4） 中， 第一次加入的水量为甲醇 - 氯化钙溶液体积的 1/2。 0023 更优选地， 步骤 （4） 具体为 ： 0024 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为 2% 的甲醇 - 氯化 钙溶液中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 5.9-6.1、 优选为 6.0， 过滤去除未溶解的 物质， 调节所得滤液的 pH 值为 5.3-5.5、 优选为 5.4， 加热至 50-55持续 15-40 分钟、 优选 20-30 分钟， 加入。

17、与缩减之前的水体积相当的水， 调节并维持溶液的 pH 值为 5.0-5.2、 优选 为 5.1， 然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。 0025 本发明的一个特别优选的实施方案具体包括如下步骤 ： 0026 （1） 将正丙醇和 / 或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中， 使得其在混合溶液中 的体积百分比为 65% ； 0027 （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 5， 然后为 7 ； 过滤去除未溶解的物质， 蒸 发去除有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； 0028 （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含以 g/ml 计的 2.2% 六偏焦磷酸钠的 30v/v% 的异丙醇水。

18、溶液中制浆， 将所得浆液升温至 55-58， 然后冷却至 6-8， 从浆液中回收制 霉菌素 ； 0029 （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为 2% 的甲醇 - 氯 化钙溶液中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 5.9-6.1、 优选为 6.0， 过滤去除未溶解 的物质， 调节所得滤液的 pH 值为 5.3-5.5、 优选为 5.4， 加热至 50-55持续 20-30 分钟， 加 入与缩减之前的水体积相当的水， 调节并维持溶液的 pH 值为 5.0-5.2、 优选为 5.1， 然后从 所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶。 0030 本发明所述。

19、制备方法采用特定的提取工艺及纯化结晶工艺， 获得了高收率、 高纯 度的制霉菌素结晶的制备， 适于大规模的工业化生产。 说 明 书 CN 103755758 A 5 3/4 页 6 具体实施方式 0031 下面结合具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。 0032 实施例 1 0033 具体步骤为 ： 0034 （1） 将正丙醇和 / 或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中， 使得其在混合溶液中 的体积百分比为 65% ； 0035 （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 4.5， 然后为 7.0 ； 过滤去除未溶解的物 质， 蒸发去除有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； 0036 （3）。

20、 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含以 g/ml 计的 2.2% 六偏焦磷酸钠的 30v/ v% 的异丙醇水溶液中制浆， 将所得浆液升温至 55， 然后冷却至 6， 从浆液中回收制霉菌 素 ； 0037 （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为 2% 的甲醇 - 氯 化钙溶液中， 加入1/2体积的水， 调节溶液的pH值为6.0， 过滤去除未溶解的物质， 调节所得 滤液的 pH 值为 5.4， 加热至 55持续 16 分钟， 加入与缩减之前的水体积相当的水， 调节并 维持溶液的pH值为5.1， 然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶收率80%、 纯度88%。 00。

21、38 实施例 2 0039 具体步骤为 ： 0040 （1） 将正丙醇和 / 或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中， 使得其在混合溶液中 的体积百分比为 55% ； 0041 （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 5.5， 然后为 7.2 ； 过滤去除未溶解的物 质， 蒸发去除有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； 0042 （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含以 g/ml 计的 2.0% 六偏焦磷酸钠的 20v/ v% 的异丙醇水溶液中制浆， 将所得浆液升温至 58， 然后冷却至 8， 从浆液中回收制霉菌 素 ； 0043 （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量。

22、体积百分含量为 3% 的甲醇 - 氯 化钙溶液中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 6.1， 过滤去除未溶解的物质， 调节所 得滤液的 pH 值为 5.5， 加热至 55持续 16 分钟， 加入与缩减之前的水体积相当的水， 调节 并维持溶液的 pH 值为 5.0， 然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶， 收率 78%、 纯度 85%。 0044 实施例 3 0045 具体步骤为 ： 0046 （1） 将正丙醇和 / 或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中， 使得其在混合溶液中 的体积百分比为 70% ； 0047 （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 6.0，。

23、 然后为 7.5 ； 过滤去除未溶解的物 质， 蒸发去除有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； 0048 （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含以 g/ml 计的 3.0% 六偏焦磷酸钠的 40v/ v% 的异丙醇水溶液中制浆， 将所得浆液升温至 58， 然后冷却至 8， 从浆液中回收制霉菌 素 ； 0049 （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为 3% 的甲醇 - 氯 说 明 书 CN 103755758 A 6 4/4 页 7 化钙溶液中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 5.9， 过滤去除未溶解的物质， 调节所 得滤液的 pH 值为 5.3，。

24、 加热至 55持续 16 分钟， 加入与缩减之前的水体积相当的水， 调节 并维持溶液的 pH 值为 5.1， 然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶， 收率 77%、 纯度 86%。 0050 实施例 4 0051 具体步骤为 ： 0052 （1） 将正丙醇和 / 或异丙醇加入诺尔斯氏链霉菌发酵液中， 使得其在混合溶液中 的体积百分比为 72% ； 0053 （2） 调节步骤 （1） 所得混合溶液的 pH 值为 4.0， 然后为 6.5 ； 过滤去除未溶解的物 质， 蒸发去除有机溶剂， 得制霉菌素沉淀 ； 0054 （3） 将步骤 （2） 所得制霉菌素沉淀在含以 g/ml 计的 0.8% 六。

25、偏焦磷酸钠的 40v/ v% 的异丙醇水溶液中制浆， 将所得浆液升温至 56， 然后冷却至 8， 从浆液中回收制霉菌 素 ； 0055 （4） 将步骤 （3） 回收的制霉菌素溶解在氯化钙质量体积百分含量为 2% 的甲醇 - 氯 化钙溶液中， 加入 1/2 体积的水， 调节溶液的 pH 值为 5.9， 过滤去除未溶解的物质， 调节所 得滤液的 pH 值为 5.3， 加热至 55持续 16 分钟， 加入与缩减之前的水体积相当的水， 调节 并维持溶液的 pH 值为 5.2， 然后从所得混合物中回收晶体得制霉菌素结晶， 收率 75%、 纯度 85%。 0056 申请人声明， 本发明通过上述实施例来说明本发明， 但本发明并不局限于上述， 即 不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了， 对本发明的 任何改进， 对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、 具体方式的选择等， 均落在 本发明的保护范围和公开范围之内。 说 明 书 CN 103755758 A 7 。