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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710382069.9 (22)申请日 2017.05.26 (71)申请人 河南中医药大学 地址 450008 河南省郑州市金水区金水路1 号 (72)发明人 郑晓珂曾梦楠李孟李苗 张贝贝张志广赵莹莹王小兰 冯卫生 (74)专利代理机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 代理人 聂孟民 (51)Int.Cl. C07C 231/24(2006.01) C07C 233/11(2006.01) A61K 31/165(2006.01) A61P 5/30(200。
2、6.01) (54)发明名称 一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物 的方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺 化合物的方法及其应用， 有效解决从北葶苈子中 提取2-苯乙酰胺化合物及其在制备治疗雌激素 缺乏症的药物问题， 方法是， 将炒北葶苈子加10 倍重量的水提取三次， 合并三次提取液， 减压浓 缩至浸膏， 浸膏用乙醇醇沉， 弃沉淀， 将上清液离 心过滤， 浓缩至无醇味， 上DianionHP-20柱， 依 次用水、 20%乙醇、 40%乙醇洗脱， 收集40%乙醇洗 脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓缩， 过 ToyopearlHW-40色谱柱， 依次用水和。
3、10%甲醇水 溶液洗脱， 收集10%甲醇水溶液洗脱部分， 用甲醇 溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 干燥， 得2-苯乙酰 胺， 本发明方法新颖独特， 易操作， 有效用于制备 治疗雌激素缺乏症的药物， 开拓了北葶苈子的药 用价值和商业价值。 权利要求书1页 说明书5页 CN 107056644 A 2017.08.18 CN 107056644 A 1.一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法， 其特征在于， 将炒北葶苈子7.5- 8.5kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至260-280g的 浸膏， 浸膏用体积浓度为80%的乙醇19-21L。
4、醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至无醇 味， 上Dianion HP-20柱， 依次用水20L、 20%乙醇60L、 40%乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收集 40%乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓缩至30-40ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依次用水3L和体积浓度10%甲醇水溶液3L洗脱， 流速8mL/min， 收集体积浓度10%甲醇水溶液 洗脱部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲 醇溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为2-苯乙酰胺， 质量含量达到95%以上。 2。
5、.根据权利要求1所述的从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法， 其特征在于， 将 炒北葶苈子8kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至 270g的浸膏， 浸膏用体积浓度为80%的乙醇20L醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至 1000 ml， 上Dianion HP-20柱， 依次用水20L、 20%乙醇60L、 40%乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收集40%乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓缩至35ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依次用水3L和体积浓度10%甲醇水溶液3L洗脱， 流速8mL/mi。
6、n， 收集体积浓度10%甲醇水溶液 洗脱部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲 醇溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为2-苯乙酰胺， 质量含量达到95%以上。 3.根据权利要求1所述的从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法， 其特征在于， 将 炒北葶苈子7.5kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至 260g的浸膏， 浸膏用体积浓度为80%的乙醇19L醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至 无醇味， 上Dianion HP-20柱， 依次用水20L、 20%乙醇60L。
7、、 40%乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收 集40%乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓缩至30ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依 次用水3L和体积浓度10%甲醇水溶液3L洗脱， 流速8mL/min， 收集体积浓度10%甲醇水溶液洗 脱部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲醇 溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为2-苯乙酰胺， 质量含量达到95%以上。 4.根据权利要求1所述的从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法， 其特征在于， 将 炒北葶苈子8.5kg， 每次加10倍重量的水提取。
8、三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至 280g的浸膏， 浸膏用体积浓度为80%的乙醇21L醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至 无醇味， 上Dianion HP-20柱， 依次用水20L、 20%乙醇60L、 40%乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收 集40%乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓缩至40ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依 次用水3L和体积浓度10%甲醇水溶液3L洗脱， 流速8mL/min， 收集体积浓度10%甲醇水溶液洗 脱部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用。
9、甲醇 溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为2-苯乙酰胺， 质量含量达到95%以上。 5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的2-苯乙酰胺化合物作为唯一活性成分在制 备治疗雌激素缺乏症药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107056644 A 2 一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及医药， 特别是一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其应 用。 背景技术 0002 植物雌激素是来源于植物， 与哺乳动物的类固醇激素17 -雌二醇有相似结构的 多羟基化合物。 天然的植物雌激素相比于合成的雌激素， 其雌激素样活性要。
10、低， 但是所引起 的乳腺癌、 子宫内膜癌等副作用也更少， 使用会更安全。 因此对含有植物雌激素的研究逐渐 成为热点。 0003 葶苈子为常用中药材， 始载于 神农本草经 ， 列为下品， 该药味辛、 苦， 性大寒， 归 肺与膀胱经， 具有宣泄平喘、 行水消肿的功效。 2015版 中国药典 收录的 “葶苈子” 有南北之 分， 其中十字花科植物独行菜LepidiumapetalumWilld.的干燥成熟种子习称 “北葶苈子” ， 而播娘蒿Descurainiasophia(L.)WebbexPrantl.的干燥成熟种子习称 “南葶苈子” 。 虽然南 北葶苈子都做正品葶苈子用， 但其植物来源、 外观性。
11、状和药理活性均有所差异。 更未有关于 从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物及其在制备雌激素药物中应用的公开报导。 发明内容 0004 针对上述情况， 为克服现有技术之缺陷， 本发明之目的就是提供一种从北葶苈子 中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其应用， 可有效解决从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合 物及其在制备治疗雌激素缺乏症的药物问题。 0005 本发明解决的技术方案是， 一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是， 将炒北葶苈子7.5-8.5kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压 浓缩至260-280g的浸膏， 浸膏用体积浓度为80的乙醇19-21L醇。
12、沉2h， 弃沉淀， 将上清液离 心过滤， 浓缩至无醇味(约1000ml)， 上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树 脂)， 依次用水20L、 20乙醇60L、 40乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收集40乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓缩至30-40ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依次用水3L和体积 浓度10甲醇水溶液3L洗脱， 流速8mL/min， 收集体积浓度10甲醇水溶液洗脱部分， 用甲 醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲醇溶解， 静置 24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为2。
13、-苯乙酰胺， 质量含量达到95以上。 0006 该制备物2-苯乙酰胺可有效用于制备治疗雌激素缺乏症的药物， 实现2-苯乙酰胺 作为唯一活性成分在制备治疗雌激素缺乏症药物中的应用。 0007 本发明方法新颖独特， 易操作， 可有效用于从北葶苈子中制备2-苯乙酰胺， 并有效 用于制备治疗雌激素缺乏症的药物， 开拓了治疗雌激素缺乏症的新途径， 开拓了北葶苈子 的药用价值和商业价值， 有良好的经济和社会效益。 具体实施方式 说明书 1/5 页 3 CN 107056644 A 3 0008 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。 0009 实施例1 0010 本发明在具体实施中， 一种从北葶。
14、苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是， 将炒 北葶苈子8kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至270g 的浸膏， 浸膏用体积浓度为80的乙醇20L醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至 1000ml(无醇味)， 上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)， 依次用水20L、 20乙醇60L、 40乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收集40乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离 心过滤， 浓缩至35ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依次用水3L和体积浓度10甲醇水溶液 3L洗脱， 流速8mL/min，。
15、 收集体积浓度10甲醇水溶液洗脱部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出 无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲醇溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无 色结晶即为2-苯乙酰胺， 质量含量达到95以上。 0011 实施例2 0012 本发明在具体实施中， 一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是， 将炒 北葶苈子7.5kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至 260g的浸膏， 浸膏用体积浓度为80的乙醇19L醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至 无醇味， 上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附。
16、树脂)， 依次用水20L、 20乙醇 60L、 40乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收集40乙醇洗脱部位， 用水离散溶解， 离心过滤， 浓 缩至30ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依次用水3L和体积浓度10甲醇水溶液3L洗脱， 流 速8mL/min， 收集体积浓度10甲醇水溶液洗脱部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲醇溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为 2-苯乙酰胺， 质量含量达到95以上。 0013 实施例3 0014 本发明在具体实施中， 一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是， 。
17、将炒 北葶苈子8.5kg， 每次加10倍重量的水提取三次， 每次1.5h， 合并三次提取液， 减压浓缩至 280g的浸膏， 浸膏用体积浓度为80的乙醇21L醇沉2h， 弃沉淀， 将上清液离心过滤， 浓缩至 无醇味(约1000ml)， 上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)， 依次用水 20L、 20乙醇60L、 40乙醇60L洗脱， 流速20L/24h， 收集40乙醇洗脱部位， 用水离散溶 解， 离心过滤， 浓缩至40ml， 过Toyopearl HW-40色谱柱， 依次用水3L和体积浓度10甲醇水 溶液3L洗脱， 流速8mL/min， 收集体积浓度10甲醇水溶液洗脱。
18、部分， 用甲醇溶解， 静置24h， 析出无色结晶， 将上层溶液吸出， 无色结晶干燥， 再次用甲醇溶解， 静置24h， 如此反复5次， 得无色结晶即为2-苯乙酰胺， 质量含量达到95以上。 0015 实施例1-3所制备的无色结晶， 经液相色谱法测定， 鉴定为2-苯乙酰胺， 并经实验， 具有雌激素样作用， 有效用于制备治疗雌激素缺乏症药物， 并经实验得到了充分证明， 有关 资料如下： 0016 1仪器与材料 0017 核磁共振用Bruker AVANCE500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)， 红外光谱用 Nicolet is 10 Microscope Spectrometer(Ther。
19、mo Scientific,USA)， 高分辨质谱用 Bruker maxis HD mass spectrometer， 紫外光谱用Shimadzu UV-2401PC apparatus， 高效 液相色谱用Waters Alliance系列2695高效液相系统， 配备2998型二极管阵列检测器， 说明书 2/5 页 4 CN 107056644 A 4 Empower3色谱数据工作站， LC50型高压制备液相色谱仪， UV200型紫外检测器赛谱锐思(北 京)科技有限公司， YMC-PackODS-A色谱柱(25010mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)， 其 余有N-1100。
20、型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)， A-1000S型水流抽气机(上海爱朗仪器 有限公司)， N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)， FDU-2110型冷冻干燥机 (上海爱朗仪器有限公司)， DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)， AB204- N万分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)， iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)， 二氧化碳培养 箱(上海STIK)， 超净工作台(苏净集团)， Arium 611VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS)， 倒 置显微镜(Nikon)， PB-10酸度计(德国赛多利斯集团)。 0018 柱层。
21、析填料Diaion HP-20、 MCI Gel CHP-20(日本三菱化学公司)， Toyopearl HW- 40(日本TOSOH公司)， Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)， 柱层析所用硅胶H(160- 200目)为青岛海洋化工厂生产， 培养皿、 96孔培养板、 细胞冻存管(Corning公司)， 所用色谱 纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产， 所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化 学试剂厂生产。 去雌激素胎牛血清(广州四季青)； 无酚红DMEM高糖培养基、 葡聚糖-活性炭 去激素胎牛血清(Hyclone)； 17 -雌二醇(17 -estroge。
22、n， E2)、 氨苄青霉素、 Tris碱(Sigma)； 戊酸雌二醇片(拜耳医药)； EDTA、 MTT及DMSO(Amresco)； E2、 FSH、 LH ELISA试剂盒(R&D)。 0019 清洁级昆明种小鼠， 雌性， 出生21天(刚断乳)， 体重912g， 购于北京维通利华实 验动物技术有限公司(许可证号： SCXK(京)2016-0011)。 人乳腺癌细胞(MCF-7)购自中国医 学科学院基础医学研究所细胞资源中心。 0020 北葶苈子于2014年采自河南南阳， 经河南中医学院陈随清教授及董诚明教授鉴定 为十字花科植物独行菜LepidiumapetalumWilld.的干燥成熟种子。
23、。 0021 2实验药物 0022 本发明方法从炒北葶苈子中制备的2-苯乙酰胺。 0023 3实验方法 0024 3.1小鼠子宫增重实验 0025 将小鼠按体重均衡和随机的原则分组， 持续给药7天。 正常组每日蒸馏水0.02mL/g 灌胃； 阳性对照组隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃； 北葶苈子中提取2-苯乙酰胺按 0.5mg/10g/d， 配成混悬液， 每日按0.02mL/g灌胃。 最后一次给药24h后， 摘眼球取血， 脱颈椎 处死小鼠， 立即摘取子宫称重， 计算子宫系数(子宫湿重(体重)-1100)。 实验平行重复 三次。 结果与正常组相比， 计算P值， 考察有无统计学意义。
24、。 0026 3.2 MCF-7细胞增殖实验 0027 MCF-7细胞经含5去雌激素胎牛血清的无酚红DMEM培养基培养1周后， 选取对数 生长期细胞， PBS洗两次， 用0.05胰蛋白酶消化后， 加入无酚红DMEM培养基吹打均匀， 以2 104个/mL的浓度接种于96孔板内， 每孔培养总体积为200 L。 培养24h待细胞贴壁后， 换为 含北葶苈子中提取2-苯乙酰胺培养液(10 M)继续培养。 37、 5CO2培养48h后， 每孔加入 MTT溶液(5mg/mL)20 L， 37继续培养4h， 小心吸净培养液， 每孔加入150 LDMSO， 震荡5- 10min， 使紫色结晶完全溶解。 用酶标仪。
25、在490nm下测定各孔吸光度值(A)， 计算平均A值和细 胞活力。 实验平行重复三次。 0028 细胞活力各组OD值/正常组OD值 0029 3.3 ELISA法检测血清E2、 LH、 FSH 说明书 3/5 页 5 CN 107056644 A 5 0030 小鼠摘眼球取血， 血液室温静置1h后， 3000转离心10min， 取上清。 按照ELISA试剂 盒说明书仔细操作。 0031 4统计处理 0032实验数据以表示， 用SPSS 20.0统计软件处理数据， 采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)进行组间差异的比较， 以P0.05为差异有显著性意义， 以P0.01为差异有 极显。
26、著性意义。 0033 5实验结果 0034 5.1北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响 0035 与正常组相比， 北葶苈子中提取2-苯乙酰胺能显著诱导性未成熟雌性小鼠子宫系 数的增加(P0.05)。 提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体内具有雌激素样作用。 见表1。 0036表1北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响 0037 0038 注:与正常组比较， 表示P0.05， 表示P0.01。 0039 5.2北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对MCF-7细胞促增殖作用 0040 北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在10 M时与正常组比， 对MCF-7细胞有显著的促增殖 。
27、作用(P0.05)。 提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体外具有雌激素样作用。 见表2。 0041表2北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对MCF-7细胞增殖的影响 0042 0043 5.3北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对血清E2、 LH、 FSH的影响 0044 与正常组相比， 北葶苈子中提取2-苯乙酰胺能显著增加小鼠血清E2、 LH的水平， 但 基本不影响血清FSH的水平(P0.05)。 提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体具有雌激素样 作用， 可能与其增加体内E2以及LH的水平有关。 见表3。 0045表3北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对血清E2、 LH、 FSH的影响 说明书 4/5 页 6 CN 107。
28、056644 A 6 0046 0047 注:与正常组比较， 表示P0.05， 表示P0.01。 0048 子宫中含有大量的雌激素受体(ERs)， 雌激素类物质通过与该受体结合， 可诱导子 宫靶蛋白(IPs)含量增加， 表现为子宫组织增生等， 因此可以通过测定外源雌激素对性未成 熟小鼠子宫促增长作用来评价药物的雌激素样活性。 本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿 重与体重之比(子宫系数)作为评价雌激素样活性的指标。 实验结果表明， 从北葶苈子中提 取2-苯乙酰胺化合物可显著增加性未成熟小鼠子宫系数， 而北葶苈子生品不能显著增加性 未成熟小鼠子宫系数。 提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体内具有雌激素。
29、样作用。 0049 MCF-7细胞是雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株， 能特异地受雌激素或雌激素样 活性物质调节而增殖， 是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。 实验结果发现， 北葶苈子中 提取2-苯乙酰胺在浓度为10 M时对MCF-7细胞有显著的促增殖作用。 提示北葶苈子中提取 2-苯乙酰胺在体内、 体外均有一定的雌激素样作用。 0050 雌二醇是体内主要由卵巢成熟滤泡分泌的一种天然雌激素， 能促进和调节女性性 器官及副性征的正常发育。 促黄体生成素由垂体产生的一种激素在在女性中刺激卵巢分泌 女性雌激素。 卵泡刺激素是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素， 主要作用为促进卵泡成 熟， 促进整个卵巢长大。 研究发现， 北葶苈子中提取2-苯乙酰胺可以显著性增加未成熟雌性 小鼠的血清E2以及LH的水平， 但对FSH的影响不大。 推测北葶苈子中提取2-苯乙酰胺增加小 鼠子宫系数发挥雌激素样活性可能与其增加体内E2以及LH的水平有关。 0051 实验证明， 从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物作为唯一活性成分有效用于制备 雌激素药物， 实现2-苯乙酰胺作为唯一活性成分在制备雌激素药物中的应用， 开拓了制备 雌激素类药物的新途径， 提高了北葶苈子的药用价值和商业价值， 有良好的经济和社会效 益。 说明书 5/5 页 7 CN 107056644 A 7 。