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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610197991.6 (22)申请日 2016.03.31 C12N 11/14(2006.01) C12N 9/38(2006.01) A23C 9/12(2006.01) (71)申请人 常州市奥普泰科光电有限公司 地址 213155 江苏省常州市新北区罗溪镇旺 财路 10 号 (72)发明人 陈毅忠 张明 林茂平 (54) 发明名称 一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用固定化乳糖酶制备无 乳糖乳制品的方法， 属于无乳糖乳制品制备技术 领域。本发明通过脆壁克鲁维酵母菌发酵培养制 得。
2、粗酶液， 经盐析、 脱盐制得纯化乳糖酶， 将其用 戊二醛交联固定在凹凸棒土上， 制得固定化乳糖 酶， 再将其用于原料乳的酶解中， 从而得到利用固 定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法。 实例证明， 本发明操作简便， 不仅利用固定化乳糖酶提高了 酶的稳定性， 降低了发酵乳中乳糖的含量， 达到了 国家规定的无乳糖标准， 而且制得的无乳糖发酵 乳产品口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸收， 适 合大规模生产应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105713891 A 2016.06.29 CN 105713891 A。
3、 1.一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法， 其特征在于具体制备步骤为： （1） 按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上， 移入恒温箱中于30 35下培养34天后， 用棉签刮下孢子移入200300mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水 中， 放置在漩涡振荡仪中， 以3040W功率振荡分散3040min制得孢子悬液， 通过灭菌后的 漏斗过滤， 得孢子； （2） 再按11042104个/mL的接种量， 将上述所得的孢子转接于发酵培养基中， 于25 35条件下培养78天后过滤， 得到发酵液， 再用双层滤纸抽滤去除多余孢子， 即得粗酶 液； （3） 量取300400mL得到的粗酶液。
4、， 向里加入1012g硫酸铵， 于46的冰水浴中静 置盐析1214h后用高速离心机以1000012000r/min转速离心分离得到沉淀， 最后用pH为 5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即得纯化乳糖酶， 备用； （4） 称取100200g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛， 分别用浓度为0.1mol/L盐 酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍1012h， 再放入马弗炉于300400下煅烧3 4h， 得固定化酶载体； （5） 称取1020g固定化酶载体装入1L锥形瓶中， 加入400500mLpH为7.0由磷酸氢二 钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液， 静置1012h后， 再加入12g备用。
5、的纯化乳糖酶， 移入 46冰水浴中， 用磁力搅拌机以300400r/min转速进行搅拌； （6） 在搅拌的过程中再加入5060mL质量浓度为2%戊二醛溶液， 升高水浴温度至30 35， 继续搅拌交联反应46h后， 过滤得滤渣， 移入布氏漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反 复抽滤洗涤35遍后， 即得固定化乳糖酶； （7） 称取12L原料乳、 12g果胶、 35g木糖醇和23g上述制得的固定化乳糖酶混合 均匀后倒入酶解罐， 设置酶解温度为3540， 保温酶解1012h后， 过滤回收固定化乳糖 酶， 将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。 2.根据权利要求1所述的一种。
6、利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法， 其特征在 于： 所述的马铃薯培养基是由200300g马铃薯、 2030g葡萄糖、 1520g琼脂和1L蒸馏水 复配制得。 3.根据权利要求1所述的一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法， 其特征在 于： 所述的发酵培养基是由510g果胶、 2030g玉米、 1520g豆粕粉、 23g硝酸铵、 10 12g磷酸氢二钾和1L蒸馏水复配制得。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105713891 A 2 一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法 技术领域 0001 本发明公开了一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法， 属于无乳糖乳制 品制备技术领域。
7、。 背景技术 0002 无乳糖是指用某种工艺 （乳糖酶） 去除了奶中的乳糖， 乳糖酶分泌过少的人应该食 用无乳糖的奶制品。 0003 乳糖是动物乳汁中一种特有双糖， 不能被人体直接吸收， 必须经过乳糖酶水解成 半乳糖和葡萄糖， 而亚洲人由于没有日常饮用乳的习惯， 很大一部分人群体内缺乏乳糖酶， 喝牛奶后的典型表现是拉肚子， 即乳糖不耐症。 另外发酵乳在发酵的过程中， 虽然一部分乳 糖被分解， 但是还有一定量的乳糖残留， 乳糖不耐症严重者饮食发酵乳也会发生不适反应， 同时， 未有症状的乳糖不耐症患者， 对发酵乳营养的吸收也大打折扣。 因此， 研发一种低乳 糖甚至无乳糖的发酵乳具有重要的意义。 0。
8、004 目前传统方法在制备无乳糖乳制品时， 采用将乳糖酶加入鲜牛奶中将乳糖水解为 葡糖糖和半乳糖， 然后再接种发酵剂制得发酵乳， 或者是将乳糖酶加入牛奶中并同时接种 发酵剂制得低乳糖发酵乳， 虽然该方法降低了发酵乳中乳糖的含量， 但乳糖含量降低仍未 达到国标规定的无乳糖限量， 对乳糖不耐症患者严重的人仍然不适用， 而且由于酸奶发酵 过程中pH会持续降低， 在中性奶中适用的乳糖酶在发酵阶段酶活性会降低甚至失效， 导致 酶解效率大幅降低， 即使在配料过程中加大乳糖酶的使用量也无法制得国标限定的无乳糖 发酵乳。 0005 除此以外， 目前乳糖酶并未在中国食品和乳制品工业中得到广泛的应用， 主要原 因。
9、是：（1） 乳糖酶的单位产量较低；（2） 市场上销售的乳糖酶多为胞内酶， 酶的耐热性差、 适 用范围窄， 且这种酵母来源的胞胞内酶， 需破碎细胞才能得到， 提取、 纯化工艺繁杂， 另外生 活中适用的乳糖酶往往为游离酶， 不仅成本高、 适用范围窄， 而且不能满足食品和乳制品工 业多方面的需要。 发明内容 0006 本发明主要解决的技术问题： 针对目前在制备无乳糖乳制品的过程中， 往往使用 游离的乳糖酶对原料乳进行酶解， 导致在发酵阶段酶活性会降低甚至失效， 酶解效率大幅 度降低， 即使加大乳糖酶的使用量也无法制得国标限定的无乳糖发酵乳的现状， 提供了一 种通过脆壁克鲁维酵母菌发酵培养制得粗酶液，。
10、 经盐析、 脱盐制得纯化乳糖酶， 将其用戊二 醛交联固定在凹凸棒土上， 制得固定化乳糖酶， 再将其用于原料乳的酶解中， 从而得到利用 固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法。 该方法操作简便， 不仅利用固定化乳糖酶提高了 酶的稳定性， 降低了发酵乳中乳糖的含量， 达到了国家规定的无乳糖标准， 而且制得的无乳 糖发酵乳产品口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸收， 适合大规模生产应用。 0007 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是： 说明书 1/5 页 3 CN 105713891 A 3 （1） 按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上， 移入恒温箱中于30 35下培养3。
11、4天， 用棉签刮下孢子移入200300mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中， 放置在漩涡振荡仪中， 以3040W功率振荡分散3040min制得孢子悬液， 通过灭菌后的漏 斗过滤， 得孢子； （2） 再按11042104个/mL的接种量， 将上述所得的孢子转接于发酵培养基中， 于 2535条件下培养78天后过滤， 得到发酵液， 再用双层滤纸抽滤去除多余孢子， 即得粗 酶液； （3） 量取300400mL得到的粗酶液， 向里加入1012g硫酸铵， 于46的冰水浴中静 置盐析1214h后用高速离心机以1000012000r/min转速离心分离得到沉淀， 最后用pH为 5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤。
12、脱盐后即得纯化乳糖酶， 备用； （4） 称取100200g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛， 分别用浓度为0.1mol/L盐 酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍1012h， 再放入马弗炉于300400下煅烧3 4h， 得固定化酶载体； （5） 称取1020g固定化酶载体装入1L锥形瓶中， 加入400500mLpH为7.0由磷酸氢二 钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液， 静置1012h后， 再加入12g备用的纯化乳糖酶， 移入 46冰水浴中， 用磁力搅拌机以300400r/min转速进行搅拌； （6） 在搅拌的过程中再加入5060mL质量浓度为2%戊二醛溶液， 升高水浴温度至30 35。
13、， 继续搅拌交联反应46h后， 过滤得滤渣， 移入布氏漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反复 抽滤洗涤35遍后， 即得固定化乳糖酶； （7） 称取12L原料乳、 12g果胶、 35g木糖醇和23g上述制得的固定化乳糖酶混合 均匀后倒入酶解罐， 设置酶解温度为3540， 保温酶解1012h后， 过滤回收固定化乳糖 酶， 将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。 0008 所述的马铃薯培养基是由200300g马铃薯、 2030g葡萄糖、 1520g琼脂和1L蒸 馏水复配制得。 0009 所述的发酵培养基是由510g果胶、 2030g玉米、 1520g豆粕粉、 23g硝酸。
14、铵、 1012g磷酸氢二钾和1L蒸馏水复配制得。 0010 本发明的应用方法是： 本发明利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品无需冷藏， 早上食用早餐时， 饮用200300mL本发明制得的无乳糖乳制品， 连续坚持食用2025天， 可 明显感觉人体抵抗力得到提高， 睡眠得到改善， 且口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸收。 0011 本发明的有益效果是： （1） 本发明方法独特新颖， 利用固定化乳糖酶代替传统游离乳糖酶， 不仅提高了酶的稳 定性， 降低了发酵乳中乳糖的含量， 而且使得制得的无乳糖乳制品达到了国家规定的无乳 糖标准； （2） 本发明制得的无乳糖乳制品口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸。
15、收， 具有较好的市 场前景， 可大规模生产应用。 具体实施方式 0012 首先按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上， 移入恒温箱中 于3035下培养34天， 用棉签刮下孢子移入200300mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐 说明书 2/5 页 4 CN 105713891 A 4 水中， 放置在漩涡振荡仪中， 以3040W功率振荡分散3040min制得孢子悬液， 通过灭菌后 的漏斗过滤， 得孢子； 然后再按11042104个/mL的接种量， 将上述所得的孢子转接于发 酵培养基中， 于2535条件下培养78天后过滤， 得到发酵液， 再用双层滤纸抽滤去除多 余孢子， 即得粗酶液；。
16、 接下来量取300400mL得到的粗酶液， 向里加入1012g硫酸铵， 于4 6的冰水浴中静置盐析1214h后用高速离心机以1000012000r/min转速离心分离得 到沉淀， 最后用pH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即得纯化乳糖酶， 备用； 之后称 取100200g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛， 分别用浓度为0 .1mol/L盐酸和 0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍1012h， 再放入马弗炉于300400下煅烧34h， 得固定化酶载体； 随后称取1020g固定化酶载体装入1L锥形瓶中， 加入400500mLpH为 7.0由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液， 静。
17、置1012h后， 再加入12g备用的纯 化乳糖酶， 移入46冰水浴中， 用磁力搅拌机以300400r/min转速进行搅拌； 在搅拌的 过程中再加入5060mL质量浓度为2%戊二醛溶液， 升高水浴温度至3035， 继续搅拌交 联反应46h后， 过滤得滤渣， 移入布氏漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反复抽滤洗涤35遍 后， 即得固定化乳糖酶； 最后称取12L原料乳、 12g果胶、 35g木糖醇和23g上述制得 的固定化乳糖酶混合均匀后倒入酶解罐， 设置酶解温度为3540， 保温酶解1012h后， 过滤回收固定化乳糖酶， 将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得利用固定化乳糖酶制备 的无乳糖乳制品。 其中。
18、所述的马铃薯培养基是由200300g马铃薯、 2030g葡萄糖、 15 20g琼脂和1L蒸馏水复配制得， 所述的发酵培养基是由510g果胶、 2030g玉米、 1520g 豆粕粉、 23g硝酸铵、 1012g磷酸氢二钾和1L蒸馏水复配制得。 0013 实例1 首先按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上， 移入恒温箱中于30 下培养3天， 用棉签刮下孢子移入200mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中， 放置在漩涡 振荡仪中， 以30W功率振荡分散30min制得孢子悬液， 通过灭菌后的漏斗过滤， 得孢子； 然后 再按1104个/mL的接种量， 将上述所得的孢子转接于发酵培养基中，。
19、 于25条件下培养7 天后过滤， 得到发酵液， 再用双层滤纸抽滤去除多余孢子， 即得粗酶液； 接下来量取300mL得 到的粗酶液， 向里加入10g硫酸铵， 于4的冰水浴中静置盐析12h后用高速离心机以 10000r/min转速离心分离得到沉淀， 最后用pH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即 得纯化乳糖酶， 备用； 之后称取100g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛， 分别用浓度为 0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍10h， 再放入马弗炉于300下煅烧 3h， 得固定化酶载体； 随后称取10g固定化酶载体装入1L锥形瓶中， 加入400mLpH为7.0由磷 酸氢。
20、二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液， 静置10h后， 再加入1g备用的纯化乳糖酶， 移入4 冰水浴中， 用磁力搅拌机以300r/min转速进行搅拌； 在搅拌的过程中再加入50mL质量浓 度为2%戊二醛溶液， 升高水浴温度至30， 继续搅拌交联反应4h后， 过滤得滤渣， 移入布氏 漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反复抽滤洗涤3遍后， 即得固定化乳糖酶； 最后称取1L原料乳、 1g果胶、 3g木糖醇和2g上述制得的固定化乳糖酶混合均匀后倒入酶解罐， 设置酶解温度为 35， 保温酶解10h后， 过滤回收固定化乳糖酶， 将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得 利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。 其中所述的。
21、马铃薯培养基是由200g马铃薯、 20g葡 萄糖、 15g琼脂和1L蒸馏水复配制得， 所述的发酵培养基是由5g果胶、 20g玉米、 15g豆粕粉、 2g硝酸铵、 10g磷酸氢二钾和1L蒸馏水复配制得。 说明书 3/5 页 5 CN 105713891 A 5 0014 本实例操作简单易行， 本发明利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品无需冷藏， 早上食用早餐时， 饮用200mL本发明制得的无乳糖乳制品， 连续坚持食用20天， 可明显感觉 人体抵抗力得到了提高， 睡眠得到了改善， 且口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸收。 0015 实例2 首先按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上。
22、， 移入恒温箱中于33 下培养3.5天， 用棉签刮下孢子移入250mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中， 放置在漩 涡振荡仪中， 以35W功率振荡分散35min制得孢子悬液， 通过灭菌后的漏斗过滤， 得孢子； 然 后再按1.5104个/mL的接种量， 将上述所得的孢子转接于发酵培养基中， 于30条件下培 养7.5天后过滤， 得到发酵液， 再用双层滤纸抽滤去除多余孢子， 即得粗酶液； 接下来量取 350mL得到的粗酶液， 向里加入11g硫酸铵， 于5的冰水浴中静置盐析13h后用高速离心机 以11000r/min转速离心分离得到沉淀， 最后用pH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后 即得纯化乳。
23、糖酶， 备用； 之后称取150g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛， 分别用浓度 为0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍11h， 再放入马弗炉于350下煅烧 3.5h， 得固定化酶载体； 随后称取15g固定化酶载体装入1L锥形瓶中， 加入450mLpH为7.0由 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液， 静置11h后， 再加入1.5g备用的纯化乳糖酶， 移入5冰水浴中， 用磁力搅拌机以350r/min转速进行搅拌； 在搅拌的过程中再加入55mL质 量浓度为2%戊二醛溶液， 升高水浴温度至33， 继续搅拌交联反应5h后， 过滤得滤渣， 移入 布氏漏斗中用pH为7.0磷。
24、酸缓冲液反复抽滤洗涤7遍后， 即得固定化乳糖酶； 最后称取1.5L 原料乳、 1.5g果胶、 4g木糖醇和2.5g上述制得的固定化乳糖酶混合均匀后倒入酶解罐， 设置 酶解温度为38， 保温酶解11h后， 过滤回收固定化乳糖酶， 将得到的酶解乳制品瞬时高温 灭菌后即得利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。 其中所述的马铃薯培养基是由250g马 铃薯、 25g葡萄糖、 18g琼脂和1L蒸馏水复配制得， 所述的发酵培养基是由8g果胶、 25g玉米、 18g豆粕粉、 2.5g硝酸铵、 11g磷酸氢二钾和1L蒸馏水复配制得。 0016 本实例操作简单易行， 本发明利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品无需冷藏。
25、， 早上食用早餐时， 饮用250mL本发明制得的无乳糖乳制品， 连续坚持食用23天， 可明显感觉 人体抵抗力得到了提高， 睡眠得到了改善， 且口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸收。 0017 实例3 首先按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上， 移入恒温箱中于35 下培养4天， 用棉签刮下孢子移入300mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中， 放置在漩涡 振荡仪中， 以40W功率振荡分散40min制得孢子悬液， 通过灭菌后的漏斗过滤， 得孢子； 然后 再按2104个/mL的接种量， 将上述所得的孢子转接于发酵培养基中， 于35条件下培养8 天后过滤， 得到发酵液， 再用双层滤。
26、纸抽滤去除多余孢子， 即得粗酶液； 接下来量取400mL得 到的粗酶液， 向里加入12g硫酸铵， 于6的冰水浴中静置盐析14h后用高速离心机以 12000r/min转速离心分离得到沉淀， 最后用pH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即 得纯化乳糖酶， 备用； 之后称取200g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛， 分别用浓度为 0.1mol/L盐酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍12h， 再放入马弗炉于400下煅烧 4h， 得固定化酶载体； 随后称取20g固定化酶载体装入1L锥形瓶中， 加入500mLpH为7.0由磷 酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液， 静置12h后， 再加入。
27、2g备用的纯化乳糖酶， 移入6 冰水浴中， 用磁力搅拌机以350r/min转速进行搅拌； 在搅拌的过程中再加入60mL质量浓 说明书 4/5 页 6 CN 105713891 A 6 度为2%戊二醛溶液， 升高水浴温度至35， 继续搅拌交联反应6h后， 过滤得滤渣， 移入布氏 漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反复抽滤洗涤5遍后， 即得固定化乳糖酶； 最后称取2L原料乳、 2g果胶、 5g木糖醇和3g上述制得的固定化乳糖酶混合均匀后倒入酶解罐， 设置酶解温度为 40， 保温酶解12h后， 过滤回收固定化乳糖酶， 将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得 利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。 其中所述的马铃薯培养基是由300g马铃薯、 30g葡 萄糖、 20g琼脂和1L蒸馏水复配制得， 所述的发酵培养基是由10g果胶、 30g玉米、 20g豆粕粉、 3g硝酸铵、 12g磷酸氢二钾和1L蒸馏水复配制得。 0018 本实例操作简单易行， 本发明利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品无需冷藏， 早上食用早餐时， 饮用300mL本发明制得的无乳糖乳制品， 连续坚持食用25天， 可明显感觉 人体抵抗力得到了提高， 睡眠得到了改善， 且口味极佳、 营养丰富， 容易被人体吸收。 说明书 5/5 页 7 CN 105713891 A 7 。