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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610017313.7 (22)申请日 2016.01.12 (71)申请人 山东理工大学 地址 255086 山东省淄博市高新技术开发 区高创园A座313室 (72)发明人 高政权李国强吴冠勋孟春晓 郭艳芸陈国强张瑞豪崔建乐 孙景涛肖潇付永平王苗苗 李贤博李邦高宇豪 (51)Int.Cl. C12P 23/00(2006.01) C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 一种利用植物生长调节剂6-BA诱导淡水普 通小球藻。
2、ZF藻株高效积累类胡萝 卜素的方法 (57)摘要 本发明提供一种利用植物生长调节剂6-BA 诱导淡水普通小球藻ZF藻株高效积累类胡萝 卜素 的方法， 其特征在于采用如下步骤： 1)制备藻液： 在232、 光强1900100lx、 光暗比为12h/ 12h的条件下， 采用1/4倍浓度BG11营养盐培养藻 细胞至对数生长期， 每141天添加1倍浓度BG11 营养盐， 每天摇藻31次； 2)积累类胡萝 卜素： 取 200mL对数生长期藻液置于300mL锥形瓶中， 然后 加入6-BA至10.05mg/L， 在上述相同条件下培 养141天， 诱导类胡萝 卜素快速积累。 本发明技 术成熟、 简单易行、 成。
3、本低廉、 高效无污染， 能短 时间内显著提高淡水普通小球藻ZF藻株类胡萝 卜 素产量。 权利要求书1页 说明书3页 CN 105803032 A 2016.07.27 CN 105803032 A 1.一种利用植物生长调节剂6-BA诱导淡水普通小球藻ZF藻株高效积累类胡萝 卜素的方 法， 其特征在于采用如下步骤： 1） 制备藻液： 在232、 光强1900100lx和光暗比为12h/12h的条件下， 采用1/4 倍浓度BG11培养基培养淡水普通小球藻ZF藻株细胞281天到对数生长期， 获得用于6-BA 诱导的藻液， 培养期间每141天加一次1倍浓度的BG11营养盐； 2） 积累类胡萝 卜素： 。
4、取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中， 然后加入6-BA至 工作浓度为10.05mg/L， 于1900100lx， 232进行诱导处理141天， 处理阶段每天 人工摇藻31次， 摇藻时间间隔为50.5小时， 诱导类胡萝 卜素在藻液中的快速积累。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105803032 A 2 一种利用植物生长调节剂6-BA诱导淡水普通小球藻ZF藻株高 效积累类胡萝 卜素的方法 技术领域 0001 本发明提供一种利用植物生长调节剂6-BA诱导淡水普通小球藻ZF藻株高效积累 类胡萝 卜素的方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 小球藻 （Chlorella） 。
5、是一种常见的水生单细胞藻类， 是绿藻门小球藻科中的一个 重要属， 生态分布广泛， 在海水和淡水中均有分布， 目前包括大约10个种， 其中最常见的是 普通小球藻(C .vulgaris )、 蛋白核小球藻(C .pyrenoidosa )和椭圆小球藻(C . ellipoidea)等。 小球藻细胞内含有丰富的蛋白质 （干重的50%） 、 必需氨基酸、 多糖、 脂类 （脂 肪酸积累的结果） 、 叶绿素、 类胡萝 卜素、 和维生素等等， 在保健食品、 水产养殖 （饲料添加 剂） 、 化妆品、 医药等领域内应用广泛， 国内外市场供不应求。 与美国、 日本、 以色列等国家相 比， 我国的小球藻工业化大规。
6、模培养水平相对滞后。 0003 类胡萝 卜素是广泛存在于动物、 高等植物、 真菌、 藻类中的的一类萜类化合物天然 色素。 所有类胡萝 卜素形式上都可由有11个共轭双键中间碳链的番茄红素(1ycopene)基础 结构通过氧化、 氢化、 脱氢、 环化以及碳架的重排、 降解而衍生。 类胡萝 卜素在生物体内具有 十分重要的生理功能， 它是植物光合作用的辅助色素， 在保护细胞免受强光、 活性氧和敏化 色素的有害影响中起着重要的作用。 同时， 类胡萝 卜素具有较高的医药价值， 通过摄食类胡 萝 卜素不仅可以预防眼病和心血管疾病的发生， 还可以增强人体的免疫功能， 具有抗癌、 抗 氧化、 抗衰老等功效。 因。
7、此， 类胡萝 卜素作为营养、 保健、 着色等多功能天然色素， 已广泛应用 于食品、 医药、 保健品、 饲料、 化妆品等工业领域。 植物生长调节剂在较低的浓度下即可高效 调控植物的生长发育和次生代谢物的种类与产量， 已经被广泛应用于高等植物尤其是农作 物生产上。 植物生长调节剂诱导具有操作简单、 诱导率高、 速度快、 造价低、 无污染、 安全性 强等诸多优点。 微藻是进行植物生长调节剂调控次生代谢的优良材料， 其结构简单、 生命周 期短、 光敏性强、 代谢过程极易受环境影响， 也容易被检测。 0004 目前， 国外内已经公开了一些关于制备、 提纯类胡萝 卜素工艺的相关技术， 大多数 是针对一些发。
8、酵、 提纯分离等技术改良的。 如青岛大学公布了一种利用海洋红酵母高产类 胡萝 卜素和铜发酵培养方法 （CN201510512641） ， 该发明的目的在于提供一株从海洋环境中 分离获得的既能高产类胡萝 卜素又能富集铜的海洋红酵母， 并提供其能够实现高产胡萝 卜素 并富集铜的最佳发酵培养条件， 为工业化生产提供理论依据。 具体的方法是： 优选的发酵培 养基组成为葡萄糖1、 酶解玉米粉1-3、 蛋白胨2.5、 硫酸镁0 .02、 磷酸二氢钾 0.15、 铜含量150-200mg/L、 氯化钠20、 其余为水； 初始pH为8， 接种量3-8， 摇床转速为 50-80r/min， 24-28培养10-。
9、15小时后调整温度为16-20进行低温静止培养， 停止搅拌， pH调整为3-5， 保持2-4小时； 之后阶梯形升温到24-30， pH调整为4.6-5.5， 按照2.5的添 加量添加蛋白胨， 按照2的量添加酵母粉； 摇床转速为50-100r/min， 继续发酵10-15h。 优 选的， 在低温静止培养阶段向培养基中添加培养基重量3-5wt的蛋氨酸螯和铜。 威海利达 说明书 1/3 页 3 CN 105803032 A 3 生物科技有限公司发明的一种提高类胡萝 卜素发酵产率的方法 （CN104846049A） ， 以胶红酵 母菌作为类胡萝 卜素发酵菌种， 按照接种量为2-10将所述胶红酵母接种至。
10、培养基中， 所 述培养基中包括： 葡萄糖12-130g/L、 酵母粉2-22g/L、 盐3-12g/L， 该培养基的pH在5.5-7.5 之间， 向所述培养基中添加亚铁离子溶剂， 所述亚铁离子溶剂的添加量为相对所述培养基 的摩尔浓度在0.05-0.5mmol/L之间， 发酵温度维持在27-33， 发酵32-40小时后， 摇床速 度140-200r/min， 将温度降至20-25继续发酵， 发酵24-46小时， 摇床速度80-140r/min。 四 川理 工学院 提供了一 种利 用光合 细菌微氧发酵快 速生 产类胡萝卜素的 方法 （CN104805168A） ， 将活化的光合细菌(Rhodoba。
11、ctersphaeroides)单菌落接种到MMS培养 基中， 好氧过夜培养获得种子； 然后按接种量为8将好氧过夜培养的种子分别接种到含有 MMS培养基的培养瓶中， 接种后培养液体积相当于培养瓶体积的40， 然后在转速为200 250rpm、 温度为3032、 黑暗条件下好氧发酵至OD600为0.6-0.8； 合并发酵液， 使发酵液 体积相当于培养瓶体积的80， 再在转速为140150rpm、 温度为30-32、 黑暗条件下微氧 发酵36小时。 中国农业大学郭仰东等发明了一种提高番茄果实中类胡萝 卜素含量的方法 （CN104686215A） ， 该方法主要利用不同浓度的褪黑素溶液对绿熟期番茄进。
12、行喷施处理， 从 而达到提高番茄中类胡萝 卜素的含量。 0005 上述相关提纯、 制备类胡萝 卜素工艺的相关专利技术虽然先进， 但有的存在被重金 属污染的可能， 如铜， 且发酵技术工艺相对复杂， 对生产设备要求高， 这无疑增加了生产成 本和技术推广难度。 它们并未涉及广泛应用于农作物农业生产的成熟技术植物生长调 剂诱导生长快、 易培养、 产量高、 养殖成本低廉的微藻类积累类胡萝 卜素的内容。 发明内容 0006 本发明提供一种本发明的目的是提供一种工艺简单、 速度快、 造价低、 无污染、 安 全性 强的利用植物生长调节剂6-BA诱导淡水普通小球藻ZF藻株高效积累类胡萝 卜素的方 法。 0007。
13、 其具体的技术方案为： 本发明提供一种利用植物生长调节剂6-BA诱导淡水普通小球藻ZF藻株高效积累类胡 萝 卜素的方法其特征在于采用如下步骤： 1） 制备藻液： 在232、 光强1900100lxlx和光暗比为12h/12h的条件下， 采用 1/4倍浓度BG11培养基培养淡水普通小球藻ZF藻株281天到对数生长期， 获得用于6-BA诱 导的藻液， 培养期间每141天加一次1倍浓度的BG11营养盐； 2） 积累类胡萝 卜素： 取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中， 然后加入6-BA至 工作浓度为10.05mg/L， 于1900100lx， 232进行诱导处理141天， 处理阶段每。
14、天 人工摇藻31次， 摇藻时间间隔为50.5小时， 诱导类胡萝 卜素在藻液中的快速积累。 0008 本发明与现有技术相比， 其优点是： 1、 简单易行， 原材料淡水普通小球藻ZF藻株细胞易培养， 周期短， 成本低， 抗逆性强， 植 物生长调节剂诱导技术成熟、 见效快、 无污染、 生产工艺简单、 产量高； 2、 短时间内能显著提高淡水普通小球藻ZF藻株细胞内类胡萝 卜素的生产效率， 研究表 明， 诱导处理后淡水普通小球藻ZF藻株细胞类胡罗素含量可达藻细胞干重的41.23% （是空 说明书 2/3 页 4 CN 105803032 A 4 白对照组藻细胞中类胡萝 卜素含量的2.8倍） ， 产量为3。
15、32.96mg/L藻液。 具体实施方式 0009 实施例1， 采用以下步骤： 1） 制备藻液： 在22、 光强2000lx和光暗比为12h/12h的条件下， 采用1/4倍浓度BG11 培养基培养淡水普通小球藻ZF藻株27天到对数生长期， 获得用于6-BA诱导的藻液， 培养期 间每14天加一次1倍浓度的BG11营养盐； 2） 积累类胡萝 卜素： 取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中， 然后加入北京索 莱宝科技有限公司生产的6-BA至工作浓度为0.95mg/L， 在2000lx， 24进行诱导处理14天， 处理阶段每天人工摇藻3次， 摇藻时间间隔为5小时， 诱导类胡萝 卜素在藻液中。
16、的快速积累。 0010 实施例2， 采用以下步骤： 1） 制备藻液： 在24、 光强1800 x和光暗比为12h/12h的条件下， 采用1/4倍浓度BG11培 养基培养淡水普通小球藻ZF藻株28天到对数生长期， 获得用于6-BA诱导的藻液， 培养期间 每14天加一次1倍浓度的BG11营养盐； 2） 积累类胡萝 卜素： 取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中， 然后加入北 京索莱宝科技有限公司生产的6-BA至工作浓度为1.05mg/L， 于1800 x23进行诱导处 理 15天， 处理阶段每天人工摇藻3次， 摇藻时间间隔5小时， 诱导类胡萝 卜素在藻液中的快 速积累。 0011 实。
17、验检测： 1） 富集藻细胞： 8000-9000rpm， 4离心5-8分钟， 得到澡泥， 再将藻泥在-40冷冻干 燥成藻粉； 2） 转移到90%的丙酮溶液中黑暗条件下， 4抽提24h后， 测定663.6， 646.6和470nm 的消光值。 0012 3） 根据以下公式计算分析： 4） 计算结果为： 实施例1所得类胡罗素含量为藻细胞干重的41.19% （是空白对照组藻细胞中类胡萝 卜素 含量的2.7倍） ， 产量可达331.85mg/L藻液； 实施例2所得类胡罗素含量分别可达藻细胞干重的41.23% （是空白对照组藻细胞中类 胡萝 卜素含量的2.8倍） ， 产量为332.96mg/L藻液。 说明书 3/3 页 5 CN 105803032 A 5 。