技术领域
本发明涉及微生物领域中的一种酪丁酸梭菌及其培养方法与应用。
背景技术
近年来，抗生素的滥用，导致的各种危害已成为一个世界性难题。世界卫生组织宣 称：人类将面临无有效抗生素可用的“后抗生素时代”。在饲料中添加抗生素已经成为中国 人养殖的习惯，然而长期使用抗生素又会对畜禽造成严重的危害：第一，动物体内产生耐药 性细菌，抑制细胞免疫和体液免疫，严重损害动物机体免疫细胞功能，降低动物免疫力和抗 病力，甚至造成免疫失败；第二，饲料、添加剂、兽药中超量使用抗生素，会通过食物链进入 人体，使人们间接接触抗生素，导致人体患病时用抗生素治疗的效果消失，同时抗生素破坏 肠道微生物，影响动物对营养物质的消化能力和动物的生长性能；第三，某些抗生素本身存 在毒害作用，如链霉素、卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素等。鉴于滥用抗生素潜在的弊端和危 机，使致病菌产生耐药性，造成动物肠道菌群失调，免疫力下降，许多国家和地区都禁止或 限制在饲料中的添加。酪丁酸梭菌可以利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物， 发酵生产丁酸、维生素、氨基酸等益生因子；其中，丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复 主要营养物质。将酪丁酸梭菌添加到动物饲料具有替代抗生素预防和治疗相关动物疾病的 潜力，抑制内源性疾病的发生，且增强机体免疫和血液中白细胞（CD4+）的数量，以及改善动 物的生产性能和产品质量，减少抗生物用量，提高经济效率。
瘤胃作为反刍动物的消化器官，是迄今已知的、降解转化纤维素类物质效率最高 的天然体系，它依赖于瘤胃微生物群体的协同作用将天然纤维类物质快速降解转化成一系 列动物营养和能源物质。可以认为瘤胃是一个完美的、天然的秸秆纤维降解消化加工厂和 高效厌氧发酵罐。
目前报道的能产丁酸的菌有：丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、酪丁酸梭菌 （Clostridiumtyrobutyricum）、柔嫩梭菌（Clostridiumleptum）、球形梭菌（Clostridium coccoides）、人罗斯拜瑞氏菌（Roseburiahominis）、霍氏真杆菌（Eubacteriumhallii）、 直肠真杆菌（Eubacteriumrectale）、普氏栖粪杆菌（Faecalibacteriumprausnitzii）和 粪厌氧棒状菌（Anaerostipescaccae）。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种酪丁酸梭菌，该菌能够产生多种氨基酸、B族维生素 和维生素K，分泌淀粉酶、蛋白酶以及降解饲料的果胶酶、葡聚糖酶，合成益生因子丁酸。
本发明所提供的梭菌，被鉴定为酪丁酸梭菌，来源于牦牛瘤胃内容物。
所述酪丁酸梭菌，其分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428， 已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCCNO：M2016090，保藏 日期为：2016年3月7日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明所提供的酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428具有以下特征：
1）菌落特征：菌落直径为(0.5～1.7)×(2.4～7.6)μm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘 整齐，凸起，白色或乳白色。
2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞直径1.2-3.0 mm。
3）生理生化特征：厌氧生长；不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、木 糖、蔗糖、果糖和纤维二糖等糖类产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解 纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲 酸，硝酸盐还原试验均为阴性。
4）酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428的16SrRNA基因序列长度为 1,513bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
本发明的另一个目的是提供一种培养酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum） W428的方法。
本发明所提供的培养酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428的方法，是 将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428接种于RCM培养基，在35℃~37℃、pH6~ 8.5的条件下培养。
在1,000mL上述RCM培养基中含有：胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯 化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；余量为 水。
上述RCM培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量为0.5mg。
本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到 的，一般注入达到1个大气压的量。其中，最适培养温度为37℃，最适pH为7.0。
本发明所提供的酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428易培养，培养效 率高，可达4.5×109CFU/mL。
本发明的酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428是从牦牛的瘤胃中分离 得到的，是一种能够利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵，主要 发酵产物为丁酸和乙酸，是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。由于它 具有耐热耐酸及对常用抗生素有抗性等特点，在临床上广泛用于预防由大肠杆菌等病原 菌。因此本发明中的酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428在饲料添加剂产业和 益生因子丁酸的生产中有广阔的应用前景。
本发明所述的生物材料，其分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M2016090，保藏日期为：2016年3月7日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实验中所使用的RCM液体培养基的基本组成为（/升）：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可 溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
实验中所使用的RCM固体培养基是向上述RCM液体培养基中加入15g琼脂，使其终 浓度为1.5%。
实施例1、菌株酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428的分离制备
取牦牛瘤胃内容物，将其接种于以滤纸纤维素为底物的RCM液体培养基中传代培养，得 到富集物；用富集物作为接种源，将其接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基，用Hungate 滚管技术分离得到。
将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2016090。
实施例2、菌种鉴定
一、形态及生理生化特征
将菌株酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428接种于以葡萄糖为底物的RCM 固体培养基（含质量百分含量为1.5%的琼脂），在pH为7.0，温度为37℃的条件下厌氧培养 48h。
观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验：1革兰氏染色试验；2血 清蛋白试验；3液化明胶试验；4还原硝酸盐试验；5底物利用试验。
观察结果及实验结果如下：
1）菌落特征：菌落直径为(0.5～1.7)×(2.4～7.6)μm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘 整齐，凸起，白色或乳白色。
2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞直径1.2-3mm。
3）生理生化特征：厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；不水解明胶；不消化血清蛋白；， 能够发酵葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖和纤维二糖等糖类产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶， 水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有 少量的丙酸和甲酸；硝酸盐还原试验均为阴性。
二、菌株酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428的16SrRNA基因的PCR扩 增和序列测定
1）提取DNA（参照TAKARA提基因组试剂盒）
将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428接种于RCM液体培养基培养；取生长 至对数晚期的发酵液，12,000转/分钟离心5分钟，去除上清液；加入500μL的BufferBS重 悬细胞，加入50μL的Lysozyme（20mg/mL），充分吸打混匀，于37℃水浴温育1小时（每隔20 分钟颠倒混匀一次）；12,000rpm离心5分钟，弃上清；加入180μL的BufferGL、20μL的 ProteinaseK（20mg/mL）和10μL的RNaseA（10mg/mL），充分吸打混匀，于56℃水浴温育 10分钟；加入200μL的BufferGB和200μL的100%乙醇，充分混匀；将SpinColumn安装在 CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液；将500μL的 BufferWA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液；将700μL的BufferWB加 入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液，重复一次；将SpinColumn安置在 CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟；将SpinColumn安置在新的1.5mL离心管上， 在SpinColumn膜的中央处加入50~200μL的65℃灭菌蒸馏水，室温静置5分钟；12,000rpm 离心2分钟洗脱DNA
2）16SrRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-TTTAAATTGAGAGTTTGATCCTGGC-3’，反向引物为5’- AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGG-3’。PCR反应体系（25μL）为：Mix25μL；ddH2O8.5μL；正反 向引物各1μL；DNA模板2μL。PCR反应条件为：95℃5min，95℃1min，60℃30s，72 ℃2min，30个循环；72℃7min，4℃保存。
PCR产物的测序送至金唯智公司完成
测序结果表明，菌株酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428的16SrRNA基因 序列长度为1,513bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
将16SrRNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与 Clostridiumalgifaecis的16SrRNA基因序列的相似性为97%。
参照《Bergey’sManualofSystematicBacteriology》（第二版），根据其形态特 征和生理生化特征，以及根据其16SrRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株酪丁酸梭 菌W428被鉴定为新种酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）。
实施例3、酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428的培养
1）将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50mlRCM液 体培养基，在25℃，pH6.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可 溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（2.5±0.3）×109CFU/mL。
2）将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50ml RCM液体培养基，在35℃，pH6.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；果糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶 性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（3.4±0.2）×109CFU/mL。
3）将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50ml RCM液体培养基，在38℃，pH7.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；纤维二糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g； 可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过上海跃进医疗器械有限公司生产的YQX-I厌氧培养箱 得到的。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（4.3±0.7）×109CFU/mL。
4）将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50ml RCM液体培养基，在42℃，pH7.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；木聚糖和木糖中一种或两种，5g；氯化钠，5g；酵母膏， 3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容 至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（3.8±0.2）×109CFU/mL。
5）将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50ml RCM液体培养基，在45℃，pH8.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；蔗糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶 性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（2.4±0.6）×109CFU/mL。
6）将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50ml RCM液体培养基，在47℃，pH7.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可 溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1个大气压的量。
实验设三次重复，三次重复中菌体均不生长。
实验结果表明：菌株酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428厌氧生长，生 长温度从25℃-42℃，47℃不生长，最适生长温度35℃-37℃；pH生长范围6-8.5，最适 生长pH为6.5-7.0。在最适生长条件下，菌体浓度可达（4.3±0.7）×109CFU/mL。
实施例4、酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428中淀粉酶、蛋白酶的酶 活测定
一、制备酶液
将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428接种于RCM液体培养基，pH为7.0，培 养温度为37℃，培养2天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RCM培养基组成为（/升）：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可 溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1,000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1个大气压的量。
二、酶活测定
1）酶活测定反应体系（1,000mL）包括：反应底物溶于pH7.0的PBS缓冲液中，800μL； 酶液，200μL。反应温度为37℃，反应时间30min，采用高效液相色谱法测定产生的还原糖 量。
一个酶活力单位（1U）定义为每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
2）用上述酶活测定反应体系分别测定不同酶活，每个实验设三次重复：
A、淀粉酶：底物为麦芽糖，反应时间30min，三次重复平均测的酶活为2515.43U/mL。
B、蛋白酶：底物为酪蛋白，反应时间30min，三次重复平均测的酶活为93.72U/ mL。
实施例5、酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428生产丁酸
一、制备发酵液
将酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428接种于RCM液体培养基，pH为7.0，培 养温度为37℃，培养2天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RCM培养基组成为（/升）：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可 溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1,000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达 到1大气压的量。
二、纤维床固定化发酵产丁酸
连接好纤维床生物反应器系统装置后通30min无菌氮气以使系统达到厌氧状态。接 入100mL发酵液，搅拌转速控制在150r/min，温度设定37℃，用6mol/L的NaOH和3 mol/L的稀H2SO4控制pH在7.0。预培养48h后，菌体OD值达到8.0左右，打开蠕动泵，将 培养基经由软管泵入纤维床反应器内，泵的转速为30mL/min，维持循环36?48h，进行菌体 固定化培养，至发酵罐内的游离菌体浓度不再降低，取出所有的发酵液并更换新鲜的发酵 培养基（2L体系），提高泵的转速至100mL/min，开始进行固定化发酵动力学研究。
丁酸的终产量维持在45.4?53.92g/L之间。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种酪丁酸梭菌及其培养方法与应用
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1513
<212>RNA
<213>酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428
<400>1
tttaaattgagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaacacatgc60
aagtcgagcgatgaaaccccttcgggggtggattagcggcggacgggtgagtaacacgtg120
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